非洲豬瘟病毒研究進(jìn)展

陳元翠

(貴州省貞豐縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州貞豐562200)

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起豬的急性、熱性、出血性和高度接觸性傳染病，無明顯季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，通常在感染后10 d內(nèi)死亡，病死率可高達(dá)100%[1]。其臨床癥狀和病理變化與豬瘟(古典豬瘟，CSF)相似，在臨床診斷時常常誤診為豬瘟，具體表現(xiàn)為精神沉郁、食欲廢絕、高熱、皮膚充血發(fā)紺、流產(chǎn)、水腫、臟器出血、共濟(jì)失調(diào)[2]。野豬、家豬和鈍緣蜱是ASFV的宿主，豬巨噬細(xì)胞是ASFV的靶細(xì)胞。ASFV由于基因組強(qiáng)大和逃逸機(jī)制復(fù)雜，所以目前尚無有效的疫苗預(yù)防。ASF是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法定報(bào)告的動物傳染病，同時也是《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定的一類動物疫病[3]。ASF起源于非洲，1921年在非洲的肯尼亞被首次確認(rèn)，之后蔓延到非洲其他地區(qū)以及歐美多個國家，并且有流行擴(kuò)大的趨勢[4，5]。我國自2018年8月在遼寧沈陽暴發(fā)首例ASF以來，已有31個省(區(qū)、市)相繼發(fā)生疫情，幾乎席卷所有省份，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[6～8]。本文根據(jù)近年國內(nèi)外學(xué)者的研究文獻(xiàn)，將ASFV的病原學(xué)特征、流行病學(xué)、基因組結(jié)構(gòu)及功能、致病性及致病機(jī)制和綜合防控措施介紹如下，供參考。

1 病原學(xué)特征

1.1 形態(tài)特征ASFV是非洲豬瘟病毒科，非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是1種大型的雙股DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對稱，平均直徑200 nm，病毒分子由內(nèi)到外分別為核質(zhì)體、核衣殼、囊膜，囊膜又分為內(nèi)層和外層[9]。ASFV是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一的DNA蟲媒病毒，是1種獨(dú)特而復(fù)雜的病毒，具有“虹彩病毒的外形，痘病毒的內(nèi)質(zhì)”。國際病毒分類委員會曾在第四、第五次報(bào)告中將其分別列入虹彩病毒科和痘病毒科，但是隨著病毒基因序列及病毒復(fù)制等方面的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)ASFV與虹彩病毒和痘病毒在某些方面還是存在不同，所以在第六次報(bào)告中將其列入“類非洲豬瘟病毒屬”；1998年正式將ASFV列入1個全新的病毒科——非洲豬瘟病毒科；2005年第八次報(bào)告中最終將ASFV列為非洲豬瘟病毒科，非洲豬瘟病毒屬的唯一成員[10]。

1.2 理化特性ASFV對環(huán)境的抵抗力比較強(qiáng)，可以在環(huán)境中長期存活，在pH值 4～10之間毒力不會發(fā)生明顯改變。在血液中可延長存活時間，在一般血液中可存活半年，-70 ℃冷藏條件下血液中可存活18個月，在脾臟組織中感染力2年內(nèi)不受影響[11，12]。對熱比較敏感，在60 ℃下僅能存活30 min，但耐寒能力極強(qiáng)，持續(xù)-20 ℃條件下可存活10年以上。使用常規(guī)消毒劑可以殺死，尤其是使用氯制劑可以有效殺滅，常用消毒劑有10%苯酚溶液、2.3%次氯酸鹽、0.8%氫氧化鈉、0.3%福爾馬林[13]。ASFV在冷凍豬肉中可存活15年，在腌肉中也可存活，所以在處理過程中必須嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施，防止被污染的豬肉制品進(jìn)一步傳播[14]。

2 流行病學(xué)

2.1 傳染源豬科動物和節(jié)肢動物鈍緣蜱是ASFV的自然宿主。發(fā)病豬和帶毒豬是主要傳染源(包括攜帶病毒的組織、血液、各種分泌物和排泄物)。歐洲野豬對ASFV敏感，但有3種非洲野豬(疣豬、大林豬、非洲野豬)感染后沒有明顯的臨床癥狀，呈隱性帶毒，是病毒的儲存器[15]。豬群一旦感染后，傳播迅速，發(fā)病率高，致豬群大量死亡，康復(fù)豬可長期帶毒，短期內(nèi)可再次暴發(fā)。未被處理的感染野豬尸體、未被正確銷毀或掩埋的家豬尸體、已感染但未表現(xiàn)臨床癥狀的家豬與野豬都是危害嚴(yán)重需要特別關(guān)注的傳染源。ASFV 除了可以通過帶毒的宿主傳播外，帶毒的生肉或肉制品、加工廢棄物以及被污染的車輛、設(shè)備等均可成為傳染源[16]。此外，鈍緣蜱通過叮咬病豬后終生帶毒，成為ASFV的儲存宿主和傳播媒介[17]。

2.2 易感動物ASFV不感染人，豬是唯一易感的哺乳動物，幾乎所有的豬科動物均可感染，沒有明顯的品種、年齡、性別差異，高度易感的家豬和歐洲野豬常表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。ASFV不感染貓、狗、牛、羊等動物，但在家兔體內(nèi)盲傳26代仍會致豬死亡[18]。

2.3 傳播途徑ASF的傳播途徑較為廣泛，主要經(jīng)過消化道和呼吸道途徑侵入豬體。目前發(fā)現(xiàn)主要通過4種途徑傳播。(1)接觸傳播：與病豬經(jīng)口或鼻直接接觸感染[19]，或接觸病豬的血液、糞便和病豬使用過的器具等間接傳播[20]。(2)經(jīng)食物傳播：主要為含病毒的豬制品或泔水飼喂豬后引起豬感染發(fā)病。(3)媒介傳播：1963年西班牙學(xué)者從軟蜱體內(nèi)分離出ASFV，隨后認(rèn)定游走鳥壁虱為ASFV的主要生物媒介及貯存宿主，并確定毛白鈍緣蜱在ASF流行病學(xué)中有著重要作用；ASFV可在鈍緣蜱體內(nèi)復(fù)制并且可通過交配傳播，蜱叮咬感染豬后ASFV隨血液進(jìn)入蜱內(nèi)，隨后傳播到下一個叮咬目標(biāo)，甚至整個鈍緣蜱屬的蜱蟲均可以傳播本病[21]。由于這種寄生蟲的廣泛存在，所以非洲豬瘟病毒很難消滅，尤其是在蜱蟲盛行的季節(jié)。(4)其他傳播途徑：研究表明，ASFV在2 m以內(nèi)可通過氣溶膠傳播[22，23]。

3 基因組結(jié)構(gòu)及功能

ASFV的基因組是1種線性雙鏈DNA分子，2條鏈都可以轉(zhuǎn)錄?；蚪M長170～193 kb，由中央為125 kb左右的保守區(qū)，兩端為可變區(qū)(分別為38～48 kb、13～22 kb)，以及基因組末端的反向重復(fù)序列(2.1～2.5 kb)組成[9]。根據(jù)中央保守區(qū)的可變區(qū)(約4 kb)序列的差異性將ASFV分為不同毒株基因型。兩端可變區(qū)為不同毒株的主要差異所在，這些可變區(qū)編碼著5個多基因家族，包括假定膜蛋白、分泌性蛋白、核酸代謝酶以及蛋白修飾酶。每個多基因家族都可發(fā)生增加、缺失、分化等變異，與病毒逃避宿主防御系統(tǒng)、抗原變異等機(jī)制相關(guān)，此外由于多基因家族的基因拷貝數(shù)不同而導(dǎo)致毒株基因組的長度差異，強(qiáng)毒株多基因家族的基因拷貝數(shù)較多，低毒株基因拷貝數(shù)少[24]。同分離株基因組的重復(fù)序列和重復(fù)次數(shù)存在差異，末端重復(fù)序列結(jié)構(gòu)與痘病毒基因組相似但序列不同，在痘病毒基因組中末端重復(fù)序列對同源復(fù)制中間體的復(fù)制和分辨都至關(guān)重要，但這在ASFV基因組中尚未有研究?？删幋a151～167個開放閱讀框(ORFs)，成熟病毒粒子中含有68種結(jié)構(gòu)蛋白[25～28]。ASFV 病毒粒子蛋白按功能主要分為以下幾類：(1)4%的蛋白參與病毒形態(tài)發(fā)生，構(gòu)成病毒粒子結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，如P220和P62多肽、P54、P72、PE248R、P49 和CD2v等，其中P72蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由B646L基因編碼，該基因高度保守，有較強(qiáng)的抗原性，且不同病毒株的氨基酸序列差異不大，相較于ASFV的其他結(jié)構(gòu)蛋白有更好的穩(wěn)定性，是病毒檢測中最常用的靶基因[29]。此外，對B646L基因(P72 蛋白)進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ASFV的基因組較大且變異頻繁，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 24種不同的基因型[30]。(2)19%的蛋白參與病毒基因轉(zhuǎn)錄和RNA修飾。(3)6%的蛋白在維持病毒基因組的完整性中發(fā)揮作用。(4)4%的蛋白參與病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程。(5)3%的蛋白參與病毒逃逸宿主的免疫系統(tǒng)。(6)10%為其他已知蛋白；比例最大(34%)的仍是未知的蛋白[10]。

4 致病性及致病機(jī)制

ASFV按毒力分為強(qiáng)、中、低毒力毒株。強(qiáng)毒株主要引發(fā)超急性或急性感染，病死率高達(dá)90%～100%；中等毒力毒株主要引發(fā)亞急性感染，病死率為20%～40%；低毒力毒株主要引發(fā)慢性感染，病死率低，為10%～30%。豬感染ASFV后，首先在鼻咽部或扁桃體中進(jìn)行增殖，通過淋巴和血液循環(huán)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，引起病毒血癥，對血管、淋巴結(jié)的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行侵襲，導(dǎo)致相應(yīng)組織、器官出現(xiàn)出血、漿液性滲出、血栓和梗死等病理變化，以及出現(xiàn)淋巴細(xì)胞凋亡、免疫系統(tǒng)受損和淋巴細(xì)胞明顯減少等特征性表現(xiàn)[31]。ASFV感染的主要靶細(xì)胞是豬單核-巨噬細(xì)胞，所以最早檢測到ASFV的地方是豬的單核-巨噬細(xì)胞，隨后是樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞和肝細(xì)胞[32]。病毒編碼的許多蛋白質(zhì)可以與細(xì)胞表面的特異性受體識別結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生胞吞作用，使病毒得以進(jìn)入(其中細(xì)胞脂質(zhì)膽固醇參與了ASFV的感染過程[33])，隨后則利用病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的相似相融機(jī)理逐步將病毒粒子釋放到宿主細(xì)胞漿內(nèi)，完成感染，ASFV顆粒從早期的內(nèi)涵體移動到后期的大囊泡體，并完成脫殼，釋放具有復(fù)制能力的基因組。研究表明，針對蛋白P12、P32、P54、P73的特異性外源抗體可以阻斷病毒的吸附和進(jìn)入(與巨噬細(xì)胞結(jié)合)，證明了這4種蛋白都參與了病毒的吸附和內(nèi)吞過程；位于成熟的病毒粒子內(nèi)膜的內(nèi)膜蛋白也對病毒早期侵入宿主細(xì)胞起到十分重要的作用，比如pE248R蛋白[34]。ASFV進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在蛋白的介導(dǎo)作用下，逐步聚集于宿主細(xì)胞的細(xì)胞核，以自身攜帶的酶和蛋白因子進(jìn)行早期mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯，翻譯出病毒復(fù)制和加工所需要的各種酶，然后在細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)完成自我復(fù)制，復(fù)制方式和痘病毒十分相似[35]。通常病毒的入侵會激活細(xì)胞的自殺程序，而ASFV則可以抑制細(xì)胞的這種調(diào)亡過程，使得病毒得以持續(xù)復(fù)制，是病毒持續(xù)性感染的保障。同時，ASFV通過2種切除修復(fù)系統(tǒng)來維持病毒基因組的完整：一是DNA前體合成所需的酶系統(tǒng)，如胸苷激酶、核苷酸還原酶等；二是堿基切除修復(fù)系統(tǒng)，用來修復(fù)水解以及氧化所造成的DNA堿基損傷。ASFV在宿主細(xì)胞質(zhì)核周圍的“病毒加工廠”區(qū)域進(jìn)行裝配，裝配部位集中在微管形成中心和高爾基復(fù)合體。在病毒的核蛋白周圍包裹著細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的雙層膜形成外膜，在非結(jié)構(gòu)蛋白pB602L的調(diào)節(jié)下，使核衣殼蛋白P72組裝成病毒的二十面體結(jié)構(gòu)，形成ASFV的核衣殼，最后病毒粒子二十面體閉合，病毒DNA嵌入及核心蛋白濃縮，最終形成成熟的病毒粒子[34]。組裝完成后，成熟的病毒顆粒在驅(qū)動蛋白提供的動力下，借助細(xì)胞骨架微管運(yùn)輸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，通過細(xì)胞膜的出芽不僅獲得了來自細(xì)胞膜的單層囊膜，并且分泌到了細(xì)胞外[36]。研究發(fā)現(xiàn)，P54蛋白和PE120R蛋白參與了病毒粒子從裝配位點(diǎn)到細(xì)胞膜的運(yùn)輸過程。具有感染性的成熟病毒粒子在被釋放到胞外后，在病毒粒子表面將形成1層囊膜，該囊膜與ASFV的感染性無關(guān)，可能參與病毒對宿主細(xì)胞的吸附作用[34]。此外，病毒CD2v蛋白參與胞外病毒粒子與紅細(xì)胞的結(jié)合，且可能在病毒的出芽過程中發(fā)揮一定作用[37]。ASFV主要感染豬的單核吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，引起細(xì)胞壞死，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下或不全，產(chǎn)生不完全中和抗體，雖然弱毒株造成的免疫損傷輕微，但感染豬仍然不產(chǎn)生典型中和抗體。

5 綜合防控措施

ASFV由于基因組強(qiáng)大和逃逸機(jī)制復(fù)雜，所以目前尚無有效的疫苗預(yù)防。預(yù)防和控制該病要依靠“早發(fā)現(xiàn)、早撲滅”和實(shí)施嚴(yán)格的運(yùn)輸管理及衛(wèi)生措施，只有嚴(yán)格的衛(wèi)生措施才能阻止豬與ASFV 的潛在接觸，降低養(yǎng)殖場再次暴發(fā)疫情的可能性。

5.1 普及防控知識，增強(qiáng)防控意識我國是養(yǎng)豬大國，約占世界生豬養(yǎng)殖數(shù)量的50%，ASF疫情對我國的生豬養(yǎng)殖造成巨大損失，所以要加大防控宣傳力度，積極防范，可通過電視、網(wǎng)絡(luò)、宣傳冊等形式定期開展科普宣傳活動，并組織學(xué)習(xí)培訓(xùn)相關(guān)的防控知識[38]。

5.2 嚴(yán)格引種嚴(yán)禁從有疫情的國家、地區(qū)引進(jìn)豬種、精液。非疫區(qū)引進(jìn)豬要經(jīng)過嚴(yán)格的隔離檢疫，觀察45天無異常后才可進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)混群，嚴(yán)防疫病傳入。有條件的大型養(yǎng)殖場應(yīng)堅(jiān)持并建立自繁自養(yǎng)體系。

5.3 實(shí)行嚴(yán)格的衛(wèi)生消毒制度將生產(chǎn)區(qū)和生活區(qū)嚴(yán)格分開。飼養(yǎng)人員在每次進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)時換上經(jīng)過紫外線消毒的鞋和衣服。在養(yǎng)殖場門口設(shè)置消毒池及消毒噴霧器，保證運(yùn)輸車輛經(jīng)嚴(yán)格消毒后方可進(jìn)入場內(nèi)。對車輛及用具定期用0.8%氫氧化鈉、0.3%福爾馬林或2%次氯酸鈉進(jìn)行消毒。采取隔離防護(hù)措施，避免飼養(yǎng)豬與野豬、鈍緣蜱接觸，并清除傳染源。飼槽和飲水器定期消毒。出售生豬后，空豬舍內(nèi)可用40%甲醛10 mL/m3、高錳酸鉀5 g/m3混合進(jìn)行熏蒸消毒，時間為20～30 min，消毒后要打開門窗通風(fēng)換氣1周以上。

5.4 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理在豬場內(nèi)給予豬適當(dāng)運(yùn)動，提高免疫力。提供清潔飲水，禁止飼喂霉變飼料、餐廚泔水和豬肉制品。定期驅(qū)殺體內(nèi)外寄生蟲。

5.5 加強(qiáng)排查監(jiān)測加大對生豬交易市場、屠宰場、無害化處理廠、邊境省份等重要和關(guān)鍵區(qū)域的巡查頻次，并開展針對性抽樣監(jiān)測。當(dāng)有疑似 ASF 發(fā)生時，除及時診斷處置外，應(yīng)盡快向上級獸醫(yī)管理部門上報(bào)疫情，同時在疫區(qū)嚴(yán)格實(shí)施封鎖、隔離、消毒等綜合措施。如果確診應(yīng)立即將病豬撲殺，尸體按國家相關(guān)規(guī)程進(jìn)行無害化處理。

6 小結(jié)

ASF可通過動物產(chǎn)品的國際國內(nèi)貿(mào)易、邊境互市、野生動物遷徙和節(jié)肢動物媒介等途徑傳播。ASFV感染的靶細(xì)胞是豬的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，并以其特有基因編碼數(shù)量眾多、機(jī)制復(fù)雜的病毒蛋白，參與吸附、侵入宿主細(xì)胞、復(fù)制與裝配、逃避免疫防御系統(tǒng)等功能，能更有效地感染宿主細(xì)胞，引起豬的急性、熱性、出血性臨床癥狀和病理損害。ASFV基因型較多，種類龐大，隨著對ASFV生物特性和分子特性研究的不斷深入，已從ASFV感染的細(xì)胞中分離鑒定出至少64種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。雖然有些病毒蛋白的功能尚不清楚，但隨著研究的不斷深入，ASFV的致病機(jī)制將會越來越清晰，同時也會研制出有效預(yù)防的疫苗。