實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測解脲脲原體的效果比較

陳娟 王庭強(qiáng) 張?jiān)婎?黃詠 張?jiān)?/p>

支原體是生物界最小的一種原核微生物，可生長、繁殖于無生命培養(yǎng)基，解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，UU）、生殖道支原體等均屬于支原體，主要分離于泌尿生殖道，會造成泌尿生殖道疾病，可引發(fā)30%～40%的男性非淋菌性、非衣原體尿道炎［1］。在性傳播疾病中，UU感染較為常見，近年來發(fā)生率日益升高。在UU檢測中，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）是近年來應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，但由于采集樣本是分泌物拭子，采樣過程中易產(chǎn)生損傷，而無損傷采集的樣本進(jìn)行qRT-PCR敏感度不高，且存在一定假陽性概率，因此臨床上有必要尋找一種高敏感度、高特異度，同時(shí)可降低假陰陽概率且適用于檢測病原微生物含量較低標(biāo)本的方法［2］。本研究統(tǒng)計(jì)分析了2018年1月—2020年1月就診于我院的89例疑似UU感染患者的臨床資料，旨在評估實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）和qRT-PCR對UU的檢測效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象及一般資料 選擇2018年1月—2020年1月本院收治的89例疑似UU感染患者，其中男性30例（占33.7%），女性59例（占66.3%）；年齡19～58歲，平均（38.5±6.4）歲。

1.2 試劑與儀器 ABI 7500熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），SAT試劑盒購自上海仁度生物科技有限公司，qRT-PCR試劑盒購自廣州達(dá)安基因股份有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 尿液樣本采集 取患者清晨首次尿液，或長時(shí)間（至少1 h）不排尿后的首段尿標(biāo)本2 mL。采集的樣本在2～30 ℃條件下于24 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室加入樣本保存液，制備成待測樣本（RNA在菌體死亡后很容易發(fā)生降解，標(biāo)本須在24 h內(nèi)加入保存液）。

1.3.2 分泌物拭子采集 男性患者采集分泌物時(shí)用棉拭子在尿道內(nèi)停留15 s，取出時(shí)均勻旋轉(zhuǎn)3周；女性患者采集陰道內(nèi)分泌物或?qū)m頸口內(nèi)2 cm處分泌物。將采集的棉拭子置于無菌試管中立即送檢。

1.3.3 樣本保存 標(biāo)本采集后24 h內(nèi)將尿液與樣本保存液1：1混合（2 mL尿液加入樣本保存管至紅色刻度線附近），所取分泌物拭子加入1 mL生理鹽水。加入保存液后的待測樣本在2～8 ℃下保存不應(yīng)超過7 d，-20 ℃下保存不超過3個(gè)月，-70 ℃下可長期保存，避免反復(fù)凍融。

1.3.4 操作步驟 對所有患者尿液標(biāo)本進(jìn)行SAT檢測，并對比同一患者分泌物標(biāo)本的qRT-PCR結(jié)果，差異樣本進(jìn)行第三方鑒定。① SAT：洗脫拭子樣本，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d。混勻400 μL尿液或分泌物（加有保存液）+100 μL核酸提取液，在60 ℃下恒溫、室溫分別放置5 min、10 min，在磁珠分離器上靜置5 min，加入洗滌液洗滌2次。置于半自動(dòng)核酸提取儀上提取RNA，然后吸取含磁珠的30 μL擴(kuò)增檢測液，放置于8連管中，加入42 ℃預(yù)熱的SAT酶液，在42 ℃下進(jìn)行40 min實(shí)時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增。②qRT-PCR：加入1 mL生理鹽水樣本振蕩數(shù)秒，將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，以12 000 r/min（離心半徑11 cm）離心10 min，棄去上清，加入50 μL核酸提取液，100 ℃金屬浴中煮沸10 min，以1 000 r/min（離心半徑11 cm）離心5 min，取5 μL上清液進(jìn)行qRT-PCR。

1.4 結(jié)果判讀 ① SAT：依據(jù)閾值線與樣本曲線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)（dt），dt≤35為陽性（UU攜帶者），dt≤界值參考品dt值表明樣本中UU≥104 cfu/mL，需進(jìn)行臨床干預(yù)；35＜dt＜40建議重新檢測，dt＜40為陽性，無數(shù)值或dt＝40為陰性［3］。② qRT-PCR：根據(jù)陽性參考對照曲線，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值）無數(shù)值為陰性，Ct值＜30.0為陽性［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例或率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAT和qRT-PCR檢測UU陽性率比較 89例疑似UU感染的臨床標(biāo)本中，使用尿液標(biāo)本的SAT陽性檢出率明顯高于拭子標(biāo)本的qRT-PCR陽性檢出率（P＜0.05）。見表 1。

表1 SAT和qRT-PCR檢測UU的陽性情況比較

2.2 SAT和qRT-PCR對UU的診斷效能 89例疑似UU感染的臨床標(biāo)本中，臨床診斷陽性59例，陰性30例，SAT法檢測陽性62例，陰性27例；qRT-PCR檢測陽性46例，陰性43例。以臨床診斷作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，SAT檢測的敏感度為100.0%（59/59），特異度為 90.0%（27/30），準(zhǔn)確度為 96.6%（86/89），陽性預(yù)測值為 95.2%（59/62），陰性預(yù)測值為 100.0%（27/27）；qRT-PCR檢測的敏感度為78.0%（46/59），特異度為100.0%（30/30），準(zhǔn)確度為 85.4%（76/89），陽性預(yù)測值為 100.0%（46/46），陰性預(yù)測值為 69.8%（30/43）。SAT檢測的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測值均明顯高于qRT-PCR（均P＜0.05），陽性預(yù)測值和特異度均低于qRT-PCR（均P＜0.05）。見表2～3。

3 討論

生殖道支原體感染與男性前列腺炎、女性宮頸炎等密切相關(guān)［5］。在UU檢測中，qRT-PCR是臨床通常采用的方法，qRT-PCR的檢測原理是在原有PCR的基礎(chǔ)上增加了一條熒光探針，在擴(kuò)增時(shí)熒光探針與病原體的一條DNA鏈結(jié)合，當(dāng)引物延伸時(shí)，外切酶切斷熒光探針中的熒光基團(tuán)，此時(shí)熒光基團(tuán)發(fā)光，通過拍照設(shè)備獲得圖像，檢測熒光強(qiáng)度，從而反映病原體的產(chǎn)物量［6］。在對UU進(jìn)行檢測的過程中，qRT-PCR只能采用拭子樣本，取樣過程具有侵入性，給患者造成一定痛苦。但由于qRT-PCR操作簡便、較為經(jīng)濟(jì)，同時(shí)能夠降低產(chǎn)物污染，因此現(xiàn)階段在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測中較為常用［7］。SAT是指靶標(biāo)RNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄合成一條包含T7啟動(dòng)子的雙鏈DNA，T7 RNA聚合酶以這條雙鏈DNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，每個(gè)RNA可以擴(kuò)增出100～1 000個(gè)拷貝的RNA。合成所得的RNA與分子信標(biāo)結(jié)合，發(fā)出熒光，可以被熒光檢測儀檢測到［8］。與此同時(shí)，新合成的RNA繼續(xù)在反轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶的作用下循環(huán)反轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄的過程，如此往復(fù)，以達(dá)到高效擴(kuò)增的目的［9］。SAT的檢測樣本可以為泌尿生殖道分泌物，也可以為尿液，而尿液取樣具有非侵入性，可以讓受檢者自行取材，一方面能減少醫(yī)生工作量，另一方面還能避免拭子取樣給患者造成的痛苦，易為患者所接受。

表2 SAT和qRT-PCR檢測UU的效果與臨床診斷比較

表3 SAT和qRT-PCR對UU的診斷效能比較

有研究顯示，在UU檢測中，SAT具有較高的準(zhǔn)確性，能有效滿足快速、簡便的實(shí)驗(yàn)要求，且SAT的檢測樣本可以為尿液，因此臨床應(yīng)用價(jià)值較高［10］。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)方案共驗(yàn)證89例疑似UU感染臨床標(biāo)本，其中SAT法（尿液標(biāo)本）共檢出62例陽性，陽性率為69.7%；qRT-PCR（拭子標(biāo)本）共檢出46例陽性標(biāo)本，陽性率為51.7%。SAT法陽性率高于qRT-PCR，且qRT-PCR檢出陽性的標(biāo)本SAT均檢出陽性。SAT法檢測的敏感度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測值均高于qRT-PCR，陽性預(yù)測值低于qRT-PCR，與上述研究結(jié)果［10］一致，表明SAT法在UU檢測中具有較高的陽性率、敏感度、準(zhǔn)確度和陰性預(yù)測值，同時(shí)還具有檢測速度快、取樣方便的優(yōu)點(diǎn)。SAT屬于一種新型RNA檢測技術(shù)，有機(jī)結(jié)合了實(shí)時(shí)熒光檢測與RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，運(yùn)用磁珠法特異性提取尿液樣本中的UU RNA，不需要高溫加熱和高速離心，具有較高的提取效率。同時(shí)，RNA在常規(guī)環(huán)境中易降解，交叉污染較少，能有效解決污染引發(fā)的假陽性問題，也能為監(jiān)測臨床療效提供有利條件。此外，SAT采用水相洗滌，可特異性捕獲靶標(biāo)，具有較少的反應(yīng)抑制物，能有效降低假陰性概率和提高檢測敏感度［11］。

綜上所述，采用SAT檢測UU較qRT-PCR效果更好，值得在臨床推廣。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突