CYP2C19基因多態(tài)性和ApoE基因分型檢測質(zhì)量控制品的制備

郝繁運

CYP2C19基因多態(tài)性檢測可用于氯吡格雷等藥物用藥安全監(jiān)測和用藥指導(dǎo)，ApoE基因分型檢測結(jié)果可以作為心腦血管疾病及阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease，AD）臨床輔助診斷和風(fēng)險評估的重要指標。CYP2C19基因多態(tài)性和ApoE基因分型檢測已被越來越多的臨床醫(yī)師重視，因此，準確檢測CYP2C19基因多態(tài)性和ApoE基因分型至關(guān)重要，但目前在臨床檢測工作中缺少準確可靠的商用質(zhì)量控制（質(zhì)控）品，因此，本研究使用醫(yī)院血庫制備濾膜的收集物，進行基因檢測質(zhì)控品的研制，取得預(yù)期效果［1-4］，現(xiàn)報告如下。

1 自制質(zhì)控品的標本來源

為獲得穩(wěn)定的質(zhì)控品來源，本研究對醫(yī)院血庫制備“去白細胞紅細胞”后棄留在過濾器濾膜上的白細胞進行提?。?］，作為自制質(zhì)控品的標本來源。自制質(zhì)控品采用來自健康獻血者的標本，而非提取后的DNA，目的在于進行實驗全流程質(zhì)控，包括核酸提取階段和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）階段。

2 自制質(zhì)控品的制備與分型檢測

2.1 儀器與試劑 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的ABI 7500實時熒光定量PCR儀（已校準，該檢測系統(tǒng)已經(jīng)通過性能驗證和室間準確性比對）；CYP2C19基因多態(tài)性試劑盒（批號：20181001H，武漢海吉力生物科技有限公司），ApoE基因分型試劑盒（批號：AE201811005，廈門人瑞生物醫(yī)藥科技有限公司）。

2.2 標本收集 使用無菌生理鹽水沖洗去白細胞過濾器，采用無菌操作將洗滌下來的液體小心收集在50 mL離心管中備用，總量約50 mL，取0.5 mL樣本在血液分析儀中進行測定，以白細胞計數(shù)達到5.0×109/L為合格。本次實驗共收集標本28份，測得白細胞計數(shù)都在10×109/L以上。

2.3 收集標本盲測 將收集的28份標本使用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行基因測試分型，采用CYP2C19基因多態(tài)性試劑盒和ApoE基因分型試劑盒進行基因擴增實驗。

2.3.1 CYP2C19基因多態(tài)性的判斷 本實驗采用的基因擴增試劑每個標本占據(jù)1條6連管。選擇1、2號管，根據(jù)每個反應(yīng)管到達FAM通道（450～490 nm）信號閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)差值（?Ct值）判斷樣本CYP2C19*2的基因多態(tài)性；選擇3、4號管，根據(jù)FAM信號?Ct值判斷樣本CYP2C19*3的基因多態(tài)性；選擇5、6號管，根據(jù)FAM信號?Ct值判斷樣本CYP2C19*17的基因多態(tài)性，然后根據(jù)表1判斷標本的基因型。對分裝的自制質(zhì)控品進行核酸提取后按照基因擴增操作程序在PCR儀上機檢測。

表1 CYP2C19基因多態(tài)性分型判斷

2.3.2 ApoE基因分型判斷 待測樣品DNA內(nèi)控HEX通道（515～535 nm）信號正常時觀察樣品在ε2、ε3和ε4基因檢測試劑中的FAM信號有無曲線升起。如有擴增曲線，計算Ct和?Ct值（?Ct＝CtFAM-CtHEX），以≤?Ct臨界值判斷為陽性。見表2。

本研究篩選出25份符合要求樣本，CYP2C19基因多態(tài)性檢測出*1/*1基因型10份，*1/*2基因型10份，*2/*2基因型3份，*1/*3基因型1份，*3/*3基因型 1份，未檢出 *1/*17、*2/*3、*2/*17、*3/*17、*17/*17基因型；篩選出27份符合要求樣本中ApoE基因分型檢測出ε3/ε3基因型19份，ε3/ε4基因型2份，ε2/ε3基因型4份，ε2/ε2基因型1份，ε4/ε4基因型1份，未檢出ε2/ε4基因型。

表2 ApoE基因分型判斷

2.4 自制質(zhì)控品的制備

2.4.1 CYP2C19基因多態(tài)性檢測質(zhì)控品的制備取上述不同基因型（*1/*2、*2/*2、*1/*3、*3/*3）的陽性標本，分別顛倒混勻10次。室溫下以2 000 r/min（離心半徑為15 cm）離心30 min。然后用一次性塑料吸管小心吸出位于紅細胞和血漿層中間的白細胞層（白膜），置于5 mL雙蒸水（ddH2O）中，顛倒混勻后靜置10 min，使吸出的少量紅細胞低滲溶血，以3 500 r/min離心15 min；吸棄上清，保留細胞層，視溶血效果可重復(fù)低滲溶血操作1～2次。合并相同基因型的白細胞，以適量（按原血標本總體積的1/2）模擬血漿重懸。充分混勻后按照每管不少于200 μL分裝到0.5 mL離心管中，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 ApoE基因分型檢測質(zhì)控品的制備 取上述不同基因型（ε3/ε4、ε2/ε3、ε3/ε3、ε4/ε4）的陽性標本，按照2.4.1項下方法制備ApoE基因分型檢測質(zhì)控品并分裝，于-70 ℃保存。

2.5 自制質(zhì)控品的分裝 上述自制質(zhì)控品按6個月量進行配制。用0.5 mL離心管分裝，每支分裝量應(yīng)足夠進行至少1次檢測，在質(zhì)控品外部粘貼標簽，需注明質(zhì)控品名稱、配制日期、有效期及配制人。

3 實驗評價自制質(zhì)控品的方式和頻率

3.1 每日取1支自制質(zhì)控品作為外部陽性質(zhì)控（不同基因型交替輪換使用），隨日常標本進行核酸提取及PCR上機檢測，外部陽性質(zhì)控標本位置隨機。每塊反應(yīng)板均需運行室內(nèi)質(zhì)控，包括試劑盒自帶的陰性、陽性質(zhì)控以及空白對照，自制質(zhì)控品每日檢測1次。

3.2 根據(jù)室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果與已知結(jié)果的一致性判斷本批次結(jié)果是否正常，報告能否發(fā)出。

4 自制質(zhì)控品均勻性和穩(wěn)定性評估［6-7］

4.1 均勻性評估 每批新制質(zhì)控品均需進行1次均勻性評價，每個基因型質(zhì)控品配制成一定濃度后混勻分裝并上機檢測，以不同瓶間無明顯差別（本實驗為判定分型結(jié)果一致）作為均勻性評價指標。每個分型標本取5瓶在1 d內(nèi)進行核酸提取后擴增檢測，根據(jù)試劑盒要求判讀結(jié)果，定型結(jié)果與已知結(jié)果一致為合格。見表3～4。

表3 CYP2C19基因多態(tài)性自制質(zhì)控品同批次均勻性結(jié)果

表4 ApoE基因分型自制質(zhì)控品同批次均勻性結(jié)果

4.2 穩(wěn)定性評估 將自制質(zhì)控品保存于-70 ℃，每批次選取3瓶進行上機檢測，記錄第0、1、3、6個月后檢測結(jié)果，與預(yù)期陽性結(jié)果一致則為穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定期為檢測時間，否則將上一次檢測時間作為穩(wěn)定時間。見表5～6。

表5 CYP2C19基因多態(tài)性自制質(zhì)控品階段性復(fù)測結(jié)果

表6 ApoE基因分型自制質(zhì)控品階段性復(fù)測結(jié)果

4.3 穩(wěn)定性回顧評價［8-10］定期對質(zhì)控數(shù)據(jù)進行回顧性評價，每月質(zhì)控小結(jié)回顧首先確認質(zhì)控品的有效性。如果自制質(zhì)控品Ct值有降低趨勢，或無明確原因與預(yù)期結(jié)果不一致，則需停止使用并重新確認該批次質(zhì)控品的有效性，更換新批次的質(zhì)控品。

自制室內(nèi)質(zhì)控品在PCR擴增儀中的位置不能永久固定在1個孔，應(yīng)盡量在每次擴增檢測時進行相應(yīng)順延，使得在一定時間內(nèi)可以盡可能地監(jiān)測每1個孔的擴增有效性。

5 討論

本研究以醫(yī)院血庫制備“去白細胞紅細胞”后棄留在濾膜上的白細胞作為原料，對其進行提取，自制基因檢測質(zhì)控品，結(jié)果顯示，自制質(zhì)控品的均勻性和穩(wěn)定性符合預(yù)期質(zhì)量要求。并且可獲得穩(wěn)定充足的樣本，克服通過其他渠道獲得樣本來源有限、不能有效監(jiān)測實驗反應(yīng)全過程等缺點，制備的質(zhì)控品在臨床實驗室中可用于ApoE基因分型和CYP2C19多態(tài)性檢測。自制質(zhì)控品需較長時間凍存，本研究未加入甘油、二甲基亞砜、血清等外源性保護劑和穩(wěn)定劑，可以避免檢測中可能存在的非特異性干擾。

利益沖突 作者聲明不存在利益沖突