微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵的泡沫產(chǎn)生與控制

劉 芳，廖先清，陳 偉，周榮華，萬中義

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

微生物農(nóng)藥是指微生物本身或（和）代謝產(chǎn)物來防治農(nóng)作物病、蟲、草、鼠害及促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)的一類農(nóng)藥，主要包括細(xì)菌農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥、病毒農(nóng)藥、微孢蟲及農(nóng)用抗生素等［1］。液體深層發(fā)酵廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及生物化工等行業(yè)，具有傳質(zhì)均勻、易于對(duì)發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行控制及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等特點(diǎn)。一般細(xì)菌農(nóng)藥、農(nóng)用抗生素及微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)，部分真菌農(nóng)藥也可通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)。在所有的微生物農(nóng)藥深層發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基基質(zhì)成分、發(fā)酵過程中的通氣、攪拌、所采用菌種本身特性等的影響，都會(huì)有泡沫的產(chǎn)生，一定數(shù)量的泡沫對(duì)發(fā)酵來說是有利的，可增加液體發(fā)酵過程中氣液的接觸，促進(jìn)氣體交換，從而使氧氣傳遞增加，而發(fā)酵過程中產(chǎn)生過多的泡沫則會(huì)影響微生物農(nóng)藥發(fā)酵過程中的傳質(zhì)、溶氧，導(dǎo)致發(fā)酵水平降低，或引起逃液，甚至?xí)?dǎo)致污染，致使發(fā)酵失敗、倒罐而產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)損失。必須要采用各種方法來控制發(fā)酵過程所產(chǎn)生的的泡沫，減少過量泡沫對(duì)發(fā)酵的不利影響，以保證發(fā)酵的穩(wěn)定性及生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。本研究從泡沫的產(chǎn)生原因、形成規(guī)律、對(duì)發(fā)酵的影響及泡沫的控制策略等方面對(duì)微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵過程中的泡沫控制進(jìn)行總結(jié)，以期對(duì)微生物農(nóng)藥深層發(fā)酵中的泡沫控制提供借鑒。

1 微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵過程中泡沫的產(chǎn)生

1.1 微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵過程中泡沫產(chǎn)生的原因

泡沫是一種氣體在液相中連續(xù)分散的體系，氣體被液相的膜分開后形成大小不一的氣泡。一般泡沫中氣體體積占泡沫的體積超過90%［2］。液體深層發(fā)酵過程中，泡沫中的氣體主要包括通入的無菌空氣和微生物代謝所產(chǎn)生的氣體。一定數(shù)量的泡沫是發(fā)酵中的正常現(xiàn)象，有利于發(fā)酵過程中氧的傳遞。

發(fā)酵過程中泡沫的形成與培養(yǎng)基的組成有關(guān)。用于微生物農(nóng)藥發(fā)酵的培養(yǎng)基成分主要包括淀粉、玉米漿、糖蜜、黃豆餅粉、棉子粕、花生餅粉、酵母粉或蛋白胨等。在這些成分中，高蛋白質(zhì)含量的氮源培養(yǎng)基容易發(fā)泡，為主要的發(fā)泡因子［3］，1 mg/L 的蛋白質(zhì)就可以影響到泡沫的形成［4］。由于培養(yǎng)基本身所具有發(fā)泡因子，通氣和攪拌會(huì)形成泡沫，這種泡沫一般稱為機(jī)械性泡沫，通常出現(xiàn)在發(fā)酵前期，而且這類泡沫大多在發(fā)酵液表面。發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌程度也會(huì)影響發(fā)酵中泡沫的產(chǎn)生，消毒溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖、氨基酸被破壞，不利于微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體自溶而產(chǎn)生大量的泡沫。

發(fā)酵過程泡沫的產(chǎn)生還與通氣、攪拌有關(guān)。用于微生物農(nóng)藥發(fā)酵的微生物菌株，大部分為好氧微生物，在其發(fā)酵過程中需要向發(fā)酵罐中通入大量無菌空氣并進(jìn)行攪拌，以增大微生物菌體與氧氣的接觸來加速氧的傳遞。由于發(fā)酵培養(yǎng)基本身存在發(fā)泡性，通氣及攪拌更易導(dǎo)致泡沫的形成。盡管淀粉、糖等培養(yǎng)基成分形成泡沫的能力較差，但是它們會(huì)增加培養(yǎng)基的黏度，通氣及攪拌所產(chǎn)生的泡沫會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)基的黏度而變得穩(wěn)定。此外，微生物菌株在發(fā)酵過程中由于呼吸作用產(chǎn)生氣體，而這些氣體也會(huì)由于攪拌分散到液體培養(yǎng)基中形成穩(wěn)定的細(xì)小泡沫。

此外，泡沫形成及其持久性還與微生物發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物的表面活性有關(guān)。在用于微生物農(nóng)藥生產(chǎn)的微生物類型中，芽胞桿菌會(huì)產(chǎn)生伊枯草菌素、表面活性素及豐原菌素等具有表面活性的脂肽類化合物［5］，而木霉菌產(chǎn)生的Hydrophobin 小分子蛋白質(zhì)也具有高度表面活性［6］。這些表面活性物質(zhì)可以降低發(fā)酵過程中發(fā)酵液的表面張力，并在氣泡的周圍形成穩(wěn)定的保護(hù)膜，從而增強(qiáng)了機(jī)械強(qiáng)度，使其不易破裂，致使泡沫的持久性增強(qiáng)。

1.2 微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵過程中泡沫產(chǎn)生的規(guī)律

一般說來，發(fā)酵培養(yǎng)基在滅菌時(shí)通常會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫，這種泡沫主要是由于培養(yǎng)基中的起泡性成分所導(dǎo)致，這些泡沫通常在培養(yǎng)基上面，其中氣相所占的比例較大，氣液分界明顯，這種泡沫會(huì)由于發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基的升溫、翻動(dòng)而破裂、減少，甚至是消失。而后，隨著接種及發(fā)酵過程中的通氣與攪拌，微生物代謝的加快，大量的起泡質(zhì)被消耗，導(dǎo)致泡沫減少。隨著微生物生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，微生物呼吸強(qiáng)度增加，產(chǎn)生氣體，而這種氣體與發(fā)酵過程中的通氣混合，并在攪拌的作用下，泡沫會(huì)持續(xù)增加。后期由于溶氧的下降及菌體的自溶，如果沒有消泡劑的作用，泡沫會(huì)進(jìn)一步增加。不同種類的微生物其生長(zhǎng)規(guī)律不同，泡沫產(chǎn)生的規(guī)律也存在差異，而發(fā)酵生產(chǎn)過程中工藝條件的改變也可能會(huì)影響泡沫的產(chǎn)生。因此，必須針對(duì)不同的微生物農(nóng)藥弄清其泡沫產(chǎn)生的規(guī)律，為后續(xù)的泡沫控制提供依據(jù)。

2 泡沫對(duì)微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵的影響

液體深層發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的泡沫對(duì)發(fā)酵來說通常是有害的，其對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的不利用影響主要有以下幾個(gè)方面：①降低發(fā)酵罐的有效發(fā)酵體積。發(fā)酵過程中通氣及攪拌會(huì)導(dǎo)致泡沫的產(chǎn)生，并使得泡沫在發(fā)酵中不斷上升，發(fā)酵罐中所留的空間不足以容納，泡沫會(huì)攜帶發(fā)酵液從軸封或排氣管中流出，從而降低實(shí)際的發(fā)酵液體積，使發(fā)酵原料形成不必要的浪費(fèi)。為了避免發(fā)酵過程中泡沫的影響，一些微生物農(nóng)藥，特別是一些產(chǎn)泡沫較多的芽胞桿菌及假單胞菌，可以選擇較低的裝量，這也使得單罐的生產(chǎn)能力降低。②導(dǎo)致雜菌污染。泡沫引起的逃液會(huì)在發(fā)酵罐排氣管上殘留一定量的培養(yǎng)基，滋生雜菌，隨著雜菌量的上升，其可能會(huì)進(jìn)入到發(fā)酵罐中，導(dǎo)致發(fā)酵液受到污染。另外，頂罐的泡沫會(huì)侵入軸封，使軸封的密封失效，也可能會(huì)導(dǎo)致雜菌的污染。雜菌嚴(yán)重污染可能會(huì)導(dǎo)致倒罐。③影響發(fā)酵過程中的物質(zhì)傳遞。用于微生物農(nóng)藥生產(chǎn)的微生物為好氧微生物，其生長(zhǎng)需要培養(yǎng)基中有充足的氧。泡沫，特別是持久性泡沫的存在會(huì)顯著降低發(fā)酵液中氧的傳遞速率，可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中的溶氧不足。而對(duì)于高耗氧的好氧微生物的發(fā)酵，低溶氧水平通常會(huì)導(dǎo)致菌體的自溶，降低目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，最終導(dǎo)致單位罐體積生產(chǎn)能力降低。

3 微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵過程中泡沫的控制策略

鑒于發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的持續(xù)性泡沫對(duì)微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵的不良影響，必須采取物理或機(jī)械方式來破解泡沫，或者采用化學(xué)方法改變泡沫液膜的表面張力，打破泡沫液膜，以避免大量持久性的泡沫長(zhǎng)期存在。

3.1 物理及機(jī)械消泡

在液體深層發(fā)酵中，物理消泡主要是通過一些物理方法來消除發(fā)酵過程所產(chǎn)生的泡沫，其主要方式包括升溫、降溫、機(jī)械聲波、超聲波、液體噴射等［7］。而這些物理消泡方法對(duì)發(fā)酵過程中的細(xì)胞可能有負(fù)面影響，而且受到成本及效率的限制，其在微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵中基本上沒有應(yīng)用。

機(jī)械消泡是通過在發(fā)酵罐內(nèi)或發(fā)酵罐外設(shè)置特定的裝置，利用機(jī)械剪切力和壓力的變化使發(fā)酵過程中的泡沫破裂，或者將發(fā)酵過程所產(chǎn)生的泡沫排出并回收其中的發(fā)酵液來削除泡沫。機(jī)械消泡的最大優(yōu)點(diǎn)是不往發(fā)酵罐中添加額外的物質(zhì)，減少了由于添加化學(xué)消泡劑可能帶來的污染問題，但機(jī)械消泡方式不能從根本上解決泡沫產(chǎn)生的因素，當(dāng)泡沫量過大時(shí)，機(jī)械性消泡裝置不能迅速消除泡沫，需要結(jié)合化學(xué)消泡劑的使用才能達(dá)到消泡的目的［8］。

3.2 化學(xué)消泡劑消泡

用于微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵的消泡劑主要包括天然油脂、脂肪酸、酯類、聚醚類及有機(jī)硅類?；瘜W(xué)消泡劑通過進(jìn)入到泡沫的液膜內(nèi)，并在界面上擴(kuò)散，改變液膜界面的性能，導(dǎo)致膜的破裂使得泡沫消失［2，9］。不同類型的化學(xué)消泡劑抑泡或消泡的原理存在差異，其在發(fā)酵過程中添加的方式、添加的量存在較大的差異，需要針對(duì)不同的微生物菌株、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、泡沫產(chǎn)生的規(guī)律、泡沫的組成與特性來進(jìn)行篩選?；瘜W(xué)消泡劑選擇的原則包括：無毒（對(duì)環(huán)境無毒、不影響發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生）、能夠耐高溫滅菌及對(duì)后續(xù)的提取工藝無不良影響等。消泡劑可直接添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，也可稀釋滅菌后在發(fā)酵過程中根據(jù)泡沫的產(chǎn)生情況進(jìn)行流加。

3.2.1 天然油脂消泡劑 用于微生物農(nóng)藥發(fā)酵的天然油脂主要包括豆油、玉米油、菜子油和花生油等。發(fā)酵過程中天然油脂的消泡效率隨培養(yǎng)基組成的變化而變化［10，11］。Vidyarthi 等［12］在研究以污泥為基質(zhì)發(fā)酵蘇云金芽孢桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，多種植物油，如菜子油、橄欖油及花生油等作為消泡劑對(duì)蘇云金芽孢桿菌的生長(zhǎng)及其內(nèi)毒素的產(chǎn)生影響最小，其中菜子油和花生油還可以刺激芽孢的形成和內(nèi)毒素的產(chǎn)量。一般芽孢桿菌類發(fā)酵中添加的植物油的比例較高，可達(dá)到發(fā)酵體積的0.3%～0.5%。魏浩等［13］篩選了用于Bacillus amyloliquefaciens ES-2 菌株產(chǎn)生抗菌脂肽的消泡劑，發(fā)現(xiàn)豆油的消泡效果相對(duì)較差，但其作為消泡劑時(shí)，B. amyloliquefaciens ES-2 菌株產(chǎn)生抗菌脂肽類化合物的產(chǎn)量明顯高于對(duì)照。在某些抗生素的發(fā)酵中，前期加入的豆油既可作為消泡劑，也可作為碳源被菌體吸收利用，但在發(fā)酵中后期加入的豆油則僅起消泡的作用，而過量的油會(huì)使溶氧降低導(dǎo)致菌體代謝異常［14］。天然油脂在存放的過程中易于氧化，添加變質(zhì)的天然油脂可能會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)，給生產(chǎn)帶來不利影響。

3.2.2 合成化學(xué)消泡劑消泡 用于微生物液體深層發(fā)酵的化學(xué)合成消泡劑主要種類有高碳醇類、聚醚類、有機(jī)硅類及聚醚改性硅類［15］，但沒有一種消泡劑可以適用于所有的發(fā)酵。在微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵中，以聚醚類和改性有機(jī)硅類，特別是具有不同消泡特性的復(fù)配制劑應(yīng)用較為廣泛。不同類型的微生物農(nóng)藥，其深層液體發(fā)酵過程中泡沫形成原因各不相同，其所需要的消泡劑種類也可能不同。事實(shí)上，微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵所用的消泡劑大多為復(fù)配劑，其中有天然油脂、聚醚及有機(jī)硅類，以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程中的抑泡及消泡。魏浩等［13］篩選了用于B. amyloliquefaciens ES-2 菌株產(chǎn)生抗菌脂肽的消泡劑，發(fā)現(xiàn)有機(jī)硅的消泡效果和抑泡效果均較好，但是有機(jī)硅消泡劑對(duì)菌體的生長(zhǎng)有輕微的抑制。紀(jì)兆林等［16］利用聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚作為消泡劑來發(fā)酵產(chǎn)生抗菌蛋白的地衣芽孢桿菌W10，同時(shí)比較了其與豆油的消泡效果，采用聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚處理，起泡高峰維持的時(shí)間相對(duì)較短，而且對(duì)于后續(xù)的抗菌蛋白的提取無不良影響。

化學(xué)消泡劑可能對(duì)微生物農(nóng)藥的發(fā)酵有不良影響。植物油可降低溶氧傳質(zhì)系數(shù)約30%［17］，而添加某些有機(jī)硅類消泡劑可使氧傳遞速率降低30%～50%［18］。Vidyarthi 等［12］發(fā)現(xiàn)，常用的PPG 消泡劑對(duì)蘇云金芽孢桿菌利用污泥進(jìn)行發(fā)酵，它對(duì)蘇云金芽孢桿菌的生長(zhǎng)有害，并降低其發(fā)酵的毒力，而另外一種antifoam A 消泡劑可有效控制發(fā)酵過程中泡沫的產(chǎn)生，但是對(duì)蘇云金芽孢桿菌的生長(zhǎng)和毒力有一定的負(fù)面作用。海洋芽孢桿菌B-9987 在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的易起泡物質(zhì)，需要加入大量的消泡劑，而大量加入消泡劑溶氧水平會(huì)大幅度下降，影響菌體的正常生理代謝，使得發(fā)酵過程中菌量大幅波動(dòng)［19］。孫東園等［20］研究了不同類型消泡劑對(duì)中生菌素生產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)多種聚醚類消泡劑明顯干擾中生菌素產(chǎn)生菌的發(fā)酵和產(chǎn)素，而有機(jī)硅和聚酮-聚醚復(fù)合消泡劑基本上沒有影響。有機(jī)消泡劑還會(huì)影響棘孢木霉分生孢子的產(chǎn)生，盡管豆油對(duì)分生孢子的影響最小，但其消泡所需要的時(shí)間最長(zhǎng)，從10余種消泡劑中篩選了L-101a，其具有很好的消泡和抑泡活性，而且最終分生孢子的產(chǎn)量達(dá)到了2.4×108CFU/mL［21］。不同消泡劑對(duì)阿維菌素發(fā)酵及后處理的影響不同，郭鴻雁等［22］研究發(fā)現(xiàn)，加泡敵盡管使阿維菌素的發(fā)酵效價(jià)有所降低，但板框過濾速度較高，不影響正常生產(chǎn)速度，所加的消泡劑總量也較少，而采用豆油作為消泡劑可以提高發(fā)酵的效價(jià)，但板框過濾時(shí)速率較低，且加量較大，而采用陶瓷膜過濾時(shí)，添加豆油時(shí)膜通量遞減速率最快。從最終的阿維菌素收率來看，添加加泡敵的收率最高，而添加豆油的收率最低。超濾膜通量降低的主要原因是消泡劑中所添加的乳化劑，如單硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯山梨聚糖硬脂酸鹽等，以及增稠劑，如纖維醚、黃原膠等，它們可能污染超濾膜，形成污垢，從而降低超濾膜的通量［23］。

3.3 其他消泡方法

在液體深層發(fā)酵時(shí)，提高發(fā)酵罐反壓、降低攪拌轉(zhuǎn)速或減少通氣可以減少泡沫，這也是在微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵經(jīng)常采用的方法。這3 種方法都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)及其有效成分的產(chǎn)生，從而影響微生物農(nóng)藥的發(fā)酵效率，增加生產(chǎn)成本［24］。 Lee等［25］發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成的消泡劑不能控制Bacillus sp.GB16 所產(chǎn)生的大量泡沫，而且還會(huì)抑制該菌株產(chǎn)生脂肽類化合物。利用植物油和硬脂酸鹽作為消泡劑，通過流加過氧化氫，顯著抑制了泡沫的產(chǎn)生，并大大提高了脂肽化合物的產(chǎn)量。通過菌種誘變來提升生產(chǎn)菌株對(duì)消泡劑的耐受力是工業(yè)菌種選育中一個(gè)重要方法。韓娜［26］采用化學(xué)誘變，利用含4% 消泡劑的培養(yǎng)基篩選耐消泡劑的阿維菌素高產(chǎn)菌株，從中獲得了耐受4% 消泡劑的突變株，其產(chǎn)量較對(duì)照菌株提高14.3%～17.3%。孫東園等［20］研究發(fā)現(xiàn)，通過紫外誘變得到的中生菌素突變株uv-69 對(duì)各種消泡劑具有較好的耐受力。通過誘變獲得對(duì)消泡劑耐受能力提升的突變株，可減少添加正常劑量的消泡劑對(duì)微生物菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)素的影響。

4 小結(jié)

大多數(shù)微生物液體深層發(fā)酵過程中都有泡沫的產(chǎn)生，而泡沫的產(chǎn)生與培養(yǎng)基組成、pH、滅菌過程、微生物的特性及生產(chǎn)工藝條件等密切相關(guān)。過多的泡沫會(huì)對(duì)微生物農(nóng)藥的發(fā)酵產(chǎn)生不利影響，包括影響發(fā)酵的效率、導(dǎo)致污染、影響菌體的生長(zhǎng)及次生代謝等。要降低泡沫對(duì)微生物農(nóng)藥液體深層發(fā)酵的不利影響，必須根據(jù)不同的微生物農(nóng)藥所用的菌種的生長(zhǎng)特性、發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵及后處理生產(chǎn)工藝、泡沫產(chǎn)生的規(guī)律及其特性等篩選合適的消沫方法和適當(dāng)?shù)南輨?/p>