嗅粘膜間充質(zhì)干細胞與嗅粘膜嗅鞘細胞在人鼻粘膜中分布的研究

黃佩琦，卓 毅，段 答，龍 浪，蔣欣宸，趙振宇

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二一醫(yī)院，湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長沙 410000）

神經(jīng)損傷后修復(fù)是臨床研究中有待攻克的難題。隨著干細胞研究的進展，細胞移植治療已用于神經(jīng)修復(fù)，并且成為當(dāng)今研究的熱點。常用于細胞移植的種子細胞有胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）、誘導(dǎo)性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPS cells）、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）等。

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），是一種多能干細胞，因其來源廣泛，具有自我更新能力及多向分化潛能，在組織損傷修復(fù)與再生中得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)其來源可分為臍帶間充質(zhì)干細胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）、骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose-drived stem cells，ADSCs）以及嗅粘膜間充質(zhì)干細胞（olfactory mucosa mesenchymal stem cells，OMMSCs）等。Lima［1］等人于2005 年首次進行了人自體嗅粘膜組織移植治療脊髓損傷的臨床實驗，表明嗅粘膜移植治療脊髓損傷是一種安全、可行、有效的方法。

嗅鞘細胞（OECs）是由Golgi 和 Blanes 在嗅球中發(fā)現(xiàn)［2］的一種特殊的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是嗅神經(jīng)的支持細胞，起源于嗅板，具有神經(jīng)再生功能、抑制膠質(zhì)增生、促進髓鞘化等功能［3］。嗅鞘細胞除了分布在嗅球的前兩層，在嗅粘膜中也有發(fā)現(xiàn)［4］。有研究表明，hOM-OECs移植用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［5-6］、帕金森病、阿爾茲海默癥后可緩解患者癥狀［7-8］。OECs 聯(lián)合干細胞移植治療神經(jīng)損傷效果優(yōu)于單純的干細胞或OECs 移植［9］。

本研究旨在通過獲取成人鼻嗅區(qū)與呼吸區(qū)的粘膜組織，檢測hOM-MSCs 與hOM-OECs 在鼻粘膜中的具體分布位置，為后期hOM-MSCs 與hOM-OECs 的取材培養(yǎng)、移植治療神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 患者資料研究對象選自從2017 年4 月～2017年10 月6 例解放軍第九二一醫(yī)院神經(jīng)外科收治的神經(jīng)損傷的患者，其中男患者3 例，女患者3 例，平均年齡42.50±12.26 歲?；颊叩木唧w信息及取材部位見表1。其中病例1～3 應(yīng)用鼻內(nèi)鏡于鼻粘膜嗅區(qū)取材，病例4～6于鼻粘膜呼吸區(qū)組取材。在獲取組織前告知患者情況，進行溝通并取得患者及家屬的同意，簽署自愿同意書；排除鼻腔腫瘤、鼻息肉以及嗅粘膜損傷、萎縮性鼻炎等嗅粘膜疾病的患者；在術(shù)前三天做好鼻內(nèi)清潔，適當(dāng)剃除鼻毛，滴加氯霉素滴鼻液等。

表1 患者信息及取材部位表

1.2 實驗試劑與儀器CD271 一抗（美國Abcam），CD166 一抗（美國Abcam），CD105 一抗（美國Abcam），SOX10 一抗（美國Abcam），S100β一抗（美國Abcam），DAPI（Wellbio）Alex flour 594 標記羊抗兔二抗 IgG，Proteintech；Alex flour 488 標記羊抗兔二抗IgG，Proteintech；正置熒光顯微鏡（Motic）等。

1.3 鼻粘膜組織取材將 2%鹽酸利多卡因浸潤的濕棉球塞入鼻腔內(nèi)進行粘膜表面局部麻醉，麻醉時間約 15 分鐘，麻醉 2 次，麻醉后應(yīng)用鼻內(nèi)窺鏡夾取所需部位的鼻粘膜組織（圖1），所夾取的鼻粘膜組織塊大小約為 5mm×5mm×5mm；其中嗅區(qū)粘膜組，其中包括上鼻甲內(nèi)側(cè)面，中鼻甲內(nèi)側(cè)后 1/3，呼吸區(qū)粘膜組，包括中鼻甲前 1/3，中鼻甲前 1/3 對應(yīng)的鼻中隔，取鼻粘膜組織塊，大小約為5mm×5mm×5mm，10%中性緩沖福爾馬林溶液固定。

圖1 鼻內(nèi)窺鏡下鼻粘膜組織的獲取

1.4 組織HE 染色取福爾馬林固定的組織塊，包埋切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，蒸餾水浸洗，蘇木素染1min，流水沖洗，置返藍液內(nèi)復(fù)染返藍，伊紅液染色1～3min，流水沖洗，梯度乙醇脫水，封固后鏡下觀察。

1.5 免疫熒光染色石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗，熱修復(fù)抗原，PBS 沖洗，10%正常血清/5%BSA 封閉，滴加適當(dāng)稀釋的一抗（CD271+CD105、CD271+CD166、CD271+SOX10、CD271+S100β），4℃過夜，PBS 沖洗3次；加二抗，37℃孵育90 min，PBS 沖洗3 次；DAPI 工作液37℃染核10 min，PBS 沖洗3 次；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以mean±SD 表示，2個樣本均數(shù)的比較采用t 檢驗。P 值取0.05。

2 結(jié)果

2.1 鼻粘膜的組織結(jié)構(gòu)在HE 染色鏡下觀察，嗅區(qū)黏膜組織結(jié)構(gòu)分為三層：上皮層、基底層、固有層。上皮層主要由嗅覺受體神經(jīng)元細胞、支持細胞、基底細胞、微絨毛細胞四種細胞構(gòu)成，細胞形狀排列規(guī)則，細胞間質(zhì)少，沒有血管，細胞具有兩極性；基底層為一層均質(zhì)結(jié)構(gòu)；固有層為薄層的結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，內(nèi)含有管泡狀的Bowman 腺的腺細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、毛細血管、淋巴管等（圖2A-B）。呼吸區(qū)組織結(jié)構(gòu)分為三層：由上至下分別為黏膜上皮層、黏膜固有層和黏膜下層。其中黏膜上皮層由柱狀纖毛細胞、柱狀細胞、杯狀細胞以及基底細胞組成；而黏膜固有層與黏膜下層的細胞以漿細胞、肥大細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、白細胞等與免疫機制相關(guān)的免疫細胞為主，有豐富的黏液腺、漿液腺等腺體（圖2C-D）。本實驗通過HE 染色確定了鼻粘膜的嗅區(qū)及呼吸區(qū)的部位。

2.2 嗅粘膜間充質(zhì)干細胞在嗅區(qū)及呼吸區(qū)的分布在成人鼻嗅區(qū)的上鼻甲及中鼻甲內(nèi)側(cè)鼻粘膜取材，及呼吸區(qū)的中鼻甲前1/3 及中鼻甲前1/3 對應(yīng)的鼻中隔區(qū)鼻粘膜取材，均有CD271+CD166 與CD271+CD105 標記的嗅粘膜間充質(zhì)干細胞分布（圖3）。通過高倍鏡下計數(shù)，嗅粘膜間充質(zhì)干細胞細胞在嗅區(qū)粘膜為54.67±11.66/視野，在呼吸區(qū)粘膜為36.67±7.34/視野，嗅區(qū)多于呼吸區(qū)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而嗅粘膜間充質(zhì)干細胞計數(shù)在嗅區(qū)的上鼻甲及中鼻甲內(nèi)側(cè)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），在呼吸區(qū)中鼻甲前1/3 及中鼻甲前1/3 對應(yīng)的鼻中隔區(qū)也無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 嗅鞘細胞在嗅區(qū)及呼吸區(qū)的分布在嗅區(qū)的上鼻甲及中鼻甲內(nèi)側(cè)后1/3 的鼻粘膜組織中，均可見CD271+S100β細胞與CD271+SOX10 標記的嗅粘膜嗅鞘細胞存在。通過高倍鏡下計數(shù)，嗅鞘細胞在嗅區(qū)上鼻甲粘膜為44.67±7.59/視野，在嗅區(qū)中鼻甲內(nèi)側(cè)后1/3的鼻粘膜為12.33±2.87/視野，上鼻甲多于中鼻甲內(nèi)側(cè)后1/3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而呼吸區(qū)的中鼻甲前1/3 鼻粘膜組織及中鼻甲前1/3 對應(yīng)鼻中隔區(qū)鼻粘膜組織未見嗅鞘細胞染色（圖4）。

圖2

圖3

圖4

3 討論

3.1 hOM-MSCs 和hOM-OECs 自體移植在神經(jīng)修復(fù)的作用成人神經(jīng)損傷后修復(fù)比較困難，自體干細胞移植是有效的治療方法之一，其中間充質(zhì)干細胞因具有多向分化潛能是理想的種子細胞。較常用的有臍帶間充質(zhì)干細胞，其促進修復(fù)方面的效果好，但臍帶間充質(zhì)干細胞獲取來源相對有限。骨髓間充質(zhì)干細胞需骨髓穿刺獲得，向神經(jīng)分化的潛能逐漸減弱，純化難度較大，病毒感染率較高［11-11］；脂肪間充質(zhì)干細胞的來源豐富，生長迅速，存活時間較骨髓間充質(zhì)干細胞長，但其純化問題有待進一步的解決。因此嗅粘膜間充質(zhì)干細胞是現(xiàn)階段神經(jīng)修復(fù)研究的熱點。

嗅粘膜間充質(zhì)干細胞是2010 年Huard［12］等人首次在人嗅粘膜中發(fā)現(xiàn)存在的一類干細胞，來源于外胚層，不需要跨胚層分化成神經(jīng)細胞，能夠向神經(jīng)元與非神經(jīng)元細胞分化［13］；OM-MSCs 可以在體外定向誘導(dǎo)分化為表達多巴胺能神經(jīng)蛋白抗體、絡(luò)氨酸羥化酶等特異性標記物的多巴胺能神經(jīng)元，將此細胞移植到帕金森病模型大鼠的紋狀體，移植后大鼠的運動明顯改善［14］；OMMSCs 移植到海馬病變的模型小鼠中，移植后的海馬區(qū)存在再生的神經(jīng)元［15］；將鼠嗅粘膜固有層移植治療大鼠完全脊髓損傷模型，移植后的模型大鼠，其脊髓損傷處的髓鞘再生，反射重新建立，軀體運動功能有所恢復(fù)［16］。自體hOM-MSCs 移植治療脊髓損傷的相關(guān)研究結(jié)果表明，脊髓損傷患者在移植后多有較為滿意的神經(jīng)功能恢復(fù)，而且患者在移植后并未出現(xiàn)發(fā)熱、抽搐、粘膜炎癥感染、腹瀉、惡心、嘔吐、頭暈、頭痛、骨骼肌肉疼痛等不適［17］，移植后安全性高。而OM-MSCs 移植后能夠改善神經(jīng)功能，可能是因為OM-MSCs 能夠產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，改變損傷部位的微環(huán)境從而達到神經(jīng)修復(fù)的作用［18］。此外，OM-MSCs 在移植后因與宿主細胞有相互作用而產(chǎn)生多種可溶性的營養(yǎng)因子［19］。而同時移植OECs 能夠促進MSCs 向神經(jīng)元分化［20］、分泌蛋白SC1 能夠促進神經(jīng)元的突觸形成［21］，OM-MSCs 則通過旁分泌因子也產(chǎn)生多種細胞營養(yǎng)因子［18］作用于OECs，加強OECs 的增殖能力和成髓鞘作用。

3.2 嗅粘膜作為自體細胞移植取材部位的優(yōu)勢hOMMSCs 與hOM-OEC 廣泛存在于患者鼻粘膜組織中，可以通過鼻內(nèi)鏡為患者取材，在取材后一個月復(fù)查可見鼻粘膜完全愈合，且未對患者的嗅覺造成影響及損傷。嗅粘膜處取材來源進行間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)，較骨髓穿刺及其他部位取材容易且安全。對患者造成的損傷小，患者易于接受，自體細胞培養(yǎng)移植不存在免疫排斥反應(yīng)與倫理爭議性。現(xiàn)在OM-MSCs 有成熟完善的培養(yǎng)體系，培養(yǎng)hOM-MSCs 增殖效率高，傳代時間短；且生物學(xué)活性不受年齡的限制，不隨年齡的增大而減??；安全性高，染色體核組分析與腫瘤基因分析，其體外培養(yǎng)無限傳代后沒有基因變異［22］。在嗅粘膜和嗅球的嗅神經(jīng)纖維層與小球?qū)又芯蠴ECs 的分布，嗅粘膜和嗅球獲取均可獲取，但嗅球位于顱內(nèi)，如要獲取需經(jīng)開顱手術(shù)風(fēng)險較大。而嗅粘膜的獲取無需開顱，僅需在局麻條件下經(jīng)鼻內(nèi)窺鏡夾取嗅粘膜組織塊。因此鼻粘膜處是理想的hOMMSCs 與hOM-OEC 的取材部位，但是hOM-MSCs 與hOM-OEC 在鼻粘膜中具體的分布部位的研究還不多。

3.3 hOM-MSCs 和hOM-OEC 在鼻粘膜的分布鼻腔粘膜范圍起自鼻前庭的鱗狀上皮和柱狀上皮的過渡區(qū)，向鼻腔內(nèi)延伸，分布于鼻腔的各壁及鼻道表面，可分為呼吸區(qū)和嗅區(qū)。其中呼吸區(qū)粘膜占鼻腔的絕大部分，范圍包括鼻前庭、中鼻甲前端和下鼻甲以及所對應(yīng)的鼻中隔區(qū)域，主要起調(diào)節(jié)、過濾以及清潔作用，纖毛運動產(chǎn)生傳送作用，并不具有嗅覺功能。嗅區(qū)粘膜，又稱為嗅膜，具有嗅覺功能。在成人，嗅區(qū)粘膜分布于上鼻甲的內(nèi)側(cè)面及中鼻甲內(nèi)側(cè)后1／3 的區(qū)域以及對應(yīng)的鼻中隔。嗅板通過凹陷形成小孔，上覆結(jié)締組織，稱之為嗅窩，而嗅窩僅分布于嗅粘膜層，與Bowman 腺一樣，這是區(qū)分于呼吸區(qū)粘膜的標志［23-24］。嗅粘膜固有層包含hOM-MSCs 及血管的內(nèi)皮細胞、雪旺細胞、Bowman腺腺細胞等多種組織細胞。OECs 是包繞在從上皮層延伸至固有層并進入嗅球的嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）外周［25-26］，分布在嗅粘膜進入嗅球的淺表兩層結(jié)構(gòu)中。

本實驗通過對人鼻粘膜進行免疫熒光染色，標記組織切片中的hOM-MSCs 與hOM-OECs，結(jié)果證明，hOM-MSCs 在嗅區(qū)與呼吸區(qū)粘膜固有層均有分布，且嗅區(qū)細胞數(shù)與多于呼吸區(qū)粘膜。hOM-OECs 主要位于嗅區(qū)鼻粘膜，呼吸區(qū)粘膜幾乎無細胞染色，嗅區(qū)上鼻甲細胞數(shù)多于中鼻甲內(nèi)側(cè)。

綜上所述，人鼻粘膜的嗅區(qū)粘膜的上鼻甲部位廣泛分布 hOM-MSCs 和hOM-OECs，建議神經(jīng)修復(fù)需要干細胞培養(yǎng)自體細胞移植時，可在嗅區(qū)的上鼻甲處粘膜取材。