肝竇內(nèi)皮細胞在非酒精性脂肪性肝病發(fā)病過程中的作用

楊 婧， 高 紅， 趙耀偉， 王 銳

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 哈爾濱 150040

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化，表現(xiàn)為脂肪變性、肝細胞損傷、炎癥和不同程度的纖維化。肝硬化由肝纖維化發(fā)展而來，是所有慢性肝損傷的嚴(yán)重病理階段。肝纖維化和肝硬化涉及細胞外基質(zhì)的過量產(chǎn)生，而細胞外基質(zhì)與肝竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)密切相關(guān)。受損的LSEC可合成TGFβ和血小板衍生生長因子，激活肝星狀細胞(HSC)，促進細胞外基質(zhì)的合成[1]。隨著肥胖的增加以及相關(guān)代謝綜合征的出現(xiàn)，NAFLD如今已成為歐美等西方發(fā)達國家和我國富裕地區(qū)慢性肝病的重要病因，估計全球患病率為25%[2-3]。最近的一種建模方法估計，美國的NAFLD病例將從 2015年的8300萬(相當(dāng)于約25%的人口)擴大到2030 年的1億，相當(dāng)于超過33%的人口。 重要的是，患有代謝綜合征和NASH的患者在沒有肝硬化的情況下也會發(fā)展為肝細胞癌(HCC)[4]。

肝臟內(nèi)皮細胞主要由LSEC組成，它們是存在于內(nèi)臟脂肪組織和腸道血液之間的高度特化的內(nèi)皮細胞。LSEC在人體中具有獨特的表型， 因為它們?nèi)狈啄げ⑶揖哂薪M織成篩子的多個窗孔，其調(diào)節(jié)跨越竇狀隙的大分子(包括脂質(zhì)和脂蛋白)的轉(zhuǎn)運。LSEC作為肝臟的重要生理結(jié)構(gòu)，與NAFLD相關(guān)性的研究被提上日程，并逐漸成為研究熱點，有望成為治療NAFLD發(fā)展的突破點，為其提供強有力的生理依據(jù)。本綜述將特別關(guān)注LSEC在NAFLD病理生理學(xué)中的作用。

1 LSEC概述

LSEC來源于骨髓造血祖細胞分化的內(nèi)皮細胞，是肝非實質(zhì)細胞的主要細胞群，具有高度專業(yè)化。由LSEC構(gòu)成的肝竇壁是全身毛細血管壁唯一缺乏基膜的毛細血管，約占肝細胞的15%～20%，但僅占肝體積的3%[5]。窗孔是LSEC最具特征性的結(jié)構(gòu)。它們有一個不連續(xù)的結(jié)構(gòu)，這意味著腔質(zhì)膜和無瘤質(zhì)膜的融合發(fā)生在細胞連接的其他部位，這個區(qū)域稱為“芬瑞斯特”。盧艷嫻等[6]通過尾靜脈注射脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，檢測血清中AST、ALT、NO的水平,比較肝組織中小窩蛋白-1的表達情況及LSEC窗孔的改變情況。發(fā)現(xiàn)丹參多糖能降低血清中AST、ALT、NO水平，減少小窩蛋白-1的表達，增加LSEC的數(shù)目，并使其窗孔孔徑增大，進而達到保護肝臟的作用。

在生理條件下，LSEC是肝臟穩(wěn)態(tài)的守門者，它通過阻止Kupffer細胞和HSC活化以及調(diào)節(jié)肝內(nèi)血管阻力與門靜脈壓力來顯示抗炎和抗纖維化特性。在病理條件下，LSEC在慢性肝病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。 在NASH階段，改變的LSEC釋放炎癥介質(zhì)并促進炎癥細胞的募集，從而促進肝損傷和炎癥。改變的LSEC也不能維持HSC靜止并釋放纖維化介質(zhì)，包括Hedgehog信號分子，促進肝纖維化。肝臟血管生成在NAFLD中增加并且有助于肝臟炎癥和纖維化，也有助于HCC的發(fā)展。成熟的LSEC在正常情況下可以自行增殖，當(dāng)LSEC祖細胞占正常嚙齒動物肝臟LSEC的1%～7%時，可能對LSEC的再生有貢獻[7]。骨髓來源的LSEC祖細胞不參與正常肝臟的LSEC轉(zhuǎn)換,相比之下，肝損傷后，這些細胞是肝再生的主要驅(qū)動力。

血管內(nèi)皮代表血液和其他組織之間的界面，不僅是一個物理屏障，而且參與了不同的生理和病理過程，包括止血、血栓形成、代謝物的運輸、炎癥、血管生成和血管張力 。譚朝輝等[8]將雄性 Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、逍遙散組和氟西汀組并誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為，發(fā)現(xiàn)逍遙散可顯著增加大鼠糖水消耗、爬格數(shù)和直立數(shù)，顯著降低血清 TNFα、 IL-6 水平， 增加窗孔數(shù)量與大小，改善肝竇內(nèi)皮血管化傾向。 研究表明逍遙散可顯著改善大鼠抑郁樣行為，可能與其降低炎癥因子、改善肝竇內(nèi)皮功能作用有關(guān)。

肝竇有雙重血供，接受門靜脈血流(70%)和肝動脈血流(30%)[9]。血壓在竇內(nèi)平衡，然后將血液排入肝靜脈和下腔靜脈。盡管消化導(dǎo)致肝臟血流量發(fā)生了重大的晝夜變化，但健康人的肝靜脈壓力梯度仍保持在4 mm Hg或以下，證明肝血管張力有很好的調(diào)節(jié)作用[10]。肝內(nèi)剪切應(yīng)力被認為是肝血流調(diào)節(jié)的主要驅(qū)動因素[11]。

在正常條件下，就像其他血管床一樣，內(nèi)皮細胞在肝臟中能夠產(chǎn)生血管舒張劑，以應(yīng)對增加的剪切應(yīng)力，從而減緩血壓的升高，這種特性的喪失稱為內(nèi)皮功能障礙。內(nèi)皮功能障礙發(fā)生在慢性肝病的早期，甚至在纖維化和炎癥發(fā)生之前，并在晚期肝硬化中持續(xù)存在。長時間剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子——Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2介導(dǎo)剪切應(yīng)力的這種作用[12]。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2可誘導(dǎo)包括NO在內(nèi)的血管擴張劑的內(nèi)皮增生[13]。經(jīng)研究[14]證明，LSEC是正常肝臟中NO的主要來源，通過剪切應(yīng)力激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)。

2 LSEC與NAFLD的相關(guān)性

2.1 LSEC的特異性

2.1.1 肝竇毛細血管化 LSEC的毛細血管化，也稱為去分化，發(fā)生在動物模型和患者肝臟損傷后[15-17]。在肝竇毛細血管化形成初期，吞噬細胞可在外界病理刺激因素作用下活化，并轉(zhuǎn)移至肝血竇，在吞噬細胞的浸潤下，肝血竇逐漸變窄,甚至堵塞。同時，吞噬細胞會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞窗孔數(shù)量減少及孔徑減小，從而加速肝竇毛細血管化的進展[18]。肝竇毛細血管化時，肝血竇內(nèi)一些細胞及細胞外間質(zhì)成分將發(fā)生一系列改變。有學(xué)者[19-20]指出,HSC活化與肝竇毛細血管化的形成密切相關(guān)。毛細血管化是一個早期事件，因為它先于HSC和Kupffer細胞的激活與肝纖維化的發(fā)生，提示毛細血管化可能是纖維化發(fā)生的一個必要的初步步驟[16,21-22]。簡而言之，LSEC只要分化就能保持HSC的靜止?fàn)顟B(tài)，從而使分化的LSEC成為纖維化的守護者[23-24]。事實上，在實驗?zāi)Ｐ椭?，體內(nèi)LSEC分化的恢復(fù)促進了輕度纖維化的消退[23,25]。然而，盡管肝硬化消退，竇狀毛細血管仍然存在。因此，在這種情況下，LSEC的分化并不是纖維化消退的關(guān)鍵[26]。研究[27-28]表明，肝竇毛細血管化可導(dǎo)致肝臟組織供血動脈化，從而導(dǎo)致肝硬化的形成以及后續(xù)的肝癌發(fā)生。

謝知兵等[29]通過扶正化瘀方藥物粉末以0.46 g/kg大鼠體質(zhì)量的劑量配制成懸液，給予三組SD大鼠灌胃，觀察不同條件下體外傳代的LSEC vWF和CD31的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)扶正化瘀方可抑制LSEC vWF和CD31的表達，增加細胞表面的窗孔結(jié)構(gòu)，具有潛在的逆轉(zhuǎn)肝竇毛細血管化的作用。

2.1.2 肝血管再生 血管生成的定義是從原有血管中發(fā)展出新的血管。肝血管生成發(fā)生在肝纖維化過程中，這兩個過程密切相關(guān)。肝纖維化促進血管生成，而肝血管生成又加重肝纖維化。魯軍等[30]通過分離正常大鼠 HSC、LSEC和肝纖維化模型大鼠 LSEC，利用慢病毒轉(zhuǎn)染得到血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF) 過表達 HSC。研究表明疏肝健脾活血方可能通過下調(diào)VEGF蛋白表達，進而抑制VEGF信號通路，恢復(fù) LSEC窗孔結(jié)構(gòu)，從而逆轉(zhuǎn)肝竇毛細血管化。此外，LSEC還通過釋放血管分泌信號來平衡肝臟再生和調(diào)節(jié)纖維化。

2.1.3 炎癥和感染 LSEC通過兩種方式調(diào)節(jié)肝臟炎癥。首先，LSEC是將血液從肝臟中分離出來的屏障，因此限制或允許循環(huán)白細胞進入肝臟組織。LSEC表達細胞間黏附分子-1和血管黏附蛋白-1，使白細胞與內(nèi)皮細胞黏附。炎癥過程中，細胞間黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1和CD31的表達增加，導(dǎo)致白細胞的跨內(nèi)皮遷移。第二，LSEC對淋巴細胞行為有調(diào)節(jié)作用。在生理條件下，LSEC抗原遞呈可誘導(dǎo)CD8細胞耐受[31]。LSEC還能誘導(dǎo)T淋巴細胞分化為免疫抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細胞，在體外和體內(nèi)均具有功能[32]。在炎癥條件下，LSEC也具有抗炎作用，因為它們通過Notch途徑增加輔助性T淋巴細胞1中抗炎細胞因子IL-10的表達[33]。

此外，LSEC是病原體攻擊的靶點。由于其具有的清除能力，LSEC可以通過表面凝集素的表達而捕獲循環(huán)病毒，進而使肝細胞受到感染，如HBV和HCV[34-35]所觀察到的那樣。同時，LSEC也可以被細菌感染，如研究[36]顯示，LSEC中的Bartonella桿菌與血管瘤病和脂溢性肝炎有關(guān)。

總之，LSEC具有獨特的高滲透性表型，允許某些分子和細胞傳代，但不是所有的分子和細胞。它們通過毛細血管化、血管再生及炎癥和感染等多種致病因素，參與了NAFLD相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。以上LSEC所表現(xiàn)出來的特異性可能會限制與全身給藥相關(guān)的副作用，同時為相關(guān)肝病的治療帶來新的希望。

2.2 LSEC在NAFLD中的作用

2.2.1 LSEC與NAFL LSEC在正常肝臟脂質(zhì)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用，而存在于循環(huán)中的膳食脂質(zhì)必須通過血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)運才能被組織所代謝。在生理條件下，LSEC是血液和肝實質(zhì)之間雙向脂質(zhì)交換的主要調(diào)節(jié)劑。

LSEC毛細血管化在NAFL中發(fā)生并促進肝臟脂肪變性，伴隨著形態(tài)和功能的變化。最顯著的表型變化之一是窗孔的損失，也稱為脫殼或血竇毛細血管化，與在LSEC的近腔表面上形成基底膜有關(guān)。

血竇毛細血管化的觸發(fā)因素尚未完全確定，但過量的膳食常量營養(yǎng)素，包括脂類、碳水化合物和腸道微生物群衍生產(chǎn)品，都會發(fā)揮作用。無菌小鼠菌群移植實驗[37]證實，腸道菌群與NAFLD存在因果關(guān)系。Cogger等[38]發(fā)現(xiàn)不同飲食喂養(yǎng)的小鼠會表現(xiàn)出不同的常量營養(yǎng)素和能量含量，并表明LSEC窗孔(頻率、孔隙度和直徑)與循環(huán)游離脂肪酸(FFA)水平之間存在負相關(guān), 同時其在過量脂質(zhì)暴露后會發(fā)生脫落的現(xiàn)象。

2.2.2 NASH中的LSEC LSEC有助于NASH的氧化應(yīng)激，在脂毒性反應(yīng)中，肝細胞產(chǎn)生活性氧并引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)，加劇肝損傷[39]。 實際上，活性氧不僅在肝細胞中檢測到，而且在NASH患者的竇狀細胞中也被檢測到[40]。因此，在NASH中，活性氧產(chǎn)生不僅發(fā)生在肝細胞中，而且在一定程度上發(fā)生在 LSEC中，并且似乎有助于肝細胞損傷。

LSEC在NASH初始階段的抗炎作用由簡單的脂肪變性進展為脂肪性肝炎，伴隨著白細胞與竇內(nèi)皮的黏附，隨后白細胞浸潤在肝實質(zhì)內(nèi)形成炎性病灶[41]。中度和消退的炎癥反應(yīng)對肝臟有益，因為它們促進體內(nèi)平衡的重建， 促進組織修復(fù)并發(fā)揮肝臟保護作用[42]。 然而， 如在NASH中所見，慢性炎癥導(dǎo)致肝細胞死亡并導(dǎo)致肝實質(zhì)損傷[43]。在生理條件下，LSEC構(gòu)成調(diào)節(jié)肝實質(zhì)內(nèi)循環(huán)白細胞進入的屏障，并發(fā)揮抗炎作用[32,44]。在NAFLD進展的早期階段，一些證據(jù)[45-46]表明LSEC也表現(xiàn)出抗炎功能。事實上， Tateya等[46]證明了來自LSEC的NO在短時間(8周)喂食高脂肪飲食的小鼠中抑制 Kupffer細胞活化。在體外，短時間(16 h)暴露于FFA的人和鼠LSEC均可表現(xiàn)出下調(diào)的促炎性趨化因子，并通過MAPK依賴途徑參與單核細胞和巨噬細胞募集[45]。脂肪變性過程中脂質(zhì)過多可導(dǎo)致LSEC功能障礙。體外實驗[47]表明，用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激人原代LSEC，它會通過ox-LDL受體即凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(LOX1)下調(diào)eNOS的表達。

LSEC在NASH的晚期階段促進肝臟炎癥，但LSEC的改變發(fā)生在NAFLD進展的早期階段。實際上，LSEC毛細血管化先于 Kupffer細胞活化而出現(xiàn)，同時，LSEC毛細血管化和功能障礙也會促進肝臟炎癥。在NALFD進展期間，LSEC最終會表現(xiàn)為促炎表型和功能障礙的轉(zhuǎn)化。

2.2.3 LSEC與NASH相關(guān)的脂肪性肝纖維化 肝纖維化定義為肝實質(zhì)中細胞外基質(zhì)的過度沉積，導(dǎo)致肝纖維化的主要機制是肝細胞損傷和炎癥引起的并且由HSC活化介導(dǎo)的長期傷口愈合過程。HSC的激活與增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[48]，同時，HSC是接近LSEC的非實質(zhì)細胞，它在Disse腔中可儲存視黃醇，并且在肝損傷和炎癥反應(yīng)期間將其表型轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨募±w維母細胞狀態(tài)，分泌大量細胞外基質(zhì)化合物。如上所述，LSEC是NASH中肝臟炎癥的主要效應(yīng)物，因此也促進肝纖維化。

在NASH中，膨脹的肝細胞產(chǎn)生Hedgehog分子，因此很有可能在NASH期間，Hedgehog 配體被肝細胞和LSEC釋放，從而通過自分泌和旁分泌作用激活LSEC本身以及靜止的HSC。繼而活化的HSC分泌Hedgehog分子，促進LSEC毛細血管化，這反過來有利于HSC活化，促進纖維化過程。夏雪皎等[49]通過采用CCl4腹腔注射建立肝纖維化大鼠模型后分離LSEC，同時收集正常大鼠HSC和 LSEC以作對比。研究發(fā)現(xiàn)，健康的LSEC可以維持HSC的靜止?fàn)顟B(tài)，但毛細血管化的 LSEC失去了這種能力，然后在肝纖維化發(fā)展的過程中出現(xiàn)毛細血管化和HSC活化之間的惡性循環(huán)。

在NAFLD過程中，LSEC功能障礙可以促進肝纖維化內(nèi)皮功能障礙，并且在NASH動物模型中出現(xiàn)纖維化。表明肝竇內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致肝纖維化。趙士峰等[50]提出川芎嗪可能通過改善病理性血管生成發(fā)揮抗肝纖維化作用的假說，并用腹腔注射CCl4的方法建立大鼠肝纖維化模型，預(yù)防給予川芎嗪(100 mg/kg)處理和應(yīng)用VEGF-A構(gòu)建原代小鼠LSEC促血管生成模型。該研究表明，川芎嗪能夠通過抑制病理性血管生成從而改善化學(xué)誘導(dǎo)的肝纖維化，同時，研究明確了川芎嗪抑制肝纖維化過程中肝竇血管生成的分子機制，為靶向Hedgehog通路的抗肝纖維化新藥研發(fā)提供理論與實驗依據(jù)。

2.2.4 LSEC在NASH誘導(dǎo)的HCC中的作用 在大多數(shù)情況下，HCC在慢性肝病的背景下發(fā)展而來(占所有患者的70%～90%)?；加写x綜合征和NAFLD的患者在沒有潛在的肝硬化情況下也會發(fā)生HCC，這表明NAFLD具有特異性的致癌途徑[51]。

發(fā)育不良結(jié)節(jié)優(yōu)先通過門靜脈接受血液供應(yīng)，類似于肝硬化再生結(jié)節(jié)，隨后，血管生成會導(dǎo)致一個高度血管化的結(jié)節(jié)甚至腫瘤，并促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在NAFLD中，血管生成受到高度刺激并促進NAFLD相關(guān)的HCC，因為各種血管生成抑制劑都可以預(yù)防HCC的發(fā)展。

在肝癌進展中，內(nèi)皮細胞逐漸失去穩(wěn)定素-1、穩(wěn)定素-2、Lyve-1和CD32b等，小鼠肝癌模型和人肝癌模型中均有觀察到類似現(xiàn)象[52]。此外，與健康人的肝LSEC相比，人肝癌內(nèi)皮細胞具有較高的整合素表達，低表達細胞間黏附分子-1，并表現(xiàn)出更高的血管生成、促凝和纖溶能力，進而表明肝癌與腫瘤內(nèi)部和周圍內(nèi)皮細胞的變化有關(guān)。

3 總結(jié)與展望

即使對于LSEC在NAFLD中作用的研究已經(jīng)在過去幾年中取得了進展，但仍存在一些問題。首先，導(dǎo)致NAFLD中LSEC發(fā)生改變的首發(fā)因素大多是未知的，需要進一步的探討和研究。 其次，需要確定NAFLD內(nèi)皮變化的機制，包括毛細血管化，這可能為NAFLD提供新的治療靶點。第三，LSEC在NASH相關(guān)性肝硬化中的作用尚未得到具體驗證。LSEC功能和表型是否與其他原因相關(guān)的肝硬化有關(guān)仍有待評估。第四，雖然NAFLD被公認為有利于HCC的發(fā)展，但仍處于了解LSEC變化如何有利于HCC發(fā)展的早期階段。

LSEC作為生理條件下肝臟穩(wěn)態(tài)的守門者。在早期的NAFLD進展中，表現(xiàn)出毛細血管化以及內(nèi)皮功能障礙，即單純性脂肪變性階段。由脂毒性、脂肪因子、炎癥和腸道微生物群衍生的產(chǎn)物可引發(fā)LSEC的變化和能力喪失，進而導(dǎo)致NASH甚至相關(guān)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。在NASH階段，改變的LSEC有助于肝臟血管生成、炎癥、纖維化和HCC。綜上，改善LSEC的狀況對治療NAFLD具有很大的潛力。當(dāng)前的挑戰(zhàn)是確定專門針對LSEC以調(diào)節(jié)其活動的相應(yīng)策略，從而達到治療NAFLD的理想效果。

作者貢獻聲明：楊婧負責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；高紅、趙耀偉等參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；王銳負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。