分子動(dòng)力學(xué)模擬分析巴利昔凍干保護(hù)劑的活性保護(hù)機(jī)制

俞小娟，于傳飛，房森彪，王蘭

·論著·

分子動(dòng)力學(xué)模擬分析巴利昔凍干保護(hù)劑的活性保護(hù)機(jī)制

俞小娟，于傳飛，房森彪，王蘭

102629 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定及標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（俞小娟、于傳飛、王蘭）；100191 北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物與仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（俞小娟）；410083 長(zhǎng)沙，中南大學(xué)計(jì)算機(jī)學(xué)院（房森彪）

研究巴利昔單抗制劑中凍干保護(hù)劑蔗糖、甘氨酸、甘露醇的作用機(jī)制。

使用 Gromacs5.0.5 工具包，在 300K 的體系條件下，運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬的方法，搭建模型，分別模擬分析了天然狀態(tài)、干燥狀態(tài)和添加復(fù)合保護(hù)劑的狀態(tài)下的巴利昔-Fab分子結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度比較并分析凍干保護(hù)劑對(duì)巴利昔制劑的保護(hù)機(jī)制。

干燥狀態(tài)時(shí)，巴利昔分子的活性結(jié)構(gòu)會(huì)有明顯塌陷，無(wú)規(guī)則卷曲數(shù)目明顯增多，分子間氫鍵數(shù)目減少，表面靜電性質(zhì)也會(huì)因此有所變化，而在蔗糖、甘氨酸和甘露醇復(fù)合保護(hù)劑存在的情況下，以上情況能明顯得到改善，從而抑制巴利昔由于干燥失水而導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)塌縮和變性失活。

蔗糖、甘氨酸和甘露醇復(fù)合保護(hù)劑的使用能很好地保護(hù)巴利昔凍干制劑的活性。

巴利昔單克隆抗體； 活性結(jié)構(gòu)； 保護(hù)機(jī)制； 分子動(dòng)力學(xué)； 保護(hù)劑

巴利昔是以 CD25 為靶點(diǎn)的單克隆抗體藥物，可以徹底抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)中由 IL-2 介導(dǎo)的關(guān)鍵信號(hào)通路，從而達(dá)到抗免疫排斥的作用。因此被廣泛用于預(yù)防器官移植后的排斥反應(yīng)[1-5]，商品化的巴利昔單抗（舒萊）是白色凍干塊狀物，在制劑的生產(chǎn)和凍干過(guò)程中，為了保護(hù)蛋白分子的活性，加入了蔗糖、甘氨酸、甘露醇等輔料，作為凍干保護(hù)劑。

蔗糖是蛋白質(zhì)的非特異性穩(wěn)定劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，多呈無(wú)定型結(jié)構(gòu)，可在蛋白質(zhì)表面形成單分子層，對(duì)阻止單抗制劑在凍干處理過(guò)程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變及貨架期內(nèi)蛋白質(zhì)的伸展和聚集起顯著的保護(hù)作用[6]。甘氨酸在凍干的過(guò)程中可通過(guò)抑制蛋白質(zhì)制劑中磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致 pH 值的改變而阻止藥物的變性，阻止因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)塌陷而引起的藥物的破壞[7]。1% 或更低濃度的甘露醇可通過(guò)無(wú)定型結(jié)構(gòu)的形成阻止蛋白質(zhì)藥物的聚集[8]。

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)藥物被開(kāi)發(fā)出來(lái)，凍干制劑有著穩(wěn)定、便于運(yùn)輸、儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，在生物制品的凍干工藝中，為特定的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物設(shè)計(jì)凍干保護(hù)劑和凍干方法是一項(xiàng)關(guān)鍵的工作。常用的凍干保護(hù)劑包括多羥基化合物、糖、氨基酸、聚合物以及吐溫等，聯(lián)合使用不同類(lèi)型的保護(hù)劑可獲得穩(wěn)定性更佳的凍干制品[9]。

目前，凍干保護(hù)劑的開(kāi)發(fā)主要是基于傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的重復(fù)試錯(cuò)。近年來(lái)，對(duì)于凍干保護(hù)劑及其保護(hù)機(jī)制的研究越來(lái)越深入，特別是隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，在已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)數(shù)學(xué)建模的方式，對(duì)凍干過(guò)程中物料的真實(shí)狀態(tài)進(jìn)行模擬解析，可以為凍干技術(shù)的完善與提高提供理論依據(jù)[10]。針對(duì)不同的生物制劑，開(kāi)發(fā)更加優(yōu)越的凍干保護(hù)劑，提高蛋白質(zhì)藥物凍干制品的質(zhì)量，是目前亟需解決的問(wèn)題，也是現(xiàn)今生物技術(shù)藥物研究的重點(diǎn)方向。

本文運(yùn)用計(jì)算機(jī)建模的方法，模擬了干燥狀態(tài)下蔗糖、甘氨酸和甘露醇與巴利昔單抗的相互作用的方式及其活性結(jié)構(gòu)變化，從不同角度分析了蔗糖、甘氨酸和甘露醇復(fù)合保護(hù)劑對(duì)巴利昔單抗的活性保護(hù)效果及保護(hù)機(jī)制，從而為開(kāi)發(fā)更具科學(xué)性和邏輯性的凍干工藝提供新的方法以及理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

巴利昔-Fab 的結(jié)構(gòu)信息來(lái)自 PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫(kù)http://www. rcsb.org/；蔗糖、甘氨酸和甘露醇的分子結(jié)構(gòu)由Gaussview 5.0 構(gòu)建；小分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化軟件使用 Gaussian 09 軟件包；小分子對(duì)接軟件使用Autodock；分子動(dòng)力學(xué)軟件使用 Gromacs 5.0.5。

1.2 方法

1.2.1 獲取巴利昔、甘氨酸、甘露醇和蔗糖的三維結(jié)構(gòu) 巴利昔蛋白上的抗體結(jié)合區(qū)域，又稱 Fab 區(qū)域（抗原結(jié)合片段，每個(gè) IgG 單抗分子含有2 個(gè) Fab）。分子的天然原始結(jié)構(gòu)（圖 1A）來(lái)自蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，ID：3IU3）[11]，通過(guò)添加氯離子來(lái)平衡巴利昔-Fab 分子所帶的凈電荷（+5e）。蔗糖、甘氨酸和甘露醇的分子結(jié)構(gòu)通過(guò) Gaussview 5.0 構(gòu)建并使用 Gaussian 09 軟件包[12-13]，采用 B3LYP/6-311++G**方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化至收斂，優(yōu)化后的分子結(jié)構(gòu)如圖 1B、C、D所示。

1.2.2 建模及分子動(dòng)力學(xué)模擬 使用 Gromacs 5.0.5 工具包在恒溫恒容（NVT）的條件下模擬了蔗糖、甘氨酸和甘露醇與巴利昔-Fab 分子在真空環(huán)境中的相互作用。分別構(gòu)建三種模擬體系，即：天然狀態(tài)巴利昔-Fab 分子（Control）；干燥狀態(tài)下巴利昔-Fab 分子（Dry）；干燥狀態(tài)下巴利昔-Fab分子+保護(hù)劑（蔗糖、甘氨酸、甘露醇）（Protectant）。另外，在凍干工藝中，巴利昔制劑最終的水分含量約為 1%。因此，為了研究的準(zhǔn)確性，同樣向模擬體系中添加了相應(yīng)含量的水分子。Protectant 體系中含有 1 個(gè)巴利昔-Fab 蛋白分子，16 個(gè)水分子，以及 535 個(gè)甘氨酸、535 個(gè)蔗糖和 535 個(gè)甘露醇分子。

巴利昔-Fab 采用 Amber99sb-ildn 力場(chǎng)[14]，保護(hù)劑分子采用 Amber 通用分子力場(chǎng)，水分子模型選擇 TIP3P 模型。分子間 Lennard-Jones 與范德華相互作用的截?cái)喟霃竭x擇 1.4 nm。靜電相互作用修正采用 Particle Mesh Ewald 方法。

首先，將巴利昔-Fab 分子初始結(jié)構(gòu)置于 10 nm × 10 nm × 10 nm 的周期性盒子中。然后，在巴利昔-Fab 分子周?chē)S機(jī)定量添加保護(hù)劑分子和水分子，并采用最速下降法進(jìn)行 1000 步結(jié)構(gòu)優(yōu)化，再以 LINear Con- straint Solver（LINCS）[15]方法限制住所有化學(xué)鍵的鍵長(zhǎng)，利用 Maxwell 分布設(shè)置體系各原子的初始速度。所有體系都在 300K 條件下進(jìn)行模擬，并采用 Velocity-rescale 方法控制體系溫度，耦合常數(shù)選為 0.1。系統(tǒng)壓力采用 Berendsen 方法維持在 1 個(gè)大氣壓左右。之后，再將準(zhǔn)備好的體系分別進(jìn)行 5 ns NVT 限制性預(yù)平衡，使體系中保護(hù)劑分子和水分子在巴利昔-Fab 周?chē)鶆蚍植?。最后，將處理好的體系模型在 NVT 系統(tǒng)下進(jìn)行 100 ns 常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬。對(duì)照組以同樣方法模擬，取模擬的最后 10 ns 軌跡進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

相對(duì)自由能表征的是巴利昔-Fab 分子在不同體系下的熱穩(wěn)定性，該自由能由 Boltzman function 計(jì)算，公式如下：() = –× ln(()) +其中()表示巴利昔-Fab 分子不同構(gòu)象出現(xiàn)的概率，為常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合凍干保護(hù)劑對(duì)巴利昔-Fab 分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

均方根偏差（RMSD）反映的是特定的構(gòu)象與初始結(jié)構(gòu)的偏離程度[16]，值越小表明該特定構(gòu)象與初始結(jié)構(gòu)越接近。圖 2A 為兩個(gè)體系中巴利昔-Fab 的均方根偏差隨時(shí)間變化的均值。從圖 2A 中可看出，添加了復(fù)合保護(hù)劑的巴利昔-Fab 分子（Protectant）的 RMSD 值相較于干燥狀態(tài)的巴利昔-Fab 分子（Dry）（0.40 nm）有了顯著降低，這表明在凍干狀態(tài)下蔗糖、甘氨酸和甘露醇可有效地增強(qiáng)巴利昔-Fab 分子活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使其更接近天然狀態(tài)。

圖 1 巴利昔-Fab（A）、甘氨酸（B）、甘露醇（C）和蔗糖（D）的初始三維結(jié)構(gòu)

Figure 1 Natural 3D structure of basiliximab-Fab (A), glycine (B), mannitol (C) and sucrose (D)

圖 2 各體系中巴利昔-Fab 分子的 RMSD（A）與 Rg 值（B）

Figure 2 Root-mean-square deviation (A) and gyration-radius (B) of basiliximab-Fab in different systems

圖 3 巴利昔-Fab 分子在天然、添加復(fù)合保護(hù)劑和干燥三種體系中在相對(duì)自由能最低點(diǎn)的構(gòu)象（A：三種體系中巴利昔-Fab 分子雙鏈直徑比較；B：添加復(fù)合保護(hù)劑狀態(tài)的巴利昔-Fab 分子雙鏈直徑與天然狀態(tài)的比較；C：干燥狀態(tài)的巴利昔-Fab分子雙鏈直徑與天然狀態(tài)的比較）

Figure 3 Compare of the conformation of basiliximab-Fab in natural state, with protectant and dry state in relative free energies minimal point (A: Comparison of double chain diameter value of basiliximab-Fab in three different system; B: Comparison of double chain diameter value of basiliximab-Fab in protectant and control system; C: Comparison of double chain diameter value of basiliximab-Fab in dry and control system)

回旋半徑（Rg）的定義為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中每個(gè)粒子與體系質(zhì)心距離的幾何平均值，其值反映了粒子結(jié)合的緊密程度，即粒子結(jié)合越緊密，Rg 值越小。圖 2B 為各個(gè)體系中巴利昔-Fab 分子的Rg隨時(shí)間變化的均值。從圖 2B 可知，對(duì)照組（Control）中巴利昔-Fab分子的 Rg 是 3.28 nm，不添加保護(hù)劑組的巴利昔-Fab分子 Rg 是 2.82 nm，添加復(fù)合保護(hù)劑體系下巴利昔-Fab分子的 Rg 值是 3.09 nm。可見(jiàn)，相比于對(duì)照組的天然初始結(jié)構(gòu)，巴利昔-Fab 分子在干燥狀態(tài)下，回旋半徑降低較多，這表明蛋白分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)由于水分的流失發(fā)生了塌陷和內(nèi)陷，導(dǎo)致粒子結(jié)合更緊密，分子發(fā)生形變，但是，當(dāng)添加復(fù)合保護(hù)劑時(shí)，回旋半徑的降低得到了改善，分子形變得到了抑制。

圖 3 為不同體系中巴利昔-Fab 分子在相對(duì)自由能最低點(diǎn)的構(gòu)象，其中，天然狀態(tài)下巴利昔-Fab 分子雙鏈的直徑為 4.29 nm，干燥狀態(tài)下為 3.64 nm，添加復(fù)合保護(hù)劑狀態(tài)下為 3.85 nm，表明，復(fù)合凍干劑的添加，能有效抑制巴利昔-Fab 分子構(gòu)象的改變。

2.2 不同體系中巴利昔-Fab 分子的自由能

體系內(nèi)分子間相互作用的自由能反映的是分子間相互作用力的強(qiáng)弱，即熱穩(wěn)定性，能量越低，體系越穩(wěn)定，巴利昔-Fab 分子與水分子、保護(hù)劑分子之間相互作用，通過(guò)比較各個(gè)體系內(nèi)分子間的相互作用的自由能，可評(píng)價(jià)各個(gè)體系的穩(wěn)定性。由圖 4 可知，天然狀態(tài)體系的自由能最低，添加復(fù)合保護(hù)劑的巴利昔-Fab 分子體系次之，干燥巴利昔-Fab 分子體系的自由能最高。在天然狀態(tài)中，蛋白質(zhì)、水分子、復(fù)合保護(hù)劑三者之間均存在相互作用，且保護(hù)劑具有親水性，水分子與保護(hù)劑之間存在較強(qiáng)的相互作用，降低了保護(hù)劑與抗體蛋白之間的相互作用，整個(gè)體系自由能最低，體系最為穩(wěn)定；干燥狀態(tài)下，在添加了復(fù)合保護(hù)劑的體系中，保護(hù)劑可與蛋白質(zhì)分子相互作用，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)較為穩(wěn)定；而僅有巴利昔-Fab 分子的體系在干燥狀態(tài)下，自由能急劇增加，狀態(tài)最不穩(wěn)定。

圖 4 不同模擬體系下的自由能

Figure 4 Average interaction energy in different model system

2.3 復(fù)合凍干保護(hù)劑對(duì)巴利昔-Fab 分子表面親/疏水性質(zhì)的影響

親/疏水表面積指的是蛋白質(zhì)的親水和疏水殘基的溶劑可及表面積，其值越大則殘基在環(huán)境中的暴露面積越大。圖 5 為巴利昔-Fab 分子的可及平均親/疏水表面積。可以看出，與天然態(tài)相比，干燥狀態(tài)下的巴利昔-Fab 分子的疏水表面積顯著增加，同時(shí)，親水表面積顯著減小，最終導(dǎo)致親/疏水面發(fā)生反轉(zhuǎn)，可見(jiàn)，干燥之后的巴利昔-Fab 分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的形變；在添加了復(fù)合保護(hù)劑之后，顯著減緩了巴利昔-Fab 分子的疏水表面積的增加，親水表面積的降低也有改善。由此可以推測(cè)，保護(hù)劑可以有效抑制巴利昔-Fab 分子疏水殘基的外翻和親水殘基的內(nèi)卷，因此，保護(hù)劑可通過(guò)影響巴利昔-Fab 分子表面親/疏水表面積來(lái)影響分子結(jié)構(gòu)的改變。

2.4 復(fù)合凍干保護(hù)劑對(duì)巴利昔-Fab 分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

α-螺旋（α-helix）、β-折疊（β-sheet）和無(wú)規(guī)則卷曲（Loop）是蛋白質(zhì)主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象，其中無(wú)規(guī)則卷曲柔性最大，狀態(tài)最不穩(wěn)定。圖 6 展示了不同體系中巴利昔-Fab 分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況，從圖 6 可知，天然狀態(tài)的巴利昔-Fab 分子含有的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)數(shù)目最少，添加復(fù)合保護(hù)劑的次之，干燥狀態(tài)下巴利昔-Fab 分子所含無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的數(shù)目最多。由此可見(jiàn)，當(dāng)在干燥環(huán)境中時(shí)，巴利昔-Fab 分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)由α-螺旋和 β-折疊大量轉(zhuǎn)變成無(wú)規(guī)則卷曲，使得蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)發(fā)生較大的改變，由于α-螺旋有助于提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，隨著巴利昔-Fab 分子的α-螺旋的解旋，無(wú)規(guī)則卷曲的增加，導(dǎo)致蛋白分子的熱穩(wěn)定性降低，巴利昔的活性受到影響。而在添加了復(fù)合保護(hù)劑時(shí)，從一定程度上抑制了巴利昔-Fab 分子二級(jí)結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)則卷曲的轉(zhuǎn)變，從而起到活性保護(hù)的作用。

圖 5 巴利昔-Fab 分子的親/疏水表面積

Figure 5 Variation of the hydrophobic/hydrophilic surface of basiliximab-Fab

圖 6 不同體系巴利昔-Fab 分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Figure 6 Secondary structure analysis of basiliximab-Fab

2.5 復(fù)合凍干保護(hù)劑與巴利昔-Fab 分子相互作用分析

由以上結(jié)論可知，蔗糖、甘氨酸和甘露醇組成的復(fù)合保護(hù)劑可有效地維持巴利昔-Fab 在凍干狀態(tài)下的活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。保護(hù)劑對(duì)蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的保護(hù)作用主要是通過(guò)分子間相互作用實(shí)現(xiàn)的，主要推動(dòng)力是靜電相互作用，同時(shí)氫鍵也起一定的作用，糖和蛋白質(zhì)之間形成的氫鍵，可抑制蛋白質(zhì)在冷凍干燥過(guò)程中的構(gòu)象改變[17]。為了探究氫鍵對(duì)該保護(hù)作用的影響，我們統(tǒng)計(jì)了截?cái)喟霃?0.35 nm 范圍內(nèi)巴利昔-Fab 分子在三種體系時(shí)分子間形成的氫鍵數(shù)目以及可及表面積（圖 7）。結(jié)果表明，干燥狀態(tài)下的巴利昔-Fab 分子間氫鍵數(shù)目最少，為 168 個(gè)，天然狀態(tài)下的巴利昔-Fab分子間氫鍵數(shù)目最多，為 263 個(gè)，添加復(fù)合保護(hù)劑狀態(tài)下氫鍵數(shù)目為 210 個(gè)。由此可見(jiàn)，保護(hù)劑的添加，可有效增加氫鍵的形成，從而增加巴利昔-Fab 分子的穩(wěn)定性。另外，統(tǒng)計(jì)了三種狀態(tài)下巴利昔-Fab 分子的溶劑可及表面積，結(jié)果表明，和天然狀態(tài)相比較，干燥狀態(tài)的巴利昔-Fab由于分子內(nèi)部塌陷導(dǎo)致表面溶劑可及表面積變化明顯，當(dāng)添加保護(hù)劑時(shí)，塌陷得到改善，表面的溶劑可及表面積接近天然狀態(tài)。綜上說(shuō)明蔗糖、甘氨酸和甘露醇更容易占有巴利昔-Fab 分子的表面為蛋白質(zhì)提供更接近水溶劑的氫鍵環(huán)境，從而保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

3 討論

本文利用分子動(dòng)力學(xué)方法模擬研究了巴利昔單抗的復(fù)合保護(hù)劑蔗糖、甘氨酸和甘露醇與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，并與不添加保護(hù)劑的體系相比，可以看出，復(fù)合保護(hù)劑對(duì)巴利昔抗體蛋白有較好的保護(hù)作用。結(jié)果表明，巴利昔抗體蛋白分子因其具有極高柔性在干燥狀態(tài)下會(huì)發(fā)生較大的形變導(dǎo)致分子變性失活，蔗糖、甘氨酸和甘露醇組成的復(fù)合保護(hù)劑可以通過(guò)氫鍵作用為干燥狀態(tài)下的巴利昔單抗分子提供類(lèi)似于水溶液中的氫鍵環(huán)境，改善蛋白分子表面的疏水性質(zhì)，阻止無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的形成，從而保護(hù)其蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象不被破壞。分子模擬的方法與實(shí)驗(yàn)篩選相比，不僅快速、直觀，節(jié)約時(shí)間和研究成本，而且能從理論上闡釋其活性保護(hù)的規(guī)律，為闡明保護(hù)劑的保護(hù)效果和作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。隨著大數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，計(jì)算機(jī)模擬的方法在凍干制劑保護(hù)劑開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。

圖 7 巴利昔-Fab 分子與保護(hù)劑的氫鍵統(tǒng)計(jì)和包裹巴利昔-Fab 分子的保護(hù)劑的溶劑可及表面積

Figure 7 Interaction beween basiliximab-Fab and protectant and solvent accessible surface area of protectants locating near the basiliximab-Fab

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Simulation analysis on the bioactive structural protection of lyoprotectantsin basiliximabby moleculardynamics

YU Xiao-juan, YU Chuan-fei, FANG Sen-biao, WANG Lan

To study the mechanism of sucrose, glycine and mannitol as lyoprotectants in production of basiliximab.

Under condition of 300K system, Gromacs 5.0.5 toolkit was used. The main methods include computer simulation and model building, which were used to simulate three states of basiliximab molecule: natural state, dry state, state adding sucrose, glycine and mannitol as a composite protective agent. Then, the mechanism was analyzed on the basis of comparison of structures.

The results showed that in the dry state, the active structure of basiliximab molecule was obviously collapsed, the region of loop structure was obviously increased, the number of hydrogen bonds was decreased, and the surface electrostatic property was also changed. In the presence of sucrose, glycine and mannitol as a composite protective agent, the above conditions was significantly improved, thus the structural collapse and denaturing inactivation were inhibited by drying and water loss of basiliximab.

Sucrose, glycine and mannitol combined as a composite protective agent can protect the activity of basiliximab lyophilized preparation.

Basiliximab; Bioactive structure; Protective mechanism; Molecular dynamics; Composite protective agent

WANG Lan, Email: wanglan@nifdc.org.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金（21702007）；中國(guó)食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金（2019B1）

王蘭，Email：wanglan@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.002

Author Affiliations: Division of Monlclonal Antibodies, Institute for Biological Product Control, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China (YU Xiao-juan, YU Chuan-fei, WANG Lan); State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmacy, Peking University, Beijing 100191, China (YU Xiao-juan); School of Computer Science, Zhongnan University, Changsha 410083, China (FANG Sen-biao)

2020-09-27