GSK-3β對BMSC生物學性能調節(jié)機制的研究進展*

黃潤語 楊文悅 劉加強

糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β），是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與眾多相關的信號通路［1］。在干細胞中，調控GSK-3β能影響神經細胞發(fā)育［2］、心肌缺血損傷［3］等重要生命進程。GSK-3β也參與骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）的骨生成性能的調控，影響細胞成骨向分化、細胞歸巢和細胞增殖等重要環(huán)節(jié)。BMSC因具有低免疫源性、多向分化能力和較強的增殖能力，被認為是骨組織工程技術中種子細胞的理想選擇。近年來，關于GSK-3β對BMSC骨生成性能的調節(jié)機制的研究越來越多，以期為解決臨床問題提供新方法。故本文結合文獻就GSK-3β對BMSC生物學性能調節(jié)機制的研究進展作一綜述。

1.GSK-3β的性質

GSK-3β為一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）家族。GSK-3最早由于參與糖原代謝和胰島素信號通路而被廣泛研究，現今對于它的認知更加完善，已知GSK-3參與糖原代謝、細胞增殖、細胞凋亡等多種生理過程［4］。在哺乳動物中，GSK-3存在兩種同工型，GSK-3α與GSK-3β。它們的激酶結構域高度同源，但在N端與C端存在差異［5］。目前對GSK-3α的研究較少，而GSK-3β因其在經典Wnt通路、磷脂?；?-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidyl-inositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt）通路和Notch通路等有關細胞增殖和分化的通路上而受到關注［6］。GSK-3β的底物數量龐大，對這些底物位于C端的氨基酸殘基進行預磷酸化處理后GSK-3β才可識別它們［7］。

GSK-3β的活性主要取決于激活位點酪氨酸-216（Tyr-216）與失活位點色氨酸-9（Ser-9）之間磷酸化水平的平衡。在BMSC遷移過程中，基質細胞衍生因子-1（stromal derived factor-1，SDF-1）和細胞膜趨化因子受體4（C-X-C motif receptor 4，CXCR4）能夠通過PI3K/Akt信號通路使N端的Ser-9磷酸化從而失活GSK-3β，激活下游調控因子，促進細胞遷移。此外，GSK-3β還存在其他的磷酸化位點能夠調控其自身活性，例如p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）磷酸化蘇氨酸-390（Thr-390）后，能使GSK-3β活性下降并激活靶基因Wnt。除磷酸化調控之外，GSK-3β的活性還受蛋白復合物結合、底物特異性、亞細胞定位以及蛋白酶切割等多種過程的影響［8］。

2.GSK-3β對BMSC生物學性能的調節(jié)機制

2.1 GSK-3β與 歸 巢GSK-3β所 在 的SDF-1/CXCR4/GSK-3β/β-catenin信號通路與自體BMSC歸巢有關［9，10］。BMSC表面高度表達的CXCR4，能與損傷或缺血的組織釋放的SDF-1結合，活化P13K/Akt信號通路而增加BMSC的遷移［11］?；罨腁kt能磷酸化GSK-3β，從而阻礙GSK-3β與β-catenin形成復合物，使得胞質內β-catenin含量增多，最終導致細胞增殖能力增加和促進細胞歸巢［12］。

抑制GSK-3β能明顯提升MSC的遷移能力。用氯化鋰直接降低細胞中GSK-3β活性，會引起基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表達增多［13］。MMP-9能降解細胞外基質而提升移動性能［14］。Kim YS等學者的體外擴增研究中發(fā)現，在GSK-3β下調時，Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子7（Rho guanine nucleotide exchange factor 7，ARHGEF7，又稱為β-PIX）和CXCR4增多，從而推測GSK-3β通過β-catenin/c-Raf/ERK/β-PIX通路參與hBM-MSC遷移［15］，而GSK-3β調控CXCR4/SDF-1軸的機制仍有待研究。在小鼠大腦中，敲減β-PIX的MSC的遷移水平明顯降低，顯示β-PIX會影響MSC遷移［16］。

在細胞缺乏GSK-3β時，細胞遷移會以低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1alpha，HIF-1α）依賴的方式進行。在Flügel D等學者的研究中，GSK-3β-/-細胞在遷移水平上明顯高于GSK-3β+/+細胞。并且，由于轉染shRNA抑制HIF-1α后，GSK-3β-/-在遷移水平上的變化消失，可知細胞的遷移離不開HIF-1α的調控［17］。Udartseva OO等學者在低劑量光動力療法（photodynamic therapy，PDT）提升MSC的成血管潛能研究中，也證實了GSK-3β下調和MSC所分泌的多種不同的促血管生成因子增多（例如VEGF-A、MMP-9、IL-8、PAI-1等）以及MSC遷移能力提高的相關性［18］。

2.2 GSK-3β與增殖 在骨生成過程中，BMSC在微環(huán)境中的存活和增殖能力決定了修復速度和愈合效果。GSK-3β被鋰及其他特異抑制劑致失活后，BMSC增殖能力提高［19］。若使用β-catenin/T細胞轉錄因子（T cell transcription factor，TCF）通路抑制劑或小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制β-catenin，這種變化會消失。故GSK-3β依賴的經典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路介導了MSC的增殖過程。在此通路中，失活的GSK-3β解除對β-catenin的抑制作用，β-catenin入核與TCF/淋巴增強因子（lymphoid enhancer binding factor，LEF）結合，激活靶基因，例如c-Myc和cyclin D1，從而影響細胞增殖［20］。

c-Myc的表達水平與細胞增殖緊密相連，在不同細胞中存在促增殖或抑增殖的雙重作用。Svitlana等人的研究證實了MSC中c-Myc的表達能夠提高細胞增殖水平［21］。其主要通過調控編碼細胞周期正向或負向調節(jié)蛋白的靶基因而影響細胞周期進程。通過轉染或逆轉錄使c-Myc強制表達后，靜止細胞進入細胞周期；而c-Myc的下調或失活會使細胞周期進程受阻［22］。Gregory等人的研究也顯示了用鋰抑制GSK-3β的活性后，c-Myc的穩(wěn)定性增加，其在N端的Thr-58位點的磷酸化受抑，進一步印證了GSK-3β對c-Myc水平的負向調控作用c-Myc的表達水平在胞內受到精細調控，GSK-3β也參與其中［23］。靜息狀態(tài)下，c-Myc的Thr-58位點被GSK-3β磷酸化，促使c-Myc經泛素途徑迅速蛋白酶解；而當細胞受到絲裂原刺激后，c-Myc合成增加的同時，Ras被激活，經Ras/Raf/MEK/ERK途徑，最終ERK介導c-Myc的Ser-62位點的磷酸化以使c-Myc在胞內水平保持穩(wěn)定。此外，Ras激活后也能通過PI3K/Akt途徑抑制GSK-3β對Thr-58的磷酸化作用，c-Myc蛋白酶解減少，進一步增加并穩(wěn)定其在胞內的水平，從而發(fā)揮上述對細胞周期的推進作用。

細胞受絲裂原刺激后，cyclin D1作為調節(jié)亞基與周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin dependent kinases 4/6，CDK4/6）結合形成復合體，介導Rb蛋白（retinoblastoma protein，Rb protein）磷酸化，最終釋放轉錄因子E2F。E2F誘導靶基因表達，使細胞通過限制點進入S期。GSK-3β被抑制劑致失活后，cyclin D1表達水平及S期細胞比例顯著增高［20］。GSK-3β一方面如上文所述在經典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路中調控cyclin D1基因的表達，另一方面能夠直接磷酸化cyclin D1而使其降解。Diehl等人的研究顯示GSK-3β能夠特異性磷酸化cyclin D1的Thr-286位點，致使核輸出蛋白1（exportin 1，XPO1）介導cyclin D1出核而重新定位至胞質，進入蛋白酶解途徑。因此，細胞周期中cyclin D1的磷酸化與其亞細胞定位是通過GSK-3β聯系在一起的［24］。但與之相矛盾的是，也有研究顯示通過特異性抑制劑使GSK-3β失活后，cyclin D1在Thr-286的磷酸化水平未受影響［25］。由此，關于GSK-3β對cyclin D1的磷酸化作用目前尚無定論，有待進一步研究。

2.3 GSK-3β與凋亡GSK-3β主要通過活化促凋亡轉錄因子來促進BMSC的凋亡。結合上文可以得出，在骨生成過程中，調節(jié)GSK-3β的活性水平能影響B(tài)MSC的數量和效能。

以Bcl-2蛋白中的促凋亡轉錄因子Bax為例，GSK-3β能夠通過直接磷酸化活化Bax，而當Bax的被磷酸化區(qū)域發(fā)生突變，則不能完成線粒體轉運，從而其構象無法轉變至活化狀態(tài)［26］。

以促凋亡轉錄因子p53為例，有研究認為GSK-3β對凋亡有促進作用。其機制為GSK-3β能夠直接磷酸化p53的33位絲氨酸并介導p53的315和376位絲氨酸的磷酸化過程，并且除了這種直接作用，GSK-3β還能通過磷酸化p53特定的E3泛素連接酶MDM2以調節(jié)p53的水平，阻礙p53與MDM2的相互作用，從而抑制MDM2介導的泛素化，減少p53的蛋白酶解［27］，激活p53介導的凋亡途徑。但也有研究認為GSK-3β能夠抑制p53的活化，對凋亡有抑制作用。其機制為GSK-3β能夠負反饋調控其下游的信號分子β-catenin，在GSK-3β水平較低時，β-catenin則會大量表達，由此通過阻斷MDM2依賴以及非MDM2依賴的細胞退行性變途徑來增加p53的基礎水平。但是高水平的GSK-3β則有相反作用［28］。

以上關于GSK-3β與p53對于凋亡作用的研究角度不同，得到的結果也不同。p53與GSK-3β之間的關系顯然還需要多角度的研究以獲得更深入、更全面的理解。

此外，在NF-κB信號途徑中，GSK-3β則是一種促生存激酶。研究發(fā)現，純合性缺失GSK-3β的小鼠由于促凋亡信號TNF而導致肝功能損傷，最終在E13.5之前死亡。這顯示了GSK-3β能夠抑制一種TNF依賴的細胞凋亡途徑［29］。

2.4 GSK-3β與成骨分化和成軟骨分化GSK-3β可通過多個途徑影響與骨生成相關的細胞的分化，如BMSC的成骨方向分化、成骨細胞系的成骨方向分化和BMSC的成軟骨方向分化等。前二者主要由Wnt/β-catenin通路調控，后者則涉及NF-κB信號通路。

抑制GSK-3β能促進擁有成骨分化潛能和成脂分化潛能的間充質祖細胞分化為成骨細胞［30］。Wnt/β-catenin通路中，GSK-3β表達下調或GSK-3β磷酸化失活會使β-catenin因降解減少而濃度增加，穩(wěn)定的β-catenin進入細胞核，激活靶基因，促進BMSC的成骨向分化。GSK-3β可弱化Runx2和Osterix的表達，負向調控BMSC的成骨分化［31］。Runx2高表達于創(chuàng)傷愈合早期，能在早期促進BMSC成骨分化，而在晚期抑制分化［32］；Osterix則是成骨細胞特異性轉錄因子，在BMSC向成骨方向分化中起決定性作用。

此外，抑制GSK-3β還能促進BMSC的成軟骨分化。有學者利用白介素-1β（IL-1β）刺激誘導炎癥環(huán)境，并采用氯化鋰抑制GSK-3β，研究此時BMSC的成軟骨分化情況，發(fā)現在GSK-3β信號受抑制的情況下，NF-κB蛋白的磷酸化水平和入核能力降低，從而抑制了NF-κB通路，進而增強了BMSC在IL-1β誘導炎性環(huán)境下的成軟骨能力［33］。

3.小結

GSK-3β為一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在BMSC的歸巢、增殖、凋亡和成骨向分化等環(huán)節(jié)中，為參與相關信號通路的重要蛋白，其所在的經典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路是最關鍵的通路，可通過調控c-Myc、cyclin D1、Bax和p53影響細胞活性，而Runx2和Osterix等Wnt/β-catenin/TCF的靶基因，則可被GSK-3β弱化表達而影響成骨向分化。此外，結合文獻發(fā)現，對骨分化進程的影響的研究，更多的在于GSK-3β對成骨細胞系的成骨方向分化和破骨細胞系的破骨細胞方向分化的影響。

總體上，負調控GSK-3β的活性水平，可促進BMSC骨生成，這已在多項體內、體外研究中通過鋰離子或特異抑制劑證實［34，35］。不過，在體外實驗研究中發(fā)現，對于不同病理狀態(tài)的嚙齒動物模型，GSK-3β對骨生成的影響不一致［32］。一方面，說明了GSK-3β的活性變化及其效應可能不夠穩(wěn)定和顯著。鑒于GSK-3β位于相互交聯的多個信號通路，上下游蛋白受其影響者眾多，實驗結果為多方綜合的效果，需要更多精細設計的研究厘清。另一方面，這可能與各個研究使用的動物種類、抑制劑種類、抑制時間長短不同等因素有關。

在使用骨組織工程技術修復骨缺損的過程中，支架上的種子細胞在進行骨生成，為獲得更理想的修復效果，可通過誘導自體BMSC歸巢，增加缺損部位的細胞數量并增強修復功能［36］。在骨生成過程中，BMSC在微環(huán)境中的存活和增殖能力也決定了修復速度和愈合效果。通過負調控GSK-3β的活性水平，可影響B(tài)MSC這些重要性能，因此可作為促骨修復的策略參考之一。