初級(jí)纖毛在牙發(fā)育中的分布及相關(guān)信號(hào)通路的研究進(jìn)展

周陶， 巫佩瑤， 楊雨青， 曹志煒， 解亮

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）

1 初級(jí)纖毛的結(jié)構(gòu)和功能研究

初級(jí)纖毛是從真核細(xì)胞表面延伸出來的一種非運(yùn)動(dòng)型細(xì)胞器，由軸絲和一對(duì)中心粒構(gòu)成。其中，軸絲呈“9+0”雙聯(lián)微管狀排列，是纖毛內(nèi)物質(zhì)雙向運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；中心粒構(gòu)成纖毛基體部，提供纖毛微管骨架來構(gòu)建軸絲；軸絲基部和基體頂端之間為過渡區(qū)，主要調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)出纖毛。初級(jí)纖毛可以感受外環(huán)境中的機(jī)械與化學(xué)刺激，是個(gè)體發(fā)育過程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中心，介導(dǎo)了Hedgehog、Wnt、Notch、鈣離子等多種信號(hào)通路的信息傳遞，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化，維持組織穩(wěn)態(tài)。

2 牙發(fā)育過程中初級(jí)纖毛的分布特點(diǎn)

牙發(fā)育是上皮與間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的過程，發(fā)育早期牙上皮增厚形成牙板，在多種信號(hào)通路調(diào)控下，經(jīng)蕾狀期、帽狀期、鐘狀期形成完整的牙齒。觀察小鼠牙發(fā)育發(fā)現(xiàn)：初級(jí)纖毛存在于牙胚發(fā)育不同階段的細(xì)胞表面。E12.5（牙板增厚）時(shí)，初級(jí)纖毛分散于牙板上皮增厚區(qū)的細(xì)胞表面以及下方的間充質(zhì)；E13.5（蕾狀期）時(shí)，主要位于牙胚基底上皮層的頂端，且與基膜方向相對(duì)，可能參與牙發(fā)育早期細(xì)胞的極化；E15.5（帽狀期）時(shí)，整個(gè)成釉器中都分散有含初級(jí)纖毛的細(xì)胞［1］。牙胚發(fā)育晚期，初級(jí)纖毛的數(shù)量和長(zhǎng)短隨細(xì)胞分化表現(xiàn)出時(shí)空特異性。E16.5（鐘狀早期）時(shí)，內(nèi)釉上皮和外釉上皮中可見大量短纖毛，而在星網(wǎng)狀層主要集中于釉結(jié)處［2］。P0（礦化開始）時(shí)，成釉細(xì)胞出現(xiàn)初級(jí)纖毛，且數(shù)量隨牙胚發(fā)育進(jìn)行性減少，在此階段，成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓細(xì)胞表面可見大量粗的初級(jí)纖毛。P12 以后，成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的初級(jí)纖毛分別沿牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)軸向排列，前者朝向外釉上皮，后者指向牙髓，均與硬組織形成方向相反［2］。牙囊細(xì)胞表面初級(jí)纖毛隨牙發(fā)育逐漸集中在牙周膜細(xì)胞表面，呈線性排列，且更靠近牙骨質(zhì)，可能與該處承受更大咬合力有關(guān)［2］。人牙胚發(fā)育過程中初級(jí)纖毛的分布與小鼠既具相似性，但也存在著不同。12 周（帽狀期）時(shí)，大量的初級(jí)纖毛分布于成釉器的各個(gè)部位，但主要集中在內(nèi)釉上皮和牙乳頭處。14周，初級(jí)纖毛主要集中在頸環(huán)及其鄰近的牙囊和牙乳頭細(xì)胞中。21周時(shí)，成釉細(xì)胞、牙髓細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中均可見長(zhǎng)的初級(jí)纖毛，而頸環(huán)處的內(nèi)釉上皮中缺乏清晰可見的纖毛［3］。由此可見，初級(jí)纖毛在牙胚發(fā)育中存在時(shí)間和空間依賴性，這種動(dòng)態(tài)改變可能與牙發(fā)育不同階段不同細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能相適應(yīng)，如成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞表面纖毛的方向可以影響細(xì)胞的移動(dòng)，規(guī)律的纖毛排布有利于細(xì)胞的定向等［2］。

3 初級(jí)纖毛調(diào)控牙發(fā)育中的相關(guān)信號(hào)通路研究

3.1 Wnt 信號(hào)通路

初級(jí)纖毛蛋白（主要是基體部）可參與調(diào)控經(jīng)典和非經(jīng)典兩種Wnt 信號(hào)通路。Wnt 與配體卷曲蛋白（frizzled，F(xiàn)Z）結(jié)合后可引起兩種途徑的激活，前者依賴于β-連環(huán)蛋白（β-catenin），經(jīng)dishevelled（Dsh）蛋白募集，糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）滅活，β-catenin 易位到細(xì)胞核，與T 細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（T-cell factor/lymphoid enhancer factor，LEF/TCF）家族成員共同誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。初級(jí)纖毛對(duì)于Wnt 信號(hào)通路的調(diào)控作用還存在爭(zhēng)議，研究發(fā)現(xiàn)纖毛基底部驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin-like protein3A，KIF3A）等缺失后可導(dǎo)致Wnt 信號(hào)通路的異常激活；也有研究發(fā)現(xiàn)，初級(jí)纖毛蛋白缺失造成纖毛形成障礙，卻表現(xiàn)出正常的Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)［4］。在WntCre+Kif3afl/fl 小鼠牙胚間充質(zhì)中，Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)的增強(qiáng)說明了初級(jí)纖毛對(duì)Wnt 信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控作用［5］。Kif3a 敲低的牙囊和牙髓細(xì)胞初級(jí)纖毛喪失，向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化受到明顯抑制進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)［6］。而Kif3a 缺失對(duì)于牙發(fā)育的影響也呈現(xiàn)出區(qū)域特異性，表現(xiàn)為切牙完全喪失，而磨牙僅表現(xiàn)出牙胚增大和成釉器畸形。此外還發(fā)現(xiàn)纖毛參與調(diào)控的Hedgehog 和Wnt 信號(hào)通路可能共同介導(dǎo)上皮與間充質(zhì)相互作用。小鼠間充質(zhì)中Kif3a 缺陷可導(dǎo)致同一區(qū)域Hedgehog 信號(hào)通路喪失和Wnt 信號(hào)通路增強(qiáng)，并繼發(fā)地向牙上皮傳遞異常信號(hào)，引起上皮中這兩種信號(hào)通路增強(qiáng)，最終表現(xiàn)出切牙完全喪失，磨牙增大［5］。

3.2 Hedgehog 信號(hào)通路

Hedgehog 信號(hào)通路幾乎參與了所有組織器官的發(fā)育，并且它的信息傳遞高度依賴于初級(jí)纖毛。Hedgehog 信號(hào)通路由位于纖毛基部的跨膜受體（patched1，PTCH1），跨膜平滑蛋白（smoothened protein，SMO），融合抑制因子（suppressor of fused，SUFU）以及3 個(gè)鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Gli1，Gli2 和Gli3）構(gòu)成，當(dāng)PTCH1 與配體結(jié)合以后，解除對(duì)SMO 的抑制讓其易位到纖毛中，活化的SMO 輔助受體通過抑制SUFU 激活Gli，隨后激活的Gli 活化因子進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)Hedgehog 目標(biāo)基因的表達(dá)。研究表明，初級(jí)纖毛膜上的主要蛋白，包括負(fù)責(zé)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體（intraflagellartransport proteins，IFT），與纖毛組裝有關(guān)的中心粒和基體部蛋白在調(diào)控細(xì)胞對(duì)Hedgehog 的響應(yīng)中具有重要作用，大部分基因突變主要通過影響這些纖毛蛋白的結(jié)構(gòu)或功能，進(jìn)而增強(qiáng)或削弱Hedgehog 信號(hào)的傳遞，最終導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常［7］。

3.2.1 Evc/Evc2 基 因 Evc 或Evc2 基 因 編 碼 的EVC 和EVC2 蛋白是共定位于纖毛基體部和纖毛膜上的跨膜蛋白，并參與Shh 信號(hào)通路的正向調(diào)控。該基因的缺失可引起埃利偉氏綜合征（ellis-van creveldsyndrome，EvC）。據(jù)臨床報(bào)道，該類患者可表現(xiàn)出圓錐形或釘型齒、牙齒缺失、釉質(zhì)發(fā)育不全、牙齒過小、牙齒延遲萌出、高齲率等［8-9］。Evc2/Limbin 參與調(diào)控切牙牙根長(zhǎng)度，還與牙發(fā)育過程中成釉細(xì)胞礦化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積相關(guān)［10］。

纖毛內(nèi)EVC 區(qū)中Smo-Evc2 復(fù)合體的形成是Hedgehog 信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子基礎(chǔ)，并受到嚴(yán)格的空間限制。EVC2 蛋白從EVC 區(qū)消失后特異性阻斷SMO 和下游調(diào)節(jié)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和SUFU 因子之間的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制Gli 轉(zhuǎn)錄因子的激活［11］。除Evc/Evc2 本身的突變，Ift121 的缺失也可以導(dǎo)致Evc-Smo 復(fù)合體形成障礙，也說明了纖毛蛋白的調(diào)控存在交互作用［12］。

3.2.2 Ift基因 Ift基因編碼的IFT蛋白是纖毛內(nèi)運(yùn)輸系統(tǒng)的重要組分，該系統(tǒng)主要由IFTA復(fù)合體和IFTB 復(fù)合體構(gòu)成，主要負(fù)責(zé)物質(zhì)在纖毛內(nèi)的雙向運(yùn)輸［13］。目前已證實(shí)，Ift基因變異可引起多種發(fā)育性疾病，常見的是Ift52、Ift140、Ift121、Ift122等引起的顱骨外胚層發(fā)育不良［14］，患者可表現(xiàn)出牙齒小而寬，延遲萌出，牙間隙增大，牙融合伴釉質(zhì)發(fā)育不全，甚至牙缺失等［15-16］。Ift140 cKO小鼠表現(xiàn)出磨牙短根以及根間牙本質(zhì)變薄，可能與Ift140調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因Nfic，Osx，Dspp和Dmp1的表達(dá)有關(guān)［17］。

Ift 基因缺陷仍然主要通過破壞Shh 信號(hào)來影響牙齒發(fā)育。Ift88 變異可以導(dǎo)致異常纖毛的形成，Ift88orpk 小鼠在第一磨牙位置處出現(xiàn)異位的內(nèi)側(cè)磨牙并伴磨牙數(shù)量增加［18］，與間充質(zhì)中Shh 信號(hào)增強(qiáng)有關(guān)；Ift122 缺失會(huì)影響纖毛蛋白的正確定位，破壞其與IFT43-IFT121 和IFT139 的相互作用，導(dǎo)致纖毛運(yùn)輸障礙［19］，阻礙了Shh 信號(hào)通路中Smo與Gli 之間的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)［20］。此外還發(fā)現(xiàn)，Ift140cKO小鼠纖毛數(shù)量明顯減少，Shh 通路相關(guān)信號(hào)分子均下調(diào)，并可能通過Shh 信號(hào)通路活化間充質(zhì)干細(xì)胞中的核因子1C 型（nuclear factor 1 C-type，NFIC），調(diào)節(jié)根發(fā)育［17］。此外，敲除成熟成牙本質(zhì)細(xì)胞中的Ift140，不影響磨牙正常發(fā)育［21］，而敲除早期牙齒間充質(zhì)干細(xì)胞中的Ift140，則出現(xiàn)磨牙短根和低分化成牙本質(zhì)細(xì)胞［22］?？梢?，IFT140 蛋白在牙發(fā)育中的作用具有時(shí)間和空間依賴性。此外，Ift 的突變可影響多條通路，牙髓干細(xì)胞中敲除Ift80 后，破壞的Hedgehog 信號(hào)影響成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，牙髓干細(xì)胞增殖下降則與FGF2-FGFR1-PI3K-AKT信號(hào)通路的破壞密切相關(guān)［23-24］。

3.2.3 其它基因 Ofd1 基因編碼纖毛基體部和中心體上的蛋白，該基因發(fā)生突變以后會(huì)引起纖毛的喪失并影響Shh 信號(hào)通路傳導(dǎo)［25］，導(dǎo)致口-面-指綜合征，表現(xiàn)為多牙、缺牙和牙釉質(zhì)發(fā)育不全，成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和礦化受阻，牙尖形成異常等［26］。同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)，OFD1 外顯子20，21 的突變可引起纖毛異常，卻無相關(guān)的異常癥狀［27］。Bbs 基因喪失后可引起巴-比二氏綜合征（bardetbiedlsyndrome，BBS），該基因缺失后破壞IFT 蛋白導(dǎo)致纖毛蛋白的異常定位和物質(zhì)運(yùn)輸障礙，且不同亞型的Bbs 缺陷對(duì)于胚胎發(fā)育影響各不相同［28］。目前認(rèn)為，Bbs4 和Bbs6 主要參與成牙本質(zhì)細(xì)胞表面初級(jí)纖毛的形成，BBS 蛋白缺失后導(dǎo)致Shh 信號(hào)異常，常表現(xiàn)為牙齒排列擁擠，釉質(zhì)發(fā)育不全，短根等［29］。

4 展 望

作為重要的信號(hào)中心，初級(jí)纖毛參與了牙發(fā)育過程中Hedgehog、Wnt 等的信息傳遞，基因缺陷導(dǎo)致相應(yīng)的纖毛蛋白破壞，可破壞下游信息的傳遞，并且逐漸明確了不同基因在Shh 信號(hào)通路中的調(diào)控靶點(diǎn)。雖然部分研究已經(jīng)明確牙發(fā)育中Hedgehog、Wnt 信號(hào)通路依賴于纖毛參與細(xì)胞的增殖分化以及牙齒礦化等，但牙發(fā)育中其它重要信號(hào)通路如Notch、TGF-β 與纖毛的關(guān)系尚不明確。同時(shí)，初級(jí)纖毛在牙發(fā)育中的分布表現(xiàn)出時(shí)空特異性，而某些基因通過初級(jí)纖毛對(duì)Wnt 和Hedgehog信號(hào)通路的調(diào)控也表現(xiàn)出時(shí)空特異性，這之間的關(guān)系還需要更多的研究加以論證。