卵巢早衰動(dòng)物模型的建立

李慧，王雙杰，葉雪，程洪艷，馬瑞瓊，張孟蕾，昌曉紅

·論著·

卵巢早衰動(dòng)物模型的建立

李慧，王雙杰，葉雪，程洪艷，馬瑞瓊，張孟蕾，昌曉紅

100044 北京，北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（李慧、王雙杰、葉雪、程洪艷、馬瑞瓊、昌曉紅），婦科腫瘤中心（李慧、葉雪、程洪艷、馬瑞瓊、昌曉紅），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（張孟蕾）

應(yīng)用不同化療藥物建立卵巢早衰動(dòng)物模型，探索有效的卵巢早衰動(dòng)物模型建立方法。

采用兩種臨床常用化療藥物紫杉醇、環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)處理動(dòng)情周期正常的雌性 Wister 大鼠，分為紫杉醇組與紫杉醇對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組與環(huán)磷酰胺對(duì)照組。一段時(shí)間后觀察大鼠一般生理情況，檢測(cè)各組大鼠體重的變化，應(yīng)用 ELISA 技術(shù)檢測(cè)各組血清中 E2、FSH 的表達(dá)情況，同時(shí)比較各組卵巢組織形態(tài)、卵泡數(shù)的變化。

環(huán)磷酰胺組較對(duì)照組，大鼠活動(dòng)減少，體重下降，E2 水平明顯下降（< 0.05），F(xiàn)SH 水平明顯升高（< 0.05），卵巢結(jié)構(gòu)萎縮，卵泡數(shù)明顯減少。紫杉醇組與對(duì)照組大鼠相比，雌激素含量明顯降低，活動(dòng)量未見明顯減少，體重均呈增加趨勢(shì)，卵巢結(jié)構(gòu)、卵巢長(zhǎng)徑、卵泡數(shù)以及促卵泡素均未見明顯差別。

環(huán)磷酰胺在建立卵巢早衰的動(dòng)物模型中比紫杉醇具有優(yōu)勢(shì)，更適用于卵巢早衰相關(guān)研究。

環(huán)磷酰胺； 紫杉醇； 卵巢早衰； 動(dòng)物模型

目前，卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）通常采用激素替代療法（HRT）進(jìn)行治療[1-2]。然而，HRT 僅能緩解癥狀，不能改善患者生育能力。因此，迫切需要一種治療的新策略。干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，在多種疾病的研究中取得豐碩的成果，也為 POF 的治療帶來(lái)了希望[3]。目前，在干細(xì)胞進(jìn)行 POF 治療臨床研究時(shí)，通常先采用化療藥物建立動(dòng)物模型進(jìn)行臨床前研究[4-5]。然而，不同化療藥物卵巢毒性和作用時(shí)間不同，可能導(dǎo)致部分模型功能自行恢復(fù)，不利于后續(xù)研究。本研究采用不同化療藥物環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）和紫杉醇（paclitaxel，P）建立 POF 模型，探索模型制備方法，為后續(xù)干細(xì)胞研究 POF 提供有效的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 注射用環(huán)磷酰胺（C3250000）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；紫杉醇（MB1178）購(gòu)自大連美倫生物技術(shù)有限公司；大鼠雌二醇酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（CSB-E05110r）、大鼠促卵泡素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（CSB-E06869r）購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；多聚甲醛、生理鹽水購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；采血管、采血針、離心管等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平（P6107-A600g-1EA）購(gòu)自北京飛默生物科技有限公司；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)購(gòu)自白洋離心機(jī)廠；倒置熒光相差顯微鏡、RM2016 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡儀器有限公司；–80 ℃冰箱購(gòu)自海爾公司；YD-6L 生物組織包埋機(jī)購(gòu)自金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雌性、6 ~ 8 周齡、體重 180 ~ 220 g、健康 Wister 大鼠 16 只，北京維通利華公司提供。飼養(yǎng)于北京大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫控制在（23 ± 2）℃，相對(duì)濕度 45% ~ 55%，光照時(shí)間 12 h，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與模型建立 本研究選擇目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的化療藥物紫杉醇和環(huán)磷酰胺，并采用其常用劑量及周期來(lái)誘導(dǎo)卵巢早衰動(dòng)物模型[5-6]。將大鼠隨機(jī)分為四組，紫杉醇組和紫杉醇對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組和環(huán)磷酰胺對(duì)照組。紫杉醇組給予單劑量 7.5 mg/kg 的紫杉醇腹腔注射，紫杉醇對(duì)照組給予單劑量 7.5 mg/kg 的生理鹽水腹腔注射；環(huán)磷酰胺組給予單劑量 120 mg/kg 的環(huán)磷酰胺腹腔內(nèi)注射；環(huán)磷酰胺對(duì)照組給予單劑量 120 mg/kg 溶解環(huán)磷酰胺的溶劑二甲基亞砜（DMSO）腹腔內(nèi)注射。2 周后處死動(dòng)物。

1.2.3 一般情況觀察及大鼠體重變化 觀察大鼠的活動(dòng)情況、飲食情況、二便及鼠毛脫落情況。自藥物注射開始，連續(xù)稱重 14 d 并記錄分析體重的變化。

1.2.4 血清性激素 從注射開始前一天標(biāo)記為第 0 天，注射當(dāng)天記為第 1 天，以此類推。分別于第 0、14 天在大鼠的內(nèi)眥處采血 2 ml，靜置 2 h。待血完全凝固，用離心機(jī) 3000 r/min 離心 15 min，然后取上清，置于–80 ℃冰箱內(nèi)。血清收集完成后，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠血清雌二醇（E2）和促卵泡素（FSH）的含量。

1.2.5 卵巢形態(tài)學(xué)觀察 觀察周期結(jié)束后，處死大鼠，取大鼠雙側(cè)卵巢。生理鹽水清洗去除血跡，剝離掉多余的脂肪組織后，觀察卵巢結(jié)構(gòu)，用標(biāo)尺測(cè)量卵巢長(zhǎng)徑的大小。

1.2.6 卵泡計(jì)數(shù) 用 4% 多聚甲醛溶液固定卵巢組織 24 h，經(jīng)脫水、透明后石蠟包埋，5 μm 切片，每隔 20 μm 取一張，每個(gè)組織取 3 張切片，常規(guī) HE 染色后，每張切片隨機(jī)取 5 個(gè)視野，觀察卵巢的組織學(xué)變化及總卵泡數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 用藥后大鼠生理表現(xiàn)

紫杉醇組、紫杉醇對(duì)照組及環(huán)磷酰胺對(duì)照組的大鼠毛色亮、無(wú)明顯掉毛現(xiàn)象、精神佳、活動(dòng)可、飲水飲食正常，體重呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)；環(huán)磷酰胺組的大鼠出現(xiàn)不同程度的掉毛、毛色灰暗、精神欠佳、食欲不振、活動(dòng)量減少等表現(xiàn)。

2.2 用藥后大鼠體重的比較

處理 2 周后，紫杉醇與其對(duì)照組大鼠體重均較處理前有增加趨勢(shì)，紫杉醇對(duì)照組大鼠體重增加更明顯，但兩組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。環(huán)磷酰胺組較其對(duì)照組大鼠的生長(zhǎng)受到影響，體重增加不明顯，甚至有下降趨勢(shì)，兩組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 1）。

2.3 大鼠卵巢的大體外觀形態(tài)比較

肉眼下觀察發(fā)現(xiàn)紫杉醇組、紫杉醇對(duì)照組與環(huán)磷酰胺對(duì)照組大鼠卵巢外觀均呈球性，呈淡粉紅色或白色，表面凹凸不平，可見大小不等半透明或透明的卵泡。環(huán)磷酰胺組大鼠卵巢體積縮小，蒼白，表面半透明或透明的隆起減少，大小不均勻，透明度差。部分卵巢局部見充血。提示環(huán)磷酰胺作用后實(shí)驗(yàn)組大鼠的卵巢結(jié)構(gòu)受到影響。

圖 1 兩種不同的化療藥物處理后大鼠體重的比較（*P < 0.05）

Figure 1 Comparison of body weight of rats treated with two different chemotherapy drugs (*< 0.05)

圖 2 兩種不同的化療藥物處理后卵巢長(zhǎng)徑的比較（*P < 0.05）

Figure 2 Comparison of ovarian length after treatment with two different chemotherapy drugs (*< 0.05)

2.4 用藥后大鼠雙側(cè)卵巢長(zhǎng)徑的變化

紫杉醇組與其對(duì)照組處理 2 周后大鼠卵巢長(zhǎng)徑無(wú)明顯變化。環(huán)磷酰胺組大鼠的左右卵巢長(zhǎng)徑較其對(duì)照組均有下降的趨勢(shì)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)右卵巢長(zhǎng)徑較左卵巢長(zhǎng)徑有下降的趨勢(shì)，分析表明可能與卵巢注射部位有關(guān)（圖 2）。提示，環(huán)磷酰胺可能影響卵巢結(jié)構(gòu)。

2.5 用藥后兩組間雌激素、促卵泡素水平的比較

分別比較紫杉醇組與其對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組與其對(duì)照組血清中 E2 的含量，發(fā)現(xiàn)均存在 E2 明顯下降（圖 3A）。提示，紫杉醇和環(huán)磷酰胺均對(duì)大鼠E2 的表達(dá)產(chǎn)生影響，明顯影響卵巢分泌 E2 的功能。同時(shí)，分別比較紫杉醇組與其對(duì)照組，環(huán)磷酰胺組與其對(duì)照組血清中 FSH 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)紫杉醇組與紫杉醇對(duì)照組中 FSH 表達(dá)未見明顯差異，環(huán)磷酰胺對(duì)照組較環(huán)磷酰胺組 FSH 水平明顯升高（圖 3B）。提示環(huán)磷酰胺明顯影響大鼠體內(nèi) FSH、E2 的分泌，影響卵巢功能，紫杉醇僅降低了 E2 的分泌，未影響 FSH 的分泌，說(shuō)明紫杉醇對(duì)卵巢的損傷作用有限。

圖 3 兩種不同的化療藥物處理后雌激素（A）和促卵泡素（B）含量的比較（*P < 0.05）

Figure 3 Comparison of estrogen (A) and follicle stimulating hormone (B) content after treatment of two different chemotherapy drugs (*< 0.05)

圖 4 光鏡下兩種不同化療藥物處理后卵巢結(jié)構(gòu)（A）及各組總卵泡數(shù)（B）的比較（*P < 0.05）

Figure 4 Comparison of ovarian structure (A) and total follicle number (B) of each group after treatment with two different chemotherapy drugs under light microscope (*< 0.05)

2.6 兩種誘導(dǎo)劑處理后大鼠卵巢卵泡數(shù)的比較

各組卵巢 HE 染色后的顯微鏡下影像顯示，紫杉醇組與其對(duì)照組總卵泡數(shù)比較，未發(fā)現(xiàn)明顯的差別；環(huán)磷酰胺組與其對(duì)照組比較，卵泡數(shù)明顯減少（圖 4）。提示該劑量下的紫杉醇未影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，環(huán)磷酰胺可影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育。

3 討論

卵巢早衰病因復(fù)雜，可能與內(nèi)源性基因、異常自身免疫、心理因素、外源性物質(zhì)、感染、藥物治療如化療，手術(shù)（如雙側(cè)卵巢切除術(shù)）等因素密切相關(guān)，但在大多數(shù)情況下，病因仍然未知[7-8]。對(duì)于育齡婦女來(lái)說(shuō)，化療和放療損害了性腺功能，是發(fā)生 POF 的重要原因[9-10]。雖然許多藥物可用于 POF 的治療，但這些藥物效率較低，同時(shí)產(chǎn)生很多副作用。因此，尋找有效的治療 POF 的藥物仍是當(dāng)務(wù)之急。

近年來(lái)，人們對(duì)干細(xì)胞的研究與日俱增，對(duì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)逐漸成熟。干細(xì)胞不僅具有自我更新多向分化潛能，也分泌多種生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子等活性物質(zhì)，同時(shí)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、促進(jìn)損傷組織修復(fù)等方面發(fā)揮巨大作用[11]。目前，應(yīng)用干細(xì)胞治療卵巢早衰已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。然而干細(xì)胞的無(wú)限增殖潛能、致瘤性、異體移植的免疫排斥反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。因此，干細(xì)胞在進(jìn)入 POF 臨床研究前需要進(jìn)行臨床前研究，即動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)估。

在前期研究中，為了進(jìn)一步提高對(duì) POF 發(fā)病原因、機(jī)制和治療方法的認(rèn)識(shí)，建立了很多種 POF 動(dòng)物模型，如免疫型、基因型、代謝型、化療藥物作用型等[12]。理想的 POF 動(dòng)物模型的建立是以能快速模擬 POF 的臨床癥狀，同時(shí)出現(xiàn)激素變化、卵泡卵巢損傷為標(biāo)準(zhǔn)的。目前存在多種建模方式，操作復(fù)雜程度不一，模型穩(wěn)定性差異較大，其中造模時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好且重復(fù)率高的化療藥物所造模型較為常用。盡管不同的化療藥物，如烷化劑、紫杉醇、甲氨蝶呤和阿霉素等造模時(shí)均可出現(xiàn) POF 的典型特點(diǎn)，但是不同的誘導(dǎo)劑的性質(zhì)，作用方式及機(jī)制的不同，使模型的穩(wěn)定型存在差異[13]。因此，本研究選擇兩種常用的化療藥物環(huán)磷酰胺和紫杉醇作為誘導(dǎo)劑，比較兩種誘導(dǎo)劑建立模型的差異，建立穩(wěn)定的模型制備方法。

癌癥是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)報(bào)道中國(guó)每年約有 169 萬(wàn)女性被診斷為癌癥，其中處于前五的癌癥種類中，2.78% 的患者年齡在 30 歲以下，12.25% 的患者年齡在 30 ~ 44 歲之間[14]。腫瘤診療技術(shù)的發(fā)展顯著提高了患者的預(yù)期壽命，據(jù)報(bào)道預(yù)計(jì)到 2024 年，美國(guó)將有 1900 萬(wàn)癌癥存活者[15]。而化療常常導(dǎo)致生育能力和生殖內(nèi)分泌功能喪失，從而增加 POF 的風(fēng)險(xiǎn)。化療引起的 POF 受多種因素的影響，其中化療藥物較強(qiáng)的性腺毒性發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道，紫杉醇是治療卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌和肺癌等上皮癌最常用的化療藥物之一。同時(shí)，也是復(fù)發(fā)淋巴瘤、小細(xì)胞肺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤化療的二線藥物[16]。紫杉醇以劑量依賴的方式損害健康，影響卵母細(xì)胞的成熟，同時(shí)影響生育力[17]。環(huán)磷酰胺是臨床常用的烷化劑類化療藥物，對(duì)女性生殖器官尤其卵巢特別敏感。有研究顯示，接受環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶化療的女性患者有 60% ~ 80% 發(fā)展為 POF[18]。環(huán)磷酰胺加速卵巢原始卵泡發(fā)展為成熟卵泡，減少卵巢儲(chǔ)備，從而導(dǎo)致年輕女性發(fā)生卵巢功能衰竭。紫杉醇和環(huán)磷酰胺均是臨床常用的化療藥物，能夠引起卵巢功能不同程度的損傷，從而引起 POF[19-20]。本研究檢測(cè)了環(huán)磷酰胺與紫杉醇對(duì)大鼠卵巢結(jié)構(gòu)、卵泡數(shù)及卵巢內(nèi)分泌功能的影響，結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺處理后大鼠卵巢萎縮，卵泡數(shù)減少，雌激素水平下降，促卵泡素升高，與臨床卵巢早衰患者血清學(xué)表現(xiàn)一致。證實(shí)了環(huán)磷酰胺可通過(guò)影響卵巢結(jié)構(gòu)、卵泡數(shù)及內(nèi)分泌功能促使卵巢功能受損，從而促使卵巢早衰模型成功。

而以往的研究中，未重視 POF 模型建立過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況，即可能由于化療藥物毒性作用，存在對(duì)大鼠卵巢功能的急性損傷或藥物毒性一過(guò)性，一段時(shí)間后卵巢功能可能自發(fā)修復(fù)。為避免對(duì)后續(xù)機(jī)制和治療等方面研究的影響，本研究認(rèn)為可選擇毒性更大，作用時(shí)間更長(zhǎng)的環(huán)磷酰胺作為誘導(dǎo)劑建立動(dòng)物模型，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組排除化療藥物引起卵巢功能急性損傷的干擾及假陽(yáng)性動(dòng)物模型的建立[21]。

綜上所述，環(huán)磷酰胺處理大鼠后，卵巢結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷，卵泡數(shù)下降，同時(shí)可降低血清雌激素的水平，升高 FSH 水平，造模成功。本研究操作簡(jiǎn)單，模型可靠，可為卵巢功能損傷的發(fā)病機(jī)制的探索及后續(xù)干細(xì)胞治療研究提供有效的動(dòng)物模型。

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Establishment of animal model of premature ovarian failure

LI Hui, WANGShuang-jie, YEXue, CHENG Hong-yan, MA Rui-qiong, ZHANG Meng-lei, CHANG Xiao-hong

To establish animal models of premature ovarian failure using different chemotherapy drugs, and to explore the establishment of stable animal models of premature ovarian failure.

Two common chemotherapeutic drugs, paclitaxel and cyclophosphamide, were used to induce female wister rats with normal estrous cycles. They were divided into paclitaxel group, paclitaxel control group, cyclophosphamide group and cyclophosphamide control group. After a period of time, the general physiology of the rats were observed, and the changes in the body weight of each group were detected. ELISA technique was used to detect the expression of E2 and FSH in the serum of each group, and the changes in the morphology of the ovaries and the number of follicles were compared.

Compared with the control group, the cyclophosphamide group had reduced activity, weight loss, lower E2 level (< 0.05), higher FSH level (< 0.05), atrophy of the ovaries, and significant reduction in the number of follicles. Compared with the control group, the paclitaxel group showed significant decrease in estrogen content and increase in body weight. There were no significant differences in activity, ovarian structure, ovarian length, follicle number, and follicle-stimulating hormone.

Cyclophosphamide has advantage over paclitaxel in establishing an animal model of premature ovarian failure and is more suitable for studies related to premature ovarian failure.

Cyclophosphamide; Paclitaxel; Premature ovarian failure; Animal model

CHANG Xiao-hong, Email: changxiaohong@pukph.edu.cn

北京大學(xué)人民醫(yī)院研究與發(fā)展基金（RDH2017-06）

昌曉紅，Email：changxiaohong@pukph.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.003

Author Affiliations: Department of Obstetrics and Gynecology (LI Hui, WANG Shuang-jie, YE Xue, CHENG Hong-yan, MA Rui-qiong, CHANG Xiao-hong),Gynecological Oncology Center (LI Hui, YE Xue, CHENG Hong-yan, MA Rui-qiong, CHANG Xiao-hong), Animal Laboratory (ZHANG Meng-lei), Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China

2020-04-13