幾種K型不育系及其后代染色體的細(xì)胞學(xué)分析

李亞莉，侯麗媛，董艷輝，王育川，王亦學(xué)

（1.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，山西晉中030619；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030031）

在雜交小麥的育種研究中，將小麥族內(nèi)的野生親緣種中豐富的細(xì)胞質(zhì)通過(guò)核置換回交的方法轉(zhuǎn)移到栽培小麥，創(chuàng)制出的核質(zhì)雜種小麥集純系育種和雄性不育雜種優(yōu)勢(shì)2種方法的優(yōu)點(diǎn)，可以加快育種效率、拓寬小麥品種改良和雜種優(yōu)勢(shì)的遺傳基礎(chǔ)，同時(shí)也是開(kāi)展核質(zhì)互作遺傳關(guān)系和細(xì)胞質(zhì)遺傳機(jī)制研究的理想材料[1]。目前小麥族內(nèi)已有100多個(gè)種的細(xì)胞質(zhì)通過(guò)這個(gè)方法向普通小麥轉(zhuǎn)移。K型不育系是將普通小麥的細(xì)胞核導(dǎo)入粘果山羊草的細(xì)胞質(zhì)中創(chuàng)制而成，在育種實(shí)踐中，后代產(chǎn)生頻率不等的單倍體，嚴(yán)重制約K型不育系在小麥育種中的應(yīng)用，雖然后代的農(nóng)藝特征無(wú)明顯的負(fù)作用[2]，但是對(duì)于利用K型不育系配制雜交種來(lái)說(shuō)，后代產(chǎn)生頻率不等的單倍體是一個(gè)不利因素。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，由于正常的1BS染色體臂被黑麥的1RS染色體臂代換，1RS染色體臂上的基因與特定的異源細(xì)胞質(zhì)互作產(chǎn)生不育[3]，推測(cè)可能在組培過(guò)程中，1BL/1RS易位染色體上的基因能加速胚胎和愈傷組織的生長(zhǎng)，從而提高由小孢子生成單倍體的頻率[1，4]。因此，研究核質(zhì)互作遺傳效應(yīng)高比例的誘導(dǎo)小麥單倍體的機(jī)制，有利于拓展異源細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)小麥單倍體技術(shù)在小麥育種實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值。

在細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中，著絲粒區(qū)特異的組蛋白H3（CenH3）與動(dòng)粒蛋白結(jié)合，在紡錘絲的牽引下正確移動(dòng)至細(xì)胞兩極[5]。著絲粒組蛋白H3發(fā)生某些修飾或者突變從而導(dǎo)致染色體錯(cuò)分裂，產(chǎn)生非整倍體或者單倍體子代[6]。著絲粒DNA序列一般由夾雜排列的衛(wèi)星DNA串聯(lián)重復(fù)陣列（tandem repeat，TR）和著絲粒專(zhuān)一的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（centromere retrotransposons，CRs）構(gòu)成。著絲粒組蛋白存在于整個(gè)細(xì)胞周期中，通過(guò)鑒別與著絲粒組蛋白相互作用的DNA序列可確定功能著絲粒的邊界和大小[7]。著絲粒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子也能反過(guò)來(lái)定位包含著絲粒組蛋白的核小體的分布方式[8]，甚至在著絲粒組蛋白失活或者缺失時(shí)，由于密集分布的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子替代著絲粒組蛋白的功能協(xié)助染色體正確分離[9-10]，二者間相互作用確保了染色體正確分離，由此可見(jiàn)，著絲粒DNA序列在指導(dǎo)染色體正確分離的過(guò)程中有著重要作用，著絲粒DNA序列雖然功能上高度保守，但在序列組成水平上卻高度不保守，這也成為著絲粒研究中的一個(gè)未解之謎[11]。

本研究應(yīng)用熒光原位雜交（FISH）和基因組原位雜交（GISH）檢測(cè)K型不育系YM3、YN1、YJ3、K-Salmon及其保持系的染色體組成，分析不同材料中染色體組成的差異；其次將K型不育系及其保持系配制雜交組合，應(yīng)用FISH、GISH技術(shù)檢測(cè)后代的染色體組成，探討不同細(xì)胞質(zhì)中1BL/1RS易位染色體和后代產(chǎn)生單倍體的相關(guān)性；最后將K-Salmon分別和中國(guó)春、H4104配制雜交組合，進(jìn)一步分析K-Salmon的雜交后代中高頻率產(chǎn)生單倍體的機(jī)制，為進(jìn)一步探討著絲粒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在染色體正確分離和穩(wěn)定遺傳中的作用機(jī)制提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為小麥K型不育系YM3、YN1、YJ3、K-Salmon及其保持系和中國(guó)春、H4104易位系，均由中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所韓方普教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2017—2019年先后在中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.2.1 中期染色體的制備 根尖細(xì)胞中期染色體的制備、探針標(biāo)記方法以及原位雜交程序均按照HAN等[12]描述的方法進(jìn)行。首先，每份材料中分別選取約20粒種子，將挑選好的籽粒飽滿(mǎn)的種子在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，待根長(zhǎng)長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，剪取生長(zhǎng)旺盛的根尖，用果膠酶和纖維素酶的混合溶液37℃消化50 min，然后用70%的酒精洗2次，搗碎，離心，100%的乙酸溶解，滴片。

1.2.2 原位雜交技術(shù) 植物總DNA的提取采用CTAB法[13]，利用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品DNA濃度，并統(tǒng)一稀釋至終濃度為100 ng/μL。

原位雜交程序按照HAN等[12]描述的方法進(jìn)行，在GISH分析中，提取中間偃麥草的基因組DNA，用fluorescein-12-dUTP標(biāo)記為綠色，小麥的著絲粒逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子用Texas red-5-dCTP標(biāo)記為紅色，用中國(guó)春基因組DNA作為封阻；在FISH分析中，pAs1探針的信號(hào)標(biāo)記為紅色，pAWRC.1探針的信號(hào)標(biāo)記為綠色。細(xì)胞學(xué)鏡檢采用OLYMPUSBX60熒光顯微鏡觀察，用Photo-metrics SenSys CCD成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞學(xué)篩查K型不育系材料的染色體組成分析

在育種實(shí)踐中，將普通小麥的細(xì)胞核導(dǎo)入粘果山羊草（Aegilops caudata）的細(xì)胞質(zhì)中，獲得K型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，在利用K型不育系配制雜交種時(shí)，檢測(cè)到后代有頻率不等的單倍體產(chǎn)生，因而，嚴(yán)重制約K型雄性不育系在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。為此，本試驗(yàn)檢測(cè)K型不育系的染色體組成發(fā)現(xiàn)，雖然K型細(xì)胞質(zhì)能使普通小麥Salmon出現(xiàn)高達(dá)80%的單倍體，但后代的農(nóng)藝特征無(wú)明顯的負(fù)作用[2]，這是迄今為止任何單倍體育種技術(shù)都難以比擬的。而且這樣誘導(dǎo)的單倍體種子，一般均能正常發(fā)芽，生長(zhǎng)發(fā)育良好，加倍方便[14]。為此，本試驗(yàn)深入研究不同K型不育系的染色體組成及著絲粒的特點(diǎn)。首先，采用GISH和順序FISH的方法檢測(cè)不同K型不育系的染色體組成。以重復(fù)序列pAs1和黑麥基因組DNA為探針進(jìn)行GISH、FISH分析（圖1）。

在12份材料中檢測(cè)到只有YM3和YM3B不含1BL/1RS易位染色體，其余所有材料均含有1BL/1RS易位染色體，同時(shí)應(yīng)用重復(fù)序列pAs1和黑麥重復(fù)序列為探針進(jìn)行FISH分析，結(jié)果表明，1BL/1RS易位染色體的著絲粒區(qū)域出現(xiàn)2個(gè)信號(hào)，小麥和黑麥著絲粒DNA序列的信號(hào)均被檢測(cè)到，檢測(cè)結(jié)果和前期關(guān)于1BL/1RS易位染色體著絲粒的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一致[15-16]，1BL/1RS易位染色體進(jìn)入粘果山羊草的細(xì)胞質(zhì)后，染色體組成未發(fā)生改變。對(duì)比幾個(gè)K型不育系材料的染色體組成可以發(fā)現(xiàn)，按是否含有1BL/1RS易位染色體將K型不育系分為含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系和不含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系；在育種實(shí)踐中研究發(fā)現(xiàn)，含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系雜交后代會(huì)出現(xiàn)一定比例的單倍體，而不含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系的雜交后代幾乎不產(chǎn)生單倍體。因此，1BL/1RS易位染色體可能在K型不育系誘導(dǎo)單倍體產(chǎn)生的過(guò)程中起了重要的作用。

2.2 細(xì)胞學(xué)篩查K型不育系雜交后代的染色體組成分析

在小麥單倍體育種研究中，通過(guò)對(duì)單倍體的誘導(dǎo)和加倍，植株快速純合，有效縮短育種周期，提高育種效率，是小麥育種中快速有效的方法之一。然而，在育種實(shí)踐中，無(wú)論體內(nèi)誘導(dǎo)還是離體培養(yǎng)，獲得單倍體的誘導(dǎo)率和加倍率均不足10%，嚴(yán)重制約小麥單倍體育種在實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值。在創(chuàng)制雜種小麥的育種實(shí)踐中，將小麥的細(xì)胞核導(dǎo)入粘果山羊草的細(xì)胞質(zhì)后，意外發(fā)現(xiàn)后代產(chǎn)生頻率不等的單倍體，有的K型不育系單倍體頻率甚至達(dá)到80%[4]。為了進(jìn)一步研究K型不育系和保持系雜交后代的染色體組成，本研究配制了6種雜交組合，每個(gè)雜交組合的后代檢測(cè)35粒左右，采用GISH和順序FISH的方法檢測(cè)這6種雜交組合后代的染色體組成。后代染色體組成情況如表1所示。

表1 K型不育系不同雜交組合的后代染色體組成%

由表1可知，YM3和YM3B的雜交組合不產(chǎn)生單倍體和雙生苗，可以在雜交小麥選育中廣泛應(yīng)用。YN1、YN1B和YJ3、YJ3B雜交組合產(chǎn)生一定比例的單倍體后代，但是未發(fā)現(xiàn)有雙生苗的情況。而K-Salmon和Salmon的雜交組合中，后代不僅有正常的整數(shù)倍體和單倍體，還發(fā)現(xiàn)有雙生苗的情況，而且比例較高。于是，本研究進(jìn)一步配制雜交組合K-Salmon和H4104（含有1BL/1RS易位染色體）、中國(guó)春的雜交組合，檢測(cè)后代的染色體組成。結(jié)果表明，雜交后代中出現(xiàn)相似比例的單倍體和雙生苗，并進(jìn)一步檢測(cè)單倍體和雙生苗中1BL/1RS易位染色體著絲粒的組成特點(diǎn)，如圖2所示，單倍體和雙生苗中的1BL/1RS易位染色體著絲粒組成和小麥細(xì)胞質(zhì)中的1BL/1RS易位染色體的融合著絲粒一致（圖2），小麥著絲粒DNA和黑麥著絲粒DNA均被檢測(cè)到。

3 結(jié)論與討論

在育種實(shí)踐中，將普通小麥的細(xì)胞核導(dǎo)入粘果山羊草的細(xì)胞質(zhì)中，獲得的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在雜交小麥的育種中起重要作用。然而，在利用K型不育系配制雜交種時(shí)，因后代出現(xiàn)比例不等的單倍體制約K型雄性不育系在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，雖然K型細(xì)胞質(zhì)能使普通小麥出現(xiàn)較高比例的單倍體，但后代的農(nóng)藝特征無(wú)明顯的負(fù)作用[2]，這是迄今為止任何單倍體育種技術(shù)都難以比擬的，而且這樣誘導(dǎo)的單倍體種子，一般均能正常發(fā)芽，生長(zhǎng)發(fā)育良好，加倍方便[14]。1BL/1RS易位系是小麥育種中應(yīng)用最多、最成功的易位系，將黑麥1RS染色體片段攜帶的抗白粉病、銹病等多種病害及豐產(chǎn)、廣適性等優(yōu)良性狀的基因轉(zhuǎn)移到小麥中。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，1BL/1RS易位染色體在六倍體小麥背景中能穩(wěn)定遺傳[15-16]，通過(guò)對(duì)山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心小麥課題組收集的近110份含1BL/1RS易位染色體的小麥材料，發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞質(zhì)中易位染色體的融合著絲粒均由小麥著絲粒組蛋白H3負(fù)責(zé)招募小麥和黑麥的部分著絲粒DNA序列[15]。為了深入分析K型不育系中1BL/1RS易位染色體在雜交后代中的作用機(jī)制，本研究篩查了10份K型不育系及其后代的染色體組成情況，發(fā)現(xiàn)不含1BL/1RS易位染色體的K型不育系和保持系雜交后代中沒(méi)有單倍體子代，而含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系和保持系雜交后代中出現(xiàn)一定比例的單倍體，特別是一種含有1BL/1RS易位染色體的K-Salmon不育系和保持系雜交后代中出現(xiàn)更高比例的單倍體，同時(shí)還有一定比例的雙生苗，并應(yīng)用FISH和GISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1BL/1RS易位染色體無(wú)論在單倍體還是雙生苗中，染色體和著絲粒的組成沒(méi)有發(fā)生改變，由此可見(jiàn)，1BL/1RS易位染色體的著絲粒在K型不育系誘導(dǎo)單倍體的過(guò)程中起重要的作用。研究1BL/1RS易位染色體和K型細(xì)胞質(zhì)的互作遺傳效應(yīng)高比例誘導(dǎo)小麥單倍體的機(jī)制，可以進(jìn)一步拓展異源細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)小麥單倍體技術(shù)在小麥育種實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，著絲粒和特異性的蛋白結(jié)合成動(dòng)粒，在細(xì)胞分裂過(guò)程中成為紡錘絲牽引附著的主要位點(diǎn)[5]。著絲粒組蛋白H3與典型組蛋白H3結(jié)構(gòu)不同，它是較早發(fā)現(xiàn)的功能著絲粒的核心蛋白，其N(xiāo)末端在長(zhǎng)度和氨基酸組成方面變異程度較高[17-20]。著絲粒組蛋白H3不僅能導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂紊亂，還和外源染色體在寄主基因組中的去留有聯(lián)系[15]。著絲粒DNA序列是植物甚至真核生物進(jìn)化最快的序列之一，即便在親源關(guān)系非常近的物種中，著絲粒的DNA序列長(zhǎng)度或組成可能完全不同。通過(guò)對(duì)著絲粒序列的分析，初步認(rèn)為著絲粒序列結(jié)構(gòu)主要由重復(fù)序列和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子組成，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增和插入又會(huì)產(chǎn)生新的重復(fù)序列[21]。相比衛(wèi)星重復(fù)序列，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子更保守一些，如：Ty3-gypsy是著絲粒專(zhuān)一的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族[22]，著絲粒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能夠定位包含著絲粒組蛋白H3的核小體的分布方式[23]，甚至在CenH3失活或者缺失時(shí)，染色體依然能正常分離[24]，推測(cè)著絲粒反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子起主要作用，這種推測(cè)在隨后關(guān)于Holocentricity的研究中得到證實(shí)，在動(dòng)物和植物中都發(fā)現(xiàn)部分物種中著絲粒缺失著絲粒組蛋白H3，由于密集分布的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子替代著絲粒組蛋白H3的功能協(xié)助染色體正確分離。在小麥中，基因克隆和定位研究發(fā)現(xiàn)，CenH3基因位于第一同源群[25]，1BL/1RS易位染色體的著絲粒由小麥和黑麥的部分著絲粒DNA序列構(gòu)成[16，26]，易位染色體在普通小麥中能正確分離、穩(wěn)定遺傳，但是，在K型細(xì)胞質(zhì)中卻高頻誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體。因此，研究著絲粒序列協(xié)同著絲粒組蛋白H3指導(dǎo)1BL/1RS易位染色體在K型細(xì)胞質(zhì)中分離，探究其作用方式為揭示異源細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的機(jī)制提供理論支持。本研究應(yīng)用FISH和GISH技術(shù)，篩查6個(gè)雜交組合的親本及其后代的染色體組成規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)，所有檢測(cè)樣品中易位染色體均為融合著絲粒；篩查配制的雜交組合后代單倍體率，發(fā)現(xiàn)只有含有1BL/1RS易位染色體的K型不育系才產(chǎn)生單倍體，特別是K-Salmon不育系無(wú)論和保持系還是其他含有1BL/1RS易位染色體的小麥雜交，都產(chǎn)生比例很高的單倍體，包括和中國(guó)春雜交，單倍體率也很高，但是本研究各種雜交組合的單倍體率沒(méi)有篩查到80%以上的情況，推測(cè)可能是研究中采用的不育系材料為高代材料，在不斷的保種過(guò)程中1BL/1RS易位染色體的著絲粒DNA序列和K型細(xì)胞質(zhì)逐漸共存協(xié)同作用指導(dǎo)易位染色體分離。

然而，由于著絲粒結(jié)構(gòu)特殊，指導(dǎo)染色體的分離不僅和著絲粒組蛋白H3有關(guān)，還和著絲粒DNA有密切關(guān)系，著絲粒區(qū)域的DNA序列組成及其功能的解析至今依然是研究難點(diǎn)之一[24]。1BL/1RS易位染色體在小麥背景中能穩(wěn)定遺傳，但是異質(zhì)到K型細(xì)胞質(zhì)后產(chǎn)生比例不等的單倍體，由此可見(jiàn)，黑麥的部分染色體片數(shù)和K型細(xì)胞質(zhì)的互作是后代產(chǎn)生高比例單倍體和雙生苗的重要原因，但是黑麥染色體片斷以及著絲粒DNA序列的組成等方面是否發(fā)生變化還需要結(jié)合CHIP等技術(shù)做進(jìn)一步的遺傳和表觀遺傳學(xué)研究。其次，在一些模式植物的研究中發(fā)現(xiàn)，由于父本著絲粒組蛋白H3在合子中失活而逐漸丟失產(chǎn)生單倍體后代，然而關(guān)于著絲粒DNA何時(shí)參與或者取代著絲粒組蛋白H3指導(dǎo)染色體分離的研究卻很少[27]。因此，今后對(duì)易位染色體著絲粒DNA序列做進(jìn)一步遺傳和表觀遺傳分析，將有助于理解著絲粒DNA序列指導(dǎo)染色體分離的機(jī)制。