人淋巴細(xì)胞國家參考品的協(xié)作標(biāo)定

胡澤斌，高飛，孫彬裕，孫楠，楊振，黃杰

·技術(shù)與方法·

人淋巴細(xì)胞國家參考品的協(xié)作標(biāo)定

胡澤斌*，高飛*，孫彬裕，孫楠，楊振，黃杰

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所

根據(jù)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) WS/T 360-2011《流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》[1]以及業(yè)內(nèi)共識(shí)，通常使用白細(xì)胞分化抗原 CD45/CD4/CD8/CD3/CD19/CD16 和（或）CD56 單一檢測(cè)試劑或組合亞群檢測(cè)試劑（流式細(xì)胞法），通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血或骨髓細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原（CD）表達(dá)，來分析不同亞群淋巴細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)和百分比[2-4]。CD45+用于鑒別白細(xì)胞，在所有白細(xì)胞上都有表達(dá)，稱為白細(xì)胞共同抗原，CD3+用于鑒別成熟 T 淋巴細(xì)胞，CD3+CD4+雙陽用于鑒別 T 淋巴細(xì)胞中的輔助/誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞亞群，CD3+CD8+雙陽用于鑒別 T 淋巴細(xì)胞中的抑制/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞亞群。CD3-CD19+用于鑒別 B 淋巴細(xì)胞，CD3-CD16+和（或）CD56+用于鑒別自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有準(zhǔn)確量值的一種或多種足夠均勻且穩(wěn)定特性的材料，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量賦值的過程[5-7]。一般有以下四種定值方式可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。①用高準(zhǔn)確度的絕對(duì)測(cè)量方法定值，如參考測(cè)量程序和方法；②采用兩種以上不同原理的已知準(zhǔn)確度的可靠方法定值；③多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值，即協(xié)作標(biāo)定；④使用已有的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)正在研制的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較定值。本單位研制的人淋巴細(xì)胞國家參考品，預(yù)期用途是評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑的準(zhǔn)確性。而目前尚無絕對(duì)測(cè)量方法對(duì) CD45+/CD4+/CD8+/CD3+/CD19+/CD16+和（或）CD56+細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)量和百分比進(jìn)行定值，故采用公認(rèn)的流式細(xì)胞法，多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定的方式對(duì)其進(jìn)行定值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀由巴德生物科技有限公司提供；FACS Calibur 和 Canto II 流式細(xì)胞儀由 BD 公司提供；Beckman Coulter 流式細(xì)胞儀、Navios 流式細(xì)胞儀、DxFLEX 流式細(xì)胞儀由貝克曼庫爾特公司提供；ACEA Novocyte 流式細(xì)胞儀由艾森生物提供；Beckman Navios 流式細(xì)胞儀、BD Canto II 流式細(xì)胞儀由北京曠博生物技術(shù)股份有限公司提供；Bricyte E6 流式細(xì)胞儀由邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供。

1.1.2 試劑 商品化全血質(zhì)控品為美國 Beckman Coulter 和 IMMUNO-TROL Cells 以及 Statusflow 的產(chǎn)品；CD4+細(xì)胞國際質(zhì)控品為英國生物制品檢定所的質(zhì)控品；BD MultiTEST IMK Kit（淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒）和絕對(duì)計(jì)數(shù)管為美國 BD Biosciences 公司產(chǎn)品；4 色 TBNK 熒光單克隆抗體試劑盒和絕對(duì)計(jì)數(shù)微球?yàn)楸本┩鷷r(shí)代公司產(chǎn)品；CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5 和 CD45FITC/ CD56PE/CD19ECD/CD3PC5 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒以及 Flow Count 微球?yàn)槊绹?Beckman Coulter 公司產(chǎn)品；ACEA 的 4 色檢測(cè)試劑 CD3/CD8/CD45/CD4 和 CD3/ CD16+56/CD45/CD19 以及 ACEA 的 6 色檢測(cè)試劑 CD3/CD16+56/CD45/CD4/CD19/CD8 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒為艾森生物公司產(chǎn)品；CD3/CD8/CD45/CD4 和 CD3/CD16+56/CD45/CD19 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒為邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人淋巴細(xì)胞國家參考品協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)方案 選擇業(yè)界認(rèn)可度和知名度較高的具有良好實(shí)驗(yàn)條件的 6 家實(shí)驗(yàn)室作為合作單位，本單位負(fù)責(zé)制定實(shí)驗(yàn)方案并匯總統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。6 家實(shí)驗(yàn)室分別是貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司（Beckman）、碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司、北京曠博生物技術(shù)股份有限公司、邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司、艾森生物（杭州）有限公司、巴德生物科技有限公司。各實(shí)驗(yàn)室均需參照 WS/T 360-2011《流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》要求，使用國家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)上市的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑（流式細(xì)胞法）和絕對(duì)計(jì)數(shù)微球/管（流式細(xì)胞法），在不同的流式細(xì)胞儀平臺(tái)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析。

每家分發(fā) 3 ~ 5 支人淋巴細(xì)胞國家參考品候選品、1 支 CD4+細(xì)胞國際質(zhì)控品以及足量的用于復(fù)溶候選品和國際質(zhì)控品的純水，冰袋運(yùn)輸至各家實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)。企業(yè)收到郵寄的樣本如當(dāng)天不能實(shí)驗(yàn)，需放置冰箱（2 ~ 8 ℃）并在 5 d 內(nèi)完成檢測(cè)。每支候選品重復(fù)測(cè)試 2 次。

1.2.2 人淋巴細(xì)胞國家參考品的協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)操作 參考品為白色凍干粉，使用時(shí)應(yīng)先擰開黑色外瓶蓋，小心打開瓶口內(nèi)的膠塞（瓶塞），避免損失內(nèi)容物。加 1 ml 純水，將瓶塞蓋回，上下輕輕顛倒 3 ~ 5 次，室溫靜置 5 min 使所有內(nèi)容物完全復(fù)溶。復(fù)溶后立即使用。在絕對(duì)計(jì)數(shù)管底部加入 10 ~ 20 μl 熒光抗體試劑（按照各家試劑說明書用量），再加入 100 ~ 300 μl 充分混勻的復(fù)溶細(xì)胞懸液，在渦旋儀上輕輕混勻，置于室溫，避光反應(yīng) 20 ~ 30 min（按照試劑說明書建議）。每管補(bǔ)加 PBS 溶液至總體積 500 μl，混勻后，在各家流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞獲取數(shù)至少 1 萬個(gè)，以 CD45 陽性細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，分析 T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群的百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)。

同時(shí)，在不同的流式細(xì)胞儀平臺(tái)上檢測(cè)時(shí)，均需使用商品化全血質(zhì)控品或者 CD4+細(xì)胞國際質(zhì)控品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制[8-10]。

2 結(jié)果

2.1 協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參考品共在 6 家合作單位的 7 個(gè)流式檢測(cè)平臺(tái)上進(jìn)行了檢測(cè)，使用了 6 種 T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群流式試劑。各家檢測(cè)時(shí)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下，均使用了商品化全血質(zhì)控品或者 CD4+細(xì)胞國際質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)控品淋巴細(xì)胞測(cè)得的絕對(duì)數(shù)和百分比均在其靶值范圍內(nèi)，表明各家實(shí)驗(yàn)操作成立，參考品的測(cè)得結(jié)果可信。對(duì)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果進(jìn)行分析整理匯總，共獲得 11 組數(shù)據(jù)，詳見表 1 ~ 11。

表 1 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 1

表 2 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 2

表 3 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 3

表 4 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 4

表 5 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 5

表 6 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 6

表 7 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 7

表 8 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 8

表 9 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 9

表 10 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 10

表 11 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 11

2.2 剔除離群值

將以上 6 家標(biāo)定的 11 組 40 個(gè)平行數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，各家 T 和 B 淋巴細(xì)胞亞群百分比數(shù)值基本一致，NK 百分比差別較大，各家亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的數(shù)值也比較一致，僅其中一家公司標(biāo)定的細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量整體均偏低約 1 倍。將所有結(jié)果進(jìn)行匯總分析，求得各檢測(cè)指標(biāo)（CD45+的絕對(duì)數(shù)量，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD56+或 CD16+CD56+的百分比和絕對(duì)數(shù)量）的總平均值 M、標(biāo)準(zhǔn)差 SD（表 12）。采用 Grubbs 統(tǒng)計(jì)法，以 CD45+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的 M ± 2SD（1353 ~ 4037 個(gè)/μl）和 CD3+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的 M ± 2SD （1080~ 3112 個(gè)/μl）為依據(jù)來剔除離群值。該公司測(cè)得的 2 組 6 個(gè)平行數(shù)據(jù)中（表 10 和 11）的 4 個(gè)均低于 M-2SD，因此作為離群值剔除其所有數(shù)據(jù)，而其他 5 家9 組數(shù)據(jù)（表 1 ~ 9）保留，作為協(xié)作標(biāo)定的合理有效數(shù)據(jù)進(jìn)行定值。

表 12 11 組原始數(shù)據(jù)的總平均值 M、標(biāo)準(zhǔn)差 SD

表 13 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量有效數(shù)據(jù)的總平均值 M、標(biāo)準(zhǔn)差 SD 以及 ±2SD 范圍

表 14 細(xì)胞百分比有效數(shù)據(jù)的總平均值 M、標(biāo)準(zhǔn)差 SD 以及 ±3SD 范圍

2.3 參考品的最終定值

剔除離群值后，有 5 家單位在 6 個(gè)流式檢測(cè)平臺(tái)上（Navious、FC500、DxFLEX、Canto II、Calibur、Bricyte E7）進(jìn)行了檢測(cè)，將此 9 個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的 34 個(gè)有效數(shù)據(jù)（表 1 ~ 9）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求總平均值 M 和標(biāo)準(zhǔn)差 SD 以及總體變異系數(shù) CV%，如表 13 ~ 14 所示。賦值結(jié)果較為理想，各實(shí)驗(yàn)條件下對(duì) CD3+細(xì)胞百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）、CD3+CD4+細(xì)胞百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）、CD3+CD8+細(xì)胞百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）的賦值結(jié)果總變異系數(shù) CV% 均小于 4.0%；CD3-CD19+細(xì)胞百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）的賦值結(jié)果總變異系數(shù) CV% 小于 8.0%；對(duì) CD45+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量、CD3+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量、CD3+CD4+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量、CD3+CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量、CD3-CD19+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的賦值結(jié)果總變異系數(shù) CV% 均小于 15.0%；NK 細(xì)胞（CD3-CD56+，或者 CD3-CD16+CD56+）百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）和絕對(duì)數(shù)量的賦值結(jié)果總變異系數(shù) CV% 分別為 12.3% 和 18.4%。

故 T/B/NK 淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量以 34 個(gè)有效數(shù)據(jù)的 M ± 2SD 作為可接受范圍，T/B/NK 淋巴細(xì)胞的百分比以 34 個(gè)有效數(shù)據(jù)的 M ± 3SD 作為可接受范圍，以對(duì)人淋巴細(xì)胞國家參考品進(jìn)行定值。該參考品最終定值結(jié)果如下：① CD45+白細(xì)胞數(shù)：2202 ~ 3662 個(gè)/μl；② CD3+成熟T 淋巴細(xì)胞數(shù)：1720 ~ 2831 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 73.1% ~ 82.6%；③ CD3+CD4+輔助/誘導(dǎo) T 淋巴細(xì)胞數(shù)：894 ~ 1501 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 36.5% ~ 45.4%；④ CD3+CD8+抑制/細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞數(shù)：667 ~ 1062 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 26.6% ~ 32.6%；⑤ CD3-CD19+B 淋巴細(xì)胞數(shù)：180 ~ 313 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 6.7% ~ 10.3%；⑥ CD3-CD16+或者 CD3-CD16+CD56+的 NK 細(xì)胞數(shù)：214 ~ 463 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 7.4% ~ 16.0%。

3 討論

本研究中的實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，均是參照 WS/T 360-2011 《流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》。各亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均采用單平臺(tái)法[1]，即用于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)濃度的一種方法，所有結(jié)果均來自流式細(xì)胞儀一臺(tái)儀器的測(cè)定。濃度的測(cè)定可以直接通過測(cè)定體積的方法或間接的通過加入已知濃度的熒光微球來計(jì)算。單平臺(tái)方法消除了兩臺(tái)儀器所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。

本研究中協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)室基本涵蓋了所有在流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞領(lǐng)域有影響力的國內(nèi)外生產(chǎn)企業(yè)，包括貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司、碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司、北京曠博生物技術(shù)股份有限公司、邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司等；使用的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑也基本涵蓋了已取得醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)證的不同廠家產(chǎn)品，同時(shí)還包括了 4 色和 6 色試劑；使用的流式細(xì)胞儀檢測(cè)平臺(tái)也基本涵蓋了所有已批準(zhǔn)上市的儀器。這些儀器和試劑也是在臨床檢測(cè)中廣泛使用的。所以保證了本參考品定值的準(zhǔn)確性，能夠滿足其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。

在 6 家協(xié)作標(biāo)定公司中，有一家公司采用流式細(xì)胞儀體積計(jì)數(shù)法，使用 4 色和 6 色 T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒，測(cè)得參考品的 T/B/NK 淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的數(shù)據(jù)整體低于參考品的賦值范圍下限，但測(cè)得的百分比數(shù)據(jù)均在參考品的賦值范圍內(nèi)，究其原因可能與該公司的實(shí)驗(yàn)操作過程細(xì)節(jié)控制有關(guān)。臨床樣本一般為全血，檢測(cè)時(shí)需要添加溶血素，溶血素中含有一定的表面活性劑，可以減少細(xì)胞抱團(tuán)和管壁黏附現(xiàn)象；與臨床全血樣本不同，國家參考品復(fù)溶后不需要使用溶血素，且細(xì)胞濃度較低，如果參考品加樣體積偏小并使用缺乏表面活性劑的流式管上樣檢測(cè)，可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)得細(xì)胞數(shù)量偏低。

綜上所述，該批人淋巴細(xì)胞國家參考品可用于人 T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑和絕對(duì)計(jì)數(shù)試劑（流式細(xì)胞法）的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)。

[1] Ministry of Health of the People's Republic of China. WS/T 360-2011 Guidelines for peripheral lymphocyte subsets by flow cytometry. Beijing: Standards Press of China, 2011. (in Chinese)

中華人民共和國衛(wèi)生部. WS/T 360-2011 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2011.

[2] Zhou P. Clinical application of flow cytometry immunotyping. Int J Lab Med, 2011, 32(16):1854-1856. (in Chinese)

周萍. 流式細(xì)胞免疫分型在臨床的應(yīng)用研究. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 32(16):1854-1856.

[3] Chen XH, Bai M, Zhang ZZ, et al. Clinical significance of lymphocyte function determination in common lung diseases. J Pract Med, 2019, 35(20):3204-3207. (in Chinese)

陳向紅, 白敏, 張?jiān)煺? 等. 淋巴細(xì)胞功能測(cè)定對(duì)常見肺部疾病的臨床意義. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2019, 35(20):3204-3207.

[4] Wang WW, Xi D, Yuan XL, et al. Comparison of three different flow cytometers in the clinical assessment of lymphocyte subsets. Chin J Lab Med, 2016, 39(5):361-365. (in Chinese)

王維維, 奚迪, 袁向亮, 等. 不同流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群的比較研究. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 39(5):361-365.

[5] National Administrative Commission for CRM's. Development, management and application of standard substances. Beijing: China Metrology Press, 2010. (in Chinese)

全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì). 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制、管理與應(yīng)用. 北京: 中國計(jì)量出版社, 2010.

[6] Quan H, Han YZ. Standard substances and their application techniques. 2nd. Beijing: Standards Press of China, 2003. (in Chinese)

全浩, 韓永志. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其應(yīng)用技術(shù). 2版. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[7] National Administrative Commission for CRM's. Certification and statistical principles for standard substances. Beijing: China Quality Inspection press, 2011. (in Chinese)

全國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì). 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值原理和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理. 北京: 中國質(zhì)檢出版社, 2011.

[8] Wu LJ, Xu DS. Quality control of flow cytometric immunophenotyping. Chin J Lab Med, 2011, 34(5):389-394. (in Chinese)

吳麗娟, 許東升. 流式細(xì)胞術(shù)表型分析的質(zhì)量控制. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 34(5):389-394.

[9] Stebbings R, Wang L, Sutherland J, et al. Quantification of cells with specific phenotypes I: determination of CD4+ cell count per microliter in reconstituted lyophilized human PBMC prelabeled with anti-CD4 FITC antibody. Cytometry A, 2015, 87(3):244-253.

[10] Wang L, Stebbings R, Gaigalas AK, et al. Quantification of cells with specific phenotypes II: Determination of CD4 expression level on reconstituted lyophilized human PBMC labelled with anti-CD4 FITC antibody. Cytometry A, 2015, 87(3):254-261.

*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.014

國家科技重大專項(xiàng)（2018ZX10732401-003-009）

黃杰，Email：jhuang5522@126.com；楊振，Email：yangzhen@ nifdc.org.cn

2020-07-09