參苓白術(shù)散聯(lián)合二甲雙胍對糖尿病肥胖患者腸道菌群的影響及不良反應(yīng)觀察

蔣海燕,葛鎖華,于雪冰,孫露陽,彭俊華

(1.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 常州 213200;2.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院內(nèi)分泌科,江蘇 常州 213200)

近年來,腸道菌群與疾病間的關(guān)系成為一個研究熱點(diǎn)。研究表明,2型糖尿病(T2DM,type 2 diabetic mellitus)患者的腸道菌群與胰島素抵抗(IR,insulin resistance)相關(guān)[1],調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群可治療T2DM[2]。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病是由于機(jī)體脾胃虧虛、痰濁內(nèi)生、陰火內(nèi)伏而導(dǎo)致的[3],中醫(yī)的“脾”可能與腸道菌群失調(diào)相關(guān)[4],因此,中醫(yī)通過益氣健脾、除濕升陽來治療糖尿病。用健脾疏肝方聯(lián)合針灸療法,通過調(diào)節(jié)腸道菌群能有效治療腹瀉型腸易激綜合征患者[4]。參苓白術(shù)散具有健脾、益氣、滲濕的功效,通過調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡,能有效治療多種類型的腹瀉[5-7]。二甲雙胍通過調(diào)節(jié)腸道菌群治療糖尿病[8],聯(lián)合針刺能有效改善糖尿病早期患者的糖代謝[9]。通過參苓白術(shù)散與二甲雙胍聯(lián)合用藥治療T2DM肥胖患者,觀察腸道菌群的改變、腸道菌群與糖化血紅蛋白間的相關(guān)性及其用藥后的不良反應(yīng)情況,為中西醫(yī)聯(lián)合治療T2DM提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象及標(biāo)準(zhǔn)

挑選明確診斷為輕中程度T2DM的肥胖患者84例,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。研究為前瞻性橫斷面設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)組用參苓白術(shù)散聯(lián)合二甲雙胍治療,對照組用二甲雙胍治療,參照《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[10]標(biāo)準(zhǔn)診斷T2DM。將研究計(jì)劃告知研究對象并簽訂同意書,研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后執(zhí)行。

入組標(biāo)準(zhǔn):體脂指數(shù)(BMI,body mass index)≥25.0,空腹血糖≥7.0 mmol/L或隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L,存在糖尿病臨床癥狀。

排除標(biāo)準(zhǔn):排除惡性腫瘤者、心肝腎功能受損者、消化系統(tǒng)自身免疫性疾病患者、用抗生素治療者、腹瀉患者、腸道疾病或腸道功能明顯異常者、服用影響腸道菌群藥物者、對參苓白術(shù)散或二甲雙胍過敏者、治療中依從性差及中途退出者。

實(shí)驗(yàn)組:男性23例,女性19例,平均年齡為(54.7±10.6)歲,平均BMI為(26.2±2.4)。對照組:男性22例,女性20例,平均年齡為(55.2±10.2)歲,平均BMI為(26.1±2.7)。2組在年齡、性別、BMI間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 治療方案及分組

對所有入組參加實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行糖尿病知識宣教,制定治療計(jì)劃、告知并簽訂同意書,治療時間持續(xù)6個月。治療方案:對照組為二甲雙胍(常州制藥廠有限公司、國藥準(zhǔn)字號H20054786),口服,0.5 g/次、3次/日。實(shí)驗(yàn)組是在對照組用藥基礎(chǔ)上增加參苓白術(shù)散(北京同仁堂制藥廠、國藥準(zhǔn)字號Z11020755),口服,6 g/次、3次/日。其他治療方案2組均相同。

1.3 大便標(biāo)本采集與BMI采集

分別于治療開始、治療1周、治療3個月、治療6個月時,用一次性棉簽采集研究對象清晨排出的大便約50 g于無菌便盒中30 min內(nèi)送檢。分裝約30 g大便,標(biāo)記,-80 ℃保存。

用標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用身高體重稱計(jì)量研究對象的身高、體重,每次測量重復(fù)3次,取平均值,按BMI=體重(kg)/身高2(m2)計(jì)算。

1.4 血清空腹血糖、胰島素及HbA1c的測定

分別于治療前、治療1周、治療3個月、治療6個月時采集研究對象的空腹靜脈血,HbA1c用EDTA真空抗凝管采血并及時測定,其他標(biāo)本用干燥真空管采血、經(jīng)4 000 r/min離心并分離血清,置-80 ℃?zhèn)溆谩？崭蛊咸烟?FG,free glucose,貝克曼配套試劑)水平用貝克曼AU5800生化分析儀(美國)檢測,空腹血胰島素(Ins,insulin,貝克曼配套試劑)水平用貝克曼DX800I化學(xué)發(fā)光儀(美國)檢測。糖化血紅蛋白(HbA1c,配套試劑)水平用高效液相色譜法(HPLC)伯樂糖化血紅蛋白測定儀(美國)檢測。所有檢測按試劑盒說明書操作,質(zhì)控合格后測定樣本。

1.5 腸道菌群DNA數(shù)量的檢測

按實(shí)驗(yàn)所選3種腸道菌群各自的16S rDNA 基因序列合成引物[3],引物序列為:雙歧桿菌:上游GGTTCTGAGAGGAGGTCCC,下游CCACATCCAGCATCCAC;擬桿菌:上游 CTGAACCAGCCAAGTAGCG,下游CCGCAAACTTTCACAAC-TGACTTA;腸球菌屬:上游CCCTTATTGTTAG-TTGCCATCATT,下游ACTCGTTGTACTTCC-CATTGT。

大便DNA提取試劑盒(TIANGEN)按說明書操作,提取大便中腸道菌群基因組DNA。將3種標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA分別制成108copies/mL、107copies/mL、106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL,作陽性DNA曲線。檢測標(biāo)本為提取的待測大便DNA,陰性對照用滅菌純水代替DNA。取1.5 μL DNA、上游和下游引物各0.5 μL,再加入PCR試劑盒(ABI產(chǎn)品,美國)其他成分,構(gòu)成25.0 μL反應(yīng)體系,用Stepone Plus實(shí)時熒光定量PCR儀(ABI產(chǎn)品,美國)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件:樣本先于95 ℃反應(yīng)10 min,然后再以94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s 作用40個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后,查看曲線并分析產(chǎn)物的特異性,根據(jù)儀器讀取的熒光值、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品 Ct 值,儀器自動計(jì)算出樣品中細(xì)菌DNA的含量。測定結(jié)果以每克大便中DNA拷貝數(shù)(copies)的對數(shù)值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 T2DM肥胖患者用藥治療后血清FG、Ins及HbA1c水平

與同組治療前比較,治療后T2DM肥胖患者血液中FG和HbA1c水平降低、Ins水平升高;與治療3個月比較,治療6個月T2DM肥胖患者血Ins水平明顯提高、血FG和HbA1c水平明顯降低,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1、表1)。與對照組同時相點(diǎn)比較,實(shí)驗(yàn)組在治療3個月時T2DM肥胖患者血FG和HbA1c水平明顯降低、血Ins水平明顯增高(P<0.05,見圖1、表1)。

注:a表示與同組治療前比較P<0.05;b表示與同組治療3個月比較P<0.05;c表示與同組治療3個月比較P<0.05;1表示與對照組同時相點(diǎn)比較P<0.05。

表1 T2DM肥胖患者用藥后腸道菌群中細(xì)菌DNA數(shù)量及血HbA1c的改變(n=42)

2.2 T2DM肥胖患者用藥后腸道菌群中細(xì)菌DNA數(shù)量的改變

與同組用藥治療前比較,治療3個月后T2DM肥胖患者大便中雙歧桿菌及擬桿菌的DNA數(shù)量明顯增多,治療6個月大便中雙歧桿菌及擬桿菌的DNA數(shù)量較同組治療3個月明顯增多(P<0.05,見表1)。同組比較,腸球菌DNA數(shù)量在治療后呈降低趨勢,治療6個月后明顯低于用藥前(P<0.05)。與對照組同時相點(diǎn)比較,實(shí)驗(yàn)組用藥6個月T2DM患者大便中雙歧桿菌及擬桿菌的DNA數(shù)量明顯升高、腸球菌DNA數(shù)量明顯降低,實(shí)驗(yàn)組雙歧桿菌在用藥3個月時明顯增加(P<0.05,見表1) 。

2.3 T2DM肥胖患者血HbA1c水平與腸道菌群DNA數(shù)量間的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)分析,T2DM肥胖患者血清中HbA1c水平與大便中雙歧桿菌 DNA數(shù)量(r=-0.611,P=0.017)、擬桿菌DNA數(shù)量(r=-0.327,P=0.013)呈負(fù)相關(guān),與大便中腸球菌 DNA數(shù)量(r=0.237,P=0.036)呈正相關(guān)。

2.4 T2DM肥胖患者聯(lián)合用藥后的不良反應(yīng)事件

在實(shí)驗(yàn)過程中,觀察到患者用藥后出現(xiàn)便秘、惡心嘔吐、乏力倦怠、肝腎功能受損等不良反應(yīng)事件,其中實(shí)驗(yàn)組分別為3人、2人、2人、0人,對照組分別為2人、3人、4人、1人,2組間沒有明顯差異(χ2=2.59,P=0.63)。

3 討論

隨著人們生活方式的改變,全球肥胖、T2DM患者人數(shù)增長迅速,防治上述等慢性疾病的問題也日益突出。

正常人體腸道內(nèi)定植著1 000多種、數(shù)量達(dá)1014個、質(zhì)量約1.5 kg的微生物群落,統(tǒng)稱腸道菌群。腸道菌群中微生物種類、數(shù)量等的改變,即腸道菌群失衡,會引發(fā)機(jī)體免疫功能、條件致病菌與炎癥因子的改變,宿主能量代謝發(fā)生變化,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)多種疾病,如炎癥性腸病、糖尿病、慢性肥胖、炎癥脂代謝異常、心血管疾病、腫瘤等[11]。

二甲雙胍是指南[10]中推薦的首選治療糖尿病藥物,二甲雙胍能夠調(diào)節(jié)腸道菌群、增加益生菌如布勞特菌和糞腸桿菌的數(shù)量[8]、增加短鏈脂肪酸的含量,更好地發(fā)揮降血糖、降血脂、減體重的作用[9,12-13]。研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍治療T2DM肥胖患者,對照組在用藥治療后患者血液中FG水平明顯降低、Ins水平明顯增高,且治療3個月后T2DM肥胖患者大便中雙歧桿菌的DNA數(shù)量明顯增多、血HbA1c水平明顯降低,治療6個月時T2DM肥胖患者大便中腸球菌數(shù)量明顯降低、擬桿菌數(shù)量明顯增多。這些結(jié)果表明,二甲雙胍具有很好的降血糖、提升胰島素水平的作用,治療達(dá)到一定時間后,能改變腸道菌群的結(jié)構(gòu),使雙歧桿菌和擬桿菌數(shù)量明顯增多,腸球菌數(shù)量減少,表明二甲雙胍通過調(diào)整腸道菌群的結(jié)構(gòu)起到了治療糖尿病的效果[8,13]。

腸道菌群是中藥治療糖尿病的潛在靶點(diǎn),所調(diào)節(jié)腸道菌群主要包括:增加腸道菌群的多樣性、降低硬壁菌/擬桿菌值[14];增加抗炎癥細(xì)菌數(shù)量,如雙歧桿菌、乳酸桿菌、艾克曼菌、糞桿菌等[15];增加產(chǎn)短鏈脂肪酸的細(xì)菌[15];減少病原性細(xì)菌數(shù)量,如大腸埃希氏菌及腸球菌等[13]。最終通過抗炎癥作用、抗氧化作用、保護(hù)腸道屏障、抑制脂毒性等多個方面在治療T2DM中發(fā)揮效果[16]。參苓白術(shù)散中含有人參,而人參多糖和人參皂苷Rb1具有抗糖尿病效果[17]。參苓白術(shù)散具有益氣補(bǔ)脾、化濕止泄的功效,能有效治療脾虛型腹瀉[5]、抗生素致菌群失調(diào)性腹瀉[6],具有調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高益生菌構(gòu)成的作用[7,14]。含人參、白術(shù)、茯苓的方劑參術(shù)調(diào)脾散通過減少腸球菌數(shù)量、降低硬壁菌/擬桿菌值能有效治療T2DM[15]。研究發(fā)現(xiàn),與對照組同時相點(diǎn)比較,實(shí)驗(yàn)組在治療3個月后 T2DM肥胖患者血糖和HbA1c水平及治療6個月時大便中腸球菌DNA數(shù)量明顯降低,實(shí)驗(yàn)組在治療3個月后血Ins、大便中雙歧桿菌的DNA數(shù)量明顯增高,但實(shí)驗(yàn)組與對照組間總的不良反應(yīng)沒有差異。這些結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組治療糖尿病效果更佳,且調(diào)整腸道菌群的作用也優(yōu)于對照組。相關(guān)分析的結(jié)果顯示,T2DM肥胖患者血HbA1c水平與大便中雙歧桿菌和擬桿菌的DNA數(shù)量呈負(fù)相關(guān)、與腸球菌的DNA數(shù)量呈正相關(guān),說明通過調(diào)整腸道菌群的構(gòu)成可以治療糖尿病,且聯(lián)合用藥(實(shí)驗(yàn)組)優(yōu)于單用藥物(對照組),進(jìn)一步證明通過調(diào)節(jié)腸道菌群可治療糖尿病。

總之,中西藥聯(lián)合治療T2DM肥胖患者能有效降低患者FG和HbA1c的水平、提高血Ins水平,治療效果優(yōu)于單用二甲雙胍,這種治療效果可能與調(diào)節(jié)患者的腸道菌群、特別是提高大便中有益菌如雙歧桿菌和擬桿菌數(shù)量、降低病原性細(xì)菌如腸球菌數(shù)量相關(guān)。