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    褪黑素抑制玉米赤霉烯酮誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡

    2020-12-18 07:32:26周佳偉吳俊靜王孝忠劉貴生梅書棋彭先文
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年22期
    關(guān)鍵詞:顆粒細(xì)胞卵母細(xì)胞卵泡

    周佳偉,吳俊靜,喬 木,王孝忠,劉貴生,梅書棋,彭先文

    (1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064;2.湖北省宜昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,湖北 宜昌 443000)

    玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是由鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種真菌毒素,具有類雌激素作用,能夠與雌激素受體α 和雌激素受體β 結(jié)合,導(dǎo)致雌激素水平失調(diào),影響動(dòng)物生殖[1]。卵泡內(nèi)包括卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和壁細(xì)胞,雌激素主要由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生,雌激素/孕酮的比例直接影響卵泡的發(fā)育,當(dāng)雌激素/孕酮比例過低會(huì)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的凋亡,引發(fā)卵泡閉鎖[2]。研究表明,ZEA 會(huì)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡、阻礙卵母細(xì)胞的成熟并提高細(xì)胞內(nèi)的活性氧的水平[3-5]。

    褪黑素(Melatonin,MT)主要是由哺乳動(dòng)物下丘腦松果體產(chǎn)生的一種吲哚胺類激素,已被報(bào)道與卵泡發(fā)育過程密切相關(guān)[6]。Liu 等[7]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)褪黑素不僅提高豬卵巢顆粒細(xì)胞中雌激素的含量,且可以調(diào)控與細(xì)胞增殖及凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)水平。Wang 等[8]發(fā)現(xiàn)褪黑素通過褪黑素受體上調(diào)BCL2、BCL-XL、GPX4 和SOD1 的表達(dá)和下調(diào)BAX、CASP3 和TP53 的表達(dá)來抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。在氧化應(yīng)激條件下,褪黑素通過PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制FOXO1 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性以及介導(dǎo)SIRT信號(hào)通路提高FOXO1 蛋白的去乙?;瑥亩岣咝∈舐殉差w粒細(xì)胞的抗氧化能力并抑制細(xì)胞自噬[9]。

    本研究從3~5 mm 的卵泡中抽取卵泡液,分離豬卵巢顆粒細(xì)胞,通過添加不同濃度的ZEA 探究其對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響,并進(jìn)一步通過加入不同濃度的褪黑素來檢測(cè)褪黑素能否抑制ZEA 對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞分離及培養(yǎng)

    從武漢市某生豬屠宰場(chǎng)采集豬卵巢組織,用37 ℃含1% 雙抗(鏈霉素和青霉素)的PBS 溶液清洗3 次,用1 mL 注射器扎破直徑3~5 mm 的卵泡,抽取卵泡液,靜置2 min;將收集好的卵泡液依次使用100 μm 和70 μm 的細(xì)胞篩過濾,將過濾后的卵泡液1 000 r/min 離心5 min,棄上清;加入含1% 雙抗無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基洗滌,1 000 r/min 離心5 min,棄上清,重復(fù)3 次;加入含1% 雙抗和10%FBS 的DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基,放置在37 ℃下5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分離24 h 后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基,48 h 后便可將豬卵巢顆粒細(xì)胞接種,用于后續(xù)試驗(yàn)。

    1.2 豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)

    分離豬卵巢顆粒細(xì)胞,接種到6 孔板中,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)/mL 時(shí),分別使用0、3、10、30、50 和100 μmol/L 的ZEA 處理細(xì)胞,24 h 后每孔加入400 μL 不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞,用含10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化并收集細(xì)胞;用PBS 溶液洗滌細(xì)胞2 次,2 000 r/min 離心5 min,收集細(xì)胞;加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞;加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后,再加入5 μL Propidium Iodidie,混勻;室溫、避光、靜置15 min;上機(jī)檢測(cè)。

    1.3 豬卵巢顆粒細(xì)胞的活力檢測(cè)

    分離豬卵巢顆粒細(xì)胞,將其接種到96 孔板中,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)/mL 時(shí),分別使用0、0.1、1、10 和100 μmol/L MT 的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,24 h 換液,PBS 溶液洗滌2 次后更換30 μmol/L 的ZEA 處理豬卵巢顆粒細(xì)胞,ZEA 處理后24 h,每孔加入10 μL CCK8 試劑,并將細(xì)胞繼續(xù)放置到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h;使用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ZEA 顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡

    采集母豬卵巢,從3~5 mm 的卵泡中抽取卵泡液,分離豬卵巢顆粒細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)2×106個(gè)/mL時(shí),分別使用0、3、10、30、50 和100 μmol/L 的ZEA處理細(xì)胞,24 h 后收集細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的比例(圖1)。3 和10 μmol/L 的ZEA 對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響不顯著,而30、50 和100 μmol/L 均顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,且隨著ZEA 濃度的增加,凋亡細(xì)胞比例逐漸提高。ZEA 可顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

    圖1 ZEA 促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡

    2.2 褪黑素抑制ZEA 誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡

    細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累是ZEA 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素,而MT 作為一種廣譜抗氧化劑,能夠有效減少由氧化應(yīng)激引發(fā)的細(xì)胞凋亡。本研究中檢測(cè)MT 能否抑制ZEA 引發(fā)的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,將MT 加入到DMEM/F12 培養(yǎng)基中,稀釋成含有0、0.01、0.1、1、10 和100 μmol/L MT 的無血清培養(yǎng)基,分別用其處理豬卵巢顆粒細(xì)胞,24 h 后更換30 μmol/L 的ZEA 處理豬卵巢顆粒細(xì)胞,ZEA 處理后24 h。如圖2 所示,0.1 和1 μmol/L 的MT 均能夠顯著抑制ZEA 引起的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,且0.1和1 μmol/L 的MT 均能顯著提高細(xì)胞的活力。適宜濃度的MT 可以作為一種保護(hù)劑抑制ZEA 引起的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。

    3 討論

    ZEA 是豬場(chǎng)飼料的主要污染物之一,母豬過量食入會(huì)攻擊生殖系統(tǒng),其以卵巢顆粒細(xì)胞為主要靶點(diǎn),影響卵泡發(fā)育,降低母豬產(chǎn)仔數(shù)。Zhang 等[10]通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)ZEA 可通過調(diào)節(jié)lncRNA 的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK1、CCNB1、CDC25A 和CDC25C 的表達(dá),導(dǎo)致豬卵巢顆粒細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期。并且ZEA 也可通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)miR-744、miR-1343 和miR-331-3p的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。本研究通過使用不同濃度ZEA 處理豬卵巢顆粒細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)30、50 和100 μmol/L 的ZEA 顯著促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。

    圖2 MT 抑制ZEA 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

    目前,針對(duì)ZEA 誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)性化合物的研究較少。Lai 等[12]研究發(fā)現(xiàn)在卵泡生長(zhǎng)液或卵母細(xì)胞成熟液中添加溶血磷脂酰膽堿可部分保護(hù)ZEA 對(duì)卵泡腔形成和卵母細(xì)胞成熟的影響。另有研究檢測(cè)了20 種中藥提取物對(duì)ZEA 所誘導(dǎo)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,表明綠原酸可顯著抑制ZEA 誘導(dǎo)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[13]。由于ZEA 可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS 的積累,而MT是一種廣譜的細(xì)胞抗氧化劑,因此,本研究檢測(cè)MT是否保護(hù)ZEA 誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1 和1 μmol/L 的MT 抑制30 μmol/L 的ZEA對(duì)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響,提高細(xì)胞的活力。

    本研究發(fā)現(xiàn),ZEA 促進(jìn)豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系,而MT 可抑制ZEA 誘導(dǎo)的豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,在養(yǎng)豬生產(chǎn)中MT 可用來預(yù)防ZEA 引起的母豬繁殖性能降低。

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