• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    低離子強(qiáng)度下調(diào)節(jié)pH值對鯉肌球蛋白空間構(gòu)象的影響

    2019-05-18 06:55:06田元勇劉俊榮
    中國食品學(xué)報(bào) 2019年3期
    關(guān)鍵詞:肌球蛋白色氨酸溶解性

    田元勇 王 偉 宋 揚(yáng) 劉俊榮

    (大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧大連116023)

    我國淡水漁業(yè)資源豐富,2014年全國淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量2 935.76 萬t,占全國水產(chǎn)品總量的45.43%[1]。魚蛋白產(chǎn)品的開發(fā)與利用是大宗低值漁獲物的有效利用途徑,然而,目前低值魚蛋白的利用形式仍以魚粉和魚糜制品為主。魚粉的局限性在于其食用功能性差,只能用作動物飼料,產(chǎn)品附加值和利用率較低。魚糜技術(shù)存在蛋白回收率低,生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢水且處理難的問題。此外,魚糜技術(shù)對原料蛋白質(zhì)性質(zhì)要求苛刻,在非傳統(tǒng)原料,如中、上層魚類方面的應(yīng)用仍存在很多難題:產(chǎn)品凝膠特性差,脂質(zhì)氧化及血紅素蛋白導(dǎo)致的變色問題,這很大程度上限制了其對大部分低值魚蛋白的加工利用[2]。如何高效利用低值魚蛋白是目前水產(chǎn)品加工領(lǐng)域亟待解決的問題。

    pH 調(diào)節(jié)法是一種基于等電點(diǎn)沉淀的蛋白分離技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域[3-5]。近年來,蛋白分離技術(shù)越來越多地用于開發(fā)水產(chǎn)蛋白源[6-8]。以鯉魚為研究對象,探討pH 調(diào)節(jié)法對大宗低值淡水魚蛋白的分離特性。前期研究結(jié)果[9]表明pH 2.5 溶出-pH 5.5 沉淀可以回收76.30%的鯉肌肉蛋白,pH 12.5 溶出-pH 5.5 沉淀可以回收87.56%的魚肉蛋白。該方法不僅能有效回收鹽溶性肌原纖維蛋白,還能回收一部分水溶性蛋白。分離蛋白氨基酸組成合理,而且具有比魚肉更好的消化特性,胰凝乳蛋白酶的消化速率提高了7~8倍。pH 調(diào)節(jié)過程中,極端的酸堿環(huán)境會導(dǎo)致魚肉蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,進(jìn)而對功能性產(chǎn)生影響。Kristinsson 等[10]研究了0.6 mol/L KCl 條件下,pH 2.5 和pH 11 以及再調(diào)至pH 7.5 過程中鱈魚肌球蛋白空間構(gòu)象的變化。而對分離蛋白是先添加純水再調(diào)節(jié)pH 制備的,該過程并未添加鹽離子。本研究通過極低離子強(qiáng)度 (0.05 mol/L KCl)下,調(diào)節(jié)pH 過程中鯉肌球蛋白的Ca2+-ATPase 活性、α 螺旋含量、內(nèi)源熒光強(qiáng)度、巰基含量、表面疏水性等指標(biāo)的變化,探討肌球蛋白空間構(gòu)象改變規(guī)律,為大宗低值魚蛋白制備技術(shù)體系的建立和新型功能性分離魚蛋白的開發(fā)提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    活鯉魚購買于大連沃爾瑪超市。運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室立刻速殺,去頭、內(nèi)臟、鱗、鰭、鰓,然后清洗、去皮、去骨、采肉、放入斬拌料理機(jī)中絞碎成肉泥狀,放置于冰浴條件下備用。

    三磷酸腺苷二鈉,鹽酸胍,8-苯胺基-1-萘磺酸,美國Sigma 公司;KCl,CuSO4,NaOH,Tris,三氯乙酸等,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Z326K 高速冷凍離心機(jī),德國HERMLE 公司;J-715 熒光分光光度計(jì),日本分光株式會社;AE-6500 平板電泳槽,日本ATTO 株式會社;HG-200 高速分散均質(zhì)機(jī),日本HSIANGTAI;J-725 圓二色譜儀,日本分光株式會社。

    1.3 方法

    1.3.1 肌球蛋白的純化 肌球蛋白的提取參照Kato 和Konno[11]的方法進(jìn)行,絞碎的鯉魚肉中加入10 倍體積預(yù)冷的0.1 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)攪勻,4 ℃,5 000 g 離心5 min,取沉淀重復(fù)上述操作3 次。將收集的沉淀懸濁于上述緩沖液中,13 000 r/min 組織均質(zhì)2~3 次,每次間隔30 s。然后離心(5 000 g,10 min,4 ℃),收集沉淀。沉淀漂洗3 次后,懸濁于0.1 mol/L KCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液中,經(jīng)兩層紗布過濾所得濾液為肌原纖維蛋白。用3 mol/L KCl 將肌原纖維蛋白溶液的鹽濃度調(diào)至0.5 mol/L,加入2 mmol/L Mg-ATP,然后加入硫酸銨粉末至飽和度40%,靜止30 min 離心收集上清,再將上清液中硫酸銨飽和度調(diào)至50%,離心所得沉淀溶解于0.5 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)中,透析除硫酸銨。最后離心(12 000 g,20 min,4 ℃)所得溶液即為鯉肌球蛋白。

    1.3.2 鯉肌球蛋白的酸堿處理 加水調(diào)節(jié)肌球蛋白的鹽濃度至0.05 mol/L。分別加入0.05 mol/L HCl 或者0.05 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)肌球蛋白溶液的pH 至2.5,3.5,11.5,12.5,處理1 h 后用于后續(xù)分析。同時(shí)以溶解于0.5 mol/L KCl 20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖溶液和經(jīng)過6 mol/L 鹽酸胍(變性劑)處理的肌球蛋白溶液作為對照。所有操作均在0 ℃下進(jìn)行。

    1.3.3 肌球蛋白溶解性變化 加水調(diào)節(jié)肌球蛋白鹽濃度0.05 mol/L,蛋白質(zhì)量濃度至3 mg/mL。經(jīng)過上述pH 處理1 h 后,離心(10 000 g,10 min,4℃)收集上清液,用雙縮脲法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。另外pH 處理1 h-調(diào)回pH 7.5 后再次測定上清蛋白濃度。按照以下公式計(jì)算pH 調(diào)節(jié)過程中肌球蛋白溶解度變化。溶解度(%)=[(上清液蛋白濃度×體積)/(處理前體積×3 mg/mL)]×100

    1.3.4 肌球蛋白 Ca2+-ATPase 活性 按照THAVAROJ 等的方法[12]測定ATPase 酶活,1.0 mg/mL 肌球蛋白樣液經(jīng)過上述酸堿處理后,取0.1 mL 加入到0.9 mL 反應(yīng)液中(含有1 mmol/L ATP,5 mmol/L CaCl2和25 mmol/L Tris-馬 來 酸(pH 7.0)),在20 ℃反應(yīng)0,2,5,10,15,20,25,30 min后,加入15%高氯酸溶液終止反應(yīng)。采用鉬酸銨法[9]測定反應(yīng)中釋放的無機(jī)磷(Pi)含量來確定Ca2+-ATPase 活性的變化,酶活性單位為:μmol Pi/mg·min。

    1.3.5 圓二色譜(CD)分析 配制0.5 mg/mL 肌球蛋白樣液(含0.05 mol/L KCl),在冰水浴中pH 處理1 h,然后經(jīng)20 000 g,20 min 離心取上清進(jìn)行圓二色譜分析。圓二色譜儀各參數(shù)設(shè)置為:溫度4℃,波長掃描范圍為190~250 nm,分辨率為0.2 nm,縫寬為4 nm,靈敏度為20 mdeg,掃描時(shí)間間隔和掃描速度分別為1 s 和100 mdeg/min。

    1.3.6 色氨酸熒光分析 樣品處理按照CD 分析進(jìn)行同樣處理,使用Jasco J-715 熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長297 nm,光譜范圍為300~400 nm對各樣品進(jìn)行熒光掃描,狹縫寬度為5 nm。

    1.3.7 表面疏水性測定 采用ANS (8-苯胺基-1-萘磺酸)探針[10]檢測表面疏水性的變化。向鯉肌球蛋白溶液(0.5 mg/mL)中加入20 μL 的ANS 溶液 (8.0 mmol/L,0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液,pH 7.4)振蕩,靜置15 min(避光),使用熒光分光光度計(jì)測定樣品的熒光強(qiáng)度(FI)。試驗(yàn)中,ANS 熒光探針檢測的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390 nm 和470 nm,狹縫寬均為5 nm。減去各樣品溶液未加探針時(shí)的熒光強(qiáng)度即為每種蛋白的相對熒光強(qiáng)度值(RFI)。以相對熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度作圖,其初始段的斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(biāo)。

    1.3.8 總巰基含量測定 總巰基的測定參考Benjakul[13]的方法,分別取蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL(含0.05 mol/L KCl)的經(jīng)酸堿處理的肌球蛋白樣液0.5 mL,加入2 mL 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)緩沖液(含有8 mol/L 尿素,10 mmol/L EDTA,2% SDS),溫度控制在4 ℃下。然后加入50 μL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液 (10 mmol/L DNTB,pH 7.2),40 ℃反應(yīng)25 min,412 nm 比色,空白用20 mmol/L 的含0.6 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)。巰基含量按下式計(jì)算:

    巰基含量(mol·10-5·g-1)=式中:A——吸光值;D——釋釋倍數(shù);B——蛋白質(zhì)量濃度 (mg/mL);C——吸光系數(shù)13 600(mol-1·cm-1·L)。

    1.3.9 肌球蛋白的胰凝乳蛋白酶消化特性 根據(jù)Kato 和Konno 方法[11],配制3 mg/mL(含0.05 mol/L KCl)酸堿處理的肌球蛋白樣品,將pH 調(diào)解至7.0后,加入1 mmol/L EDTA 攪拌均勻并在20 ℃水浴條件下預(yù)熱2 min,使用質(zhì)量比1/500 胰凝乳蛋白酶在20 ℃水浴條件下分別消化0,5,10,20,40,60 min。然后取0.2 mL 分別加入1 mmol/L PMSF 和0.1 mL 電泳上樣液,充分混勻后在100 ℃下煮沸5 min。用7.5% SDS-PAGE 進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 肌球蛋白的分離純化

    通過圖1的SDS-PAGE 結(jié)果可知,在200 ku出現(xiàn)的條帶為肌球蛋白重鏈,在20.1~14.3 ku 出現(xiàn)的條帶為肌球蛋白輕鏈。分子質(zhì)量約44 ku 的肌動蛋白殘留量很少,肌球蛋白的純度可達(dá)85%。

    2.2 肌球蛋白的溶解性變化

    pH 處理對鯉肌球蛋白溶解性的影響如圖 2所示,在酸性pH(2.5 和3.5)和堿性pH(11.5 和12.5),肌球蛋白的溶解性較高,均達(dá)到90%左右。經(jīng)pH 變換處理后再調(diào)至pH 7.5 時(shí),溶解度顯著下降,并且初始pH 值越高,溶解度下降越明顯。肌球蛋白是鹽溶性蛋白,在0.05 mol/L KCl 條件下溶解度很低,需要一定的離子強(qiáng)度才能促進(jìn)其溶解[14]。蛋白質(zhì)的溶解性與蛋白質(zhì)分子大小和表面電荷有關(guān)[15]。在極端pH 條件下,肌球蛋白分子帶有較多的凈正電荷或凈負(fù)電荷,分子由于靜電排斥作用趨于解離,因而溶解度增加。并且愈是偏離等電點(diǎn),蛋白分子表面凈電荷愈多,蛋白溶解度愈高[16]。通過對肌球蛋白的溶解性的研究也進(jìn)一步證實(shí)了在分離蛋白制備的過程中,極端pH 條件下肌球蛋白回收率很高。將極端pH 調(diào)回中性7.5 時(shí),溶解度均顯著下降,這是由于在低離子強(qiáng)度鹽濃度下,靠近肌球蛋白的等電點(diǎn),蛋白分子與水之間的作用被蛋白之間的作用力所取代,減少了分子間靜電排斥作用,導(dǎo)致溶解度降低。同樣的結(jié)果在其他魚類如鱈魚肌原纖維[17]、鮭魚肌球蛋白[18]、巖魚[19]等研究中也有報(bào)道,并與Park 等[20]研究不同離子強(qiáng)度和pH 對鮭魚肌球蛋白的溶解性和構(gòu)象變化的影響結(jié)果一致。

    圖1 鯉肌球蛋白的電泳分析Fig.1 SDS-PAGE patterns of myosin from common carp muscle

    2.3 肌球蛋白的Ca2+-ATPase 活性變化

    圖2 pH 調(diào)節(jié)對鯉魚肌球蛋白溶解性的影響Fig.2 Effect of pH shift on solubility of myosin from common carp muscle

    以0.5 mol/L KCl,pH 7.5 的條件下測定的肌球蛋白Ca2+-ATPase 作為100,在0.05 mol/L KCl,pH 2.5,3.5,11.5,12.5 進(jìn)行酸堿處理后,未能檢測到Ca2+-ATPase 活性。即使再調(diào)節(jié)到pH 7.5 也未能檢測到Ca2+-ATPase 活性,結(jié)果如表1所示。由于肌球蛋白的球狀頭部具有ATPase 的活性,因此,可用Ca2+-ATPase 活性來評價(jià)肌球蛋白頭部構(gòu)象的變化[21]。肌球蛋白在極端酸性pH(2.5,3.5)和極端堿性pH(11.5,12.5),Ca2+-ATPase 活性為零,可能是由于經(jīng)極端pH 處理后鯉肌球蛋白頭部完全變性展開,空間構(gòu)象發(fā)生了變化。調(diào)回pH 7.5后,Ca2+-ATPase 活性仍為零。由此推測經(jīng)pH 處理后,肌球蛋白球狀頭部的構(gòu)象并未得到恢復(fù),空間構(gòu)象的改變是不可逆的。

    表1 pH 調(diào)節(jié)對鯉魚肌球蛋白的Ca2+-ATPase活性的影響Table 1 Effect of pH-shift on ATPase activity of common carp myosin

    2.4 肌球蛋白的α 螺旋含量變化

    pH 處理對肌球蛋白α 螺旋結(jié)構(gòu)的影響如圖3所示,與肌球蛋白(pH 7.5)相比,經(jīng)極端pH 處理的肌球蛋白在222 nm 處的負(fù)峰的大小基本沒有變化。經(jīng)過6 mol/L 鹽酸胍變性處理的樣品的負(fù)峰完全消失,由此推測α 螺旋的含量幾乎沒有發(fā)生變化。肌球蛋白的α 螺旋結(jié)構(gòu)主要存在于棒狀的尾部,因此可認(rèn)為pH 調(diào)節(jié)未造成肌球蛋白尾部的二級結(jié)構(gòu)的破壞。與Kristinsson 等[22]在對鱈魚肌球蛋白進(jìn)行pH 處理后二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變的結(jié)論是一致的。Konno 等[12]研究認(rèn)為肌球蛋白的溶解性主要與桿狀尾部的結(jié)構(gòu)有關(guān),也證明了分離蛋白可保持良好溶解性。

    圖3 pH 調(diào)節(jié)后肌球蛋白CD 圖譜的變化Fig.3 Effect of pH on Far-UV circular dichroism spectra

    2.5 肌球蛋白的色氨酸熒光分析

    肌球蛋白是由兩個(gè)球狀頭部和一個(gè)棒狀尾部組成[21],且肌球蛋白頭部和棒狀尾部均含有大量的色氨酸殘基。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸為蛋白內(nèi)源生色基團(tuán),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)熒光強(qiáng)度發(fā)生降低或增強(qiáng),最大吸收峰發(fā)生紅移或藍(lán)移,這種變化可用來衡量蛋白質(zhì)分子發(fā)生去折疊的程度,進(jìn)而反映蛋白的三級結(jié)構(gòu)的變化。圖4結(jié)果表明,pH 7.5 時(shí)色氨酸的最大熒光波長在340 nm 左右。經(jīng)堿性pH 處理后,肌球蛋白色氨酸的熒光光譜發(fā)生了顯著變化,色氨酸與溶劑分子發(fā)生熒光淬滅,且顯著紅移(349 nm)。而酸性條件下肌球蛋白無明顯的熒光淬滅,最大熒光波長仍為340 nm。RAGHAVAN 等[22]報(bào)道了在6 mol/L 的胍鹽酸中完全展開的肌球蛋白分子大部分色氨酸熒光淬滅且顯著紅移(350 nm)。據(jù)此推測堿性pH 處理后,肌球蛋白色氨酸殘基暴露程度更高,肌球蛋白展開變性程度更大。而極端酸性pH 處理后,色氨酸殘基暴露幾乎沒有發(fā)生變化。

    2.6 肌球蛋白的表面疏水性

    圖4 肌球蛋白經(jīng)pH 調(diào)節(jié)后的色氨酸熒光光譜Fig.4 Effect of pH on emission fluorescence spectra of denaturation myosin

    蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要靠疏水鍵作用來維持。ANS 是一種對極性敏感的陰離子型熒光探針,在蛋白質(zhì)疏水性測定中容易受到靜電作用力的干擾。不僅與天然的或完全變性的蛋白質(zhì)分子相互作用,且與不完全變性的蛋白質(zhì)分子的疏水性基團(tuán)產(chǎn)生更強(qiáng)的相互作用力,而使表面疏水性顯著增加。圖5結(jié)果表明,相比于pH 7.5 條件下,經(jīng)酸處理的肌球蛋白ANS-S0 顯著升高。而在堿性條件下,ANS-S0 幾乎沒有發(fā)生變化。肌球蛋白在酸、堿或高離子環(huán)境中,蛋白分子表面分別帶凈正電荷或凈負(fù)電荷,在靜電排斥作用下,蛋白質(zhì)分子展開,使蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和殘基暴露在蛋白質(zhì)分子表面,從而使ANS-S0 提高。但酸性(pH 2.0,3.5)條件下肌球蛋白的表面疏水性明顯高于堿性條件(pH 11.5,12.5)的。這可能是由于酸處理時(shí)用HCl 調(diào)節(jié)pH,這其中的陰離子Cl-能使肌球蛋白溶液產(chǎn)生促溶效應(yīng)[22],使得肌球蛋白在HCl 的酸性環(huán)境中變性更加嚴(yán)重。由此推斷,pH 調(diào)解法生產(chǎn)分離蛋白時(shí),魚肉經(jīng)過酸堿處理后,會對肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞,酸處理的影響可能更大。

    2.7 肌球蛋白的巰基含量

    圖5 肌球蛋白經(jīng)pH 調(diào)節(jié)后的表面疏水性Fig.5 Effect of pH on the surface hydrophobicity of myosin from common carp

    二硫鍵對維持蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象和穩(wěn)定性有重要作用,也是蛋白質(zhì)熱處理形成凝膠過程中必不可少的過程[23]。巰基含量的多少反應(yīng)二硫鍵形成情況。圖6結(jié)果顯示,pH 調(diào)節(jié)處理后,肌球蛋白巰基含量變化不大。肌球蛋白分子中有大約42 個(gè)巰基,約有24 或26 個(gè)在球狀頭部,每條堿性輕鏈中各有一個(gè),每個(gè)DTNB 輕鏈中有2 個(gè)。其中一部分活性巰基基團(tuán)存在于蛋白質(zhì)分子表面,一部分包裹在肌球蛋白棒狀尾部中[24]。與試驗(yàn)中的凝膠性結(jié)果一致,分離蛋白和新鮮魚肉的凝膠性幾乎沒有差別。

    2.8 肌球蛋白的胰凝乳蛋白酶消化特性

    pH 調(diào)節(jié)處理后肌球蛋白的消化模式發(fā)生了顯著的變化,如圖7所示,在pH 7.5(0.05 mol/L KCl,20 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA)的條件下,肌球蛋白的胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)主要發(fā)生在頭部S-1 以及尾部rod[11]。而經(jīng)過pH 調(diào)節(jié)后,無論酸性pH 處理還是堿性pH 都未觀察到S-1 條帶,說明酶切位點(diǎn)發(fā)生了變化。此外,經(jīng)過酸處理之后,MHC 的消失效率比pH 7.5 提高了大約3 倍。堿處理后也略有提高,進(jìn)一步說明了肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

    圖6 肌球蛋白經(jīng)pH 調(diào)節(jié)后的巰基含量Fig.6 Effect of pH on the sulfhydryl group contents of myosin from common carp

    圖7 pH 調(diào)節(jié)對肌球蛋白的胰凝乳蛋白酶消化位點(diǎn)的影響Fig.7 Effect of pH-shift on digestion site of myosin by α-chymotrypsin

    3 結(jié)論

    在極低離子強(qiáng)度(0.05 mol/L KCl)條件下,鯉肌球蛋白經(jīng)過pH 調(diào)節(jié)后,α 螺旋含量沒有發(fā)生變化,說明pH 調(diào)節(jié)未引起二級結(jié)構(gòu)的改變。球狀頭部的Ca2+-ATPase 活性喪失,胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)變化,均說明肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)遭到了破壞。但是,堿性pH 造成色氨酸殘基暴露程度更高,酸性pH 導(dǎo)致疏水性基團(tuán)暴露更多,也反映出酸堿pH調(diào)節(jié)導(dǎo)致的三級結(jié)構(gòu)的改變存在差異。

    猜你喜歡
    肌球蛋白色氨酸溶解性
    色氨酸在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的營養(yǎng)作用
    共沉淀引發(fā)的溶解性有機(jī)質(zhì)在水鐵礦/水界面的分子分餾特性*
    垃圾滲濾液溶解性有機(jī)物的分子指紋特征
    色氨酸的來源、代謝途徑及其在家禽生產(chǎn)上的應(yīng)用
    溶解性有機(jī)質(zhì)對水中重金屬生物有效性的影響研究
    碳質(zhì)材料催化臭氧氧化去除水中溶解性有機(jī)物的研究進(jìn)展
    肌球蛋白磷酸化的研究進(jìn)展
    高糖對體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性及肌球蛋白輕鏈磷酸化的影響
    心臟型肌球蛋白結(jié)合蛋白與射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭
    豬對色氨酸需要量的研究
    飼料博覽(2014年11期)2014-05-04 10:00:12
    亚洲性久久影院| 国产精品久久久久久精品电影| 99热这里只有是精品50| 亚洲人成网站在线播| 如何舔出高潮| 欧美另类亚洲清纯唯美| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久国产成人精品二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人av在线播放网站| 国产中年淑女户外野战色| 国产麻豆成人av免费视频| 三级毛片av免费| 日本黄色片子视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一级毛片久久久久久久久女| 免费搜索国产男女视频| 成人午夜高清在线视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩亚洲欧美综合| 青春草国产在线视频| 国产91av在线免费观看| 在线播放国产精品三级| 十八禁国产超污无遮挡网站| 夜夜爽夜夜爽视频| 看黄色毛片网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲电影在线观看av| 神马国产精品三级电影在线观看| 日本午夜av视频| 久久99精品国语久久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 在线天堂最新版资源| 成人二区视频| 欧美极品一区二区三区四区| 精品国内亚洲2022精品成人| 一边亲一边摸免费视频| 国产av在哪里看| 少妇丰满av| 我的女老师完整版在线观看| 色综合站精品国产| 日本爱情动作片www.在线观看| 美女国产视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 亚洲内射少妇av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| av国产久精品久网站免费入址| 99久久无色码亚洲精品果冻| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产私拍福利视频在线观看| 久久久精品94久久精品| 淫秽高清视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品久久久久久av不卡| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品一二三区在线看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品一区二区三区人妻视频| av国产免费在线观看| 国产视频首页在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 男女视频在线观看网站免费| 高清在线视频一区二区三区 | 久久这里有精品视频免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产淫语在线视频| 久久久a久久爽久久v久久| 免费观看精品视频网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 精品熟女少妇av免费看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产三级中文精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 美女高潮的动态| 18禁动态无遮挡网站| 国产日韩欧美在线精品| 国产色爽女视频免费观看| kizo精华| 亚洲图色成人| 欧美97在线视频| 黄色一级大片看看| 成年女人看的毛片在线观看| 特级一级黄色大片| 高清午夜精品一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产成人91sexporn| 我要看日韩黄色一级片| 两个人视频免费观看高清| 99热6这里只有精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久99精品国语久久久| 亚洲高清免费不卡视频| 国产探花在线观看一区二区| 日韩av不卡免费在线播放| 久久99热这里只有精品18| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲在线观看片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 少妇的逼好多水| 热99re8久久精品国产| 国产午夜精品一二区理论片| 精品国产露脸久久av麻豆 | 最近最新中文字幕免费大全7| 久久久久九九精品影院| 亚洲av中文字字幕乱码综合| av国产免费在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成人一区二区视频在线观看| 男人舔奶头视频| 乱人视频在线观看| av线在线观看网站| ponron亚洲| 欧美一区二区国产精品久久精品| 如何舔出高潮| 18+在线观看网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 97在线视频观看| 久久人人爽人人片av| 日韩成人伦理影院| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产成人a∨麻豆精品| 高清在线视频一区二区三区 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲成人av在线免费| 久久久久久久久久黄片| 人妻系列 视频| 欧美+日韩+精品| 久久精品国产自在天天线| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 亚洲av熟女| 又爽又黄a免费视频| 亚洲电影在线观看av| 国产一区二区在线av高清观看| 99热6这里只有精品| 天天一区二区日本电影三级| 99热网站在线观看| 国产视频内射| 精品国产露脸久久av麻豆 | 国产单亲对白刺激| 真实男女啪啪啪动态图| 国产成人freesex在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品久久久久久久久av| 国产精品蜜桃在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 最近视频中文字幕2019在线8| 免费看日本二区| 黄色日韩在线| 淫秽高清视频在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产成人精品久久久久久| 日韩制服骚丝袜av| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲三级黄色毛片| 日本五十路高清| 成人午夜高清在线视频| 麻豆一二三区av精品| 国产一区二区三区av在线| 欧美成人a在线观看| 欧美97在线视频| 黄片无遮挡物在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| a级一级毛片免费在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 青青草视频在线视频观看| 国产精品三级大全| 一区二区三区免费毛片| 精品久久久久久久末码| 毛片女人毛片| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产精品一区二区性色av| 小说图片视频综合网站| 国产淫语在线视频| 精品熟女少妇av免费看| 1024手机看黄色片| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久精品91蜜桃| 美女国产视频在线观看| 久久久色成人| 国产成人精品一,二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜a级毛片| 插阴视频在线观看视频| 伦精品一区二区三区| 亚洲av.av天堂| 一级黄片播放器| 91精品一卡2卡3卡4卡| 男人舔奶头视频| 在线免费观看的www视频| 精品久久久久久久久av| 18禁在线播放成人免费| 国产亚洲精品久久久com| 精品久久久久久成人av| 国产精品99久久久久久久久| 男人舔奶头视频| 久久久精品94久久精品| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久精品大字幕| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲av.av天堂| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久久a久久爽久久v久久| 人体艺术视频欧美日本| 色吧在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av日韩在线播放| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 人体艺术视频欧美日本| 狠狠狠狠99中文字幕| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 中文欧美无线码| 午夜老司机福利剧场| 国产成人午夜福利电影在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久人人爽人人片av| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 日韩亚洲欧美综合| 女人久久www免费人成看片 | 免费av不卡在线播放| 97在线视频观看| 久久久久久久久久久丰满| 男的添女的下面高潮视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 一级爰片在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产极品精品免费视频能看的| 搡老妇女老女人老熟妇| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美成人精品欧美一级黄| 国内精品美女久久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美日本视频| 一边亲一边摸免费视频| av黄色大香蕉| 国产精品福利在线免费观看| 成人av在线播放网站| 一个人看的www免费观看视频| 国国产精品蜜臀av免费| av在线老鸭窝| 日本wwww免费看| 99热6这里只有精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲五月天丁香| 欧美日本视频| 亚洲精品国产成人久久av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 午夜福利在线在线| 麻豆成人午夜福利视频| 久久精品91蜜桃| 欧美激情在线99| 99久久精品一区二区三区| 热99在线观看视频| 免费人成在线观看视频色| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国内精品宾馆在线| 小说图片视频综合网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 99久国产av精品| 岛国在线免费视频观看| 午夜免费激情av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日韩成人伦理影院| 国语自产精品视频在线第100页| 国产午夜福利久久久久久| 国产高清视频在线观看网站| 久99久视频精品免费| 赤兔流量卡办理| 国产精品无大码| videossex国产| 国产综合懂色| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品,欧美在线| 亚洲国产色片| 免费av观看视频| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人二区视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产亚洲91精品色在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| av线在线观看网站| 日本免费在线观看一区| 男女国产视频网站| 国产久久久一区二区三区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品人妻久久久影院| 国产成人aa在线观看| 免费av观看视频| 久久国产乱子免费精品| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产成人精品一,二区| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 91狼人影院| 热99在线观看视频| 国产麻豆成人av免费视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| 能在线免费观看的黄片| 国产亚洲精品av在线| 免费观看a级毛片全部| 99热6这里只有精品| 久久久久久九九精品二区国产| 久久久久九九精品影院| av.在线天堂| 欧美成人一区二区免费高清观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 高清日韩中文字幕在线| 51国产日韩欧美| 免费av不卡在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| av线在线观看网站| 亚洲精品自拍成人| 日本爱情动作片www.在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 麻豆国产97在线/欧美| 99九九线精品视频在线观看视频| 午夜福利成人在线免费观看| 女人久久www免费人成看片 | 一级av片app| 在线a可以看的网站| 高清av免费在线| 51国产日韩欧美| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品一区www在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日本黄色片子视频| 全区人妻精品视频| 青春草亚洲视频在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲av中文av极速乱| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美日本视频| 免费电影在线观看免费观看| 午夜激情福利司机影院| 免费av不卡在线播放| 深爱激情五月婷婷| 国产色婷婷99| 26uuu在线亚洲综合色| 人妻系列 视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美zozozo另类| 秋霞伦理黄片| 日韩精品有码人妻一区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产精品无大码| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久鲁丝午夜福利片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 九九热线精品视视频播放| 国产乱人偷精品视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 99热6这里只有精品| 国产av在哪里看| 51国产日韩欧美| 永久网站在线| 久99久视频精品免费| 午夜福利网站1000一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品精品国产色婷婷| 一级爰片在线观看| 热99在线观看视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 最新中文字幕久久久久| 亚洲精品一区蜜桃| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产成人a区在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| av免费观看日本| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精华一区二区三区| www.av在线官网国产| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 伊人久久精品亚洲午夜| 精品久久久久久久末码| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国内精品宾馆在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 99热这里只有是精品在线观看| 国产一区二区三区av在线| 老司机福利观看| 日本wwww免费看| 久久人妻av系列| 天堂√8在线中文| 美女被艹到高潮喷水动态| av在线老鸭窝| 亚洲欧洲日产国产| 久久久久久久久中文| 一级二级三级毛片免费看| 日本熟妇午夜| 精品久久久久久久末码| 国产成人精品久久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲av中文av极速乱| 女人被狂操c到高潮| 国产 一区精品| 欧美高清性xxxxhd video| 美女国产视频在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日韩强制内射视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 内地一区二区视频在线| av又黄又爽大尺度在线免费看 | av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产亚洲91精品色在线| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美一区二区亚洲| 免费av不卡在线播放| 99久国产av精品国产电影| 人妻夜夜爽99麻豆av| 秋霞在线观看毛片| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av免费在线看不卡| 国产一区亚洲一区在线观看| 看片在线看免费视频| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久6这里有精品| 熟女电影av网| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产在视频线在精品| 亚洲内射少妇av| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久午夜福利片| 我的老师免费观看完整版| 午夜福利视频1000在线观看| 日本免费在线观看一区| 99热6这里只有精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜久久久久精精品| 亚洲欧洲日产国产| 少妇熟女aⅴ在线视频| 性色avwww在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 人妻系列 视频| 日韩精品有码人妻一区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久久久大精品| 伦理电影大哥的女人| 一本久久精品| 日日啪夜夜撸| 成人亚洲精品av一区二区| 日韩欧美三级三区| 久久亚洲国产成人精品v| 免费大片18禁| 国产伦理片在线播放av一区| 99在线人妻在线中文字幕| 七月丁香在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 男人和女人高潮做爰伦理| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品精品国产色婷婷| 成人欧美大片| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲国产色片| 色5月婷婷丁香| 嫩草影院精品99| 午夜视频国产福利| 国产精品,欧美在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 99久久精品热视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩中字成人| 欧美成人精品欧美一级黄| 哪个播放器可以免费观看大片| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品福利在线免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 乱系列少妇在线播放| 国产高潮美女av| 国产人妻一区二区三区在| ponron亚洲| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩高清综合在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美色视频一区免费| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 日本黄大片高清| 久久久色成人| 国产精品综合久久久久久久免费| 能在线免费观看的黄片| 久久精品91蜜桃| 亚洲国产最新在线播放| 国产老妇女一区| 一区二区三区乱码不卡18| 成年版毛片免费区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产亚洲精品av在线| 久久综合国产亚洲精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费大片18禁| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 青青草视频在线视频观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费观看性生交大片5| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久韩国三级中文字幕| 国产老妇女一区| 国产亚洲精品久久久com| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久久网色| 亚洲av中文av极速乱| 成人鲁丝片一二三区免费| 色噜噜av男人的天堂激情| 直男gayav资源| 99久久中文字幕三级久久日本| 青春草视频在线免费观看| 日韩强制内射视频| 天天一区二区日本电影三级| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品1区2区在线观看.| av卡一久久| av在线蜜桃| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲精品,欧美精品| 国产综合懂色| 一夜夜www| 国产精品综合久久久久久久免费| 99久久人妻综合| av在线天堂中文字幕| 插逼视频在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 男女啪啪激烈高潮av片| 美女高潮的动态| 欧美日韩在线观看h| 如何舔出高潮| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品永久免费网站| 亚洲伊人久久精品综合 | 网址你懂的国产日韩在线| av卡一久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 美女高潮的动态| 亚洲乱码一区二区免费版| 嘟嘟电影网在线观看| www.色视频.com| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产亚洲最大av| 亚洲欧美日韩东京热| 一本久久精品| av免费观看日本| 午夜视频国产福利| 国产在视频线精品| 国产 一区精品| 看片在线看免费视频| 插阴视频在线观看视频| 五月伊人婷婷丁香| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜视频国产福利| 午夜福利视频1000在线观看| 少妇丰满av| 亚洲成av人片在线播放无| 在现免费观看毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩亚洲欧美综合| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美人与善性xxx| 精品人妻熟女av久视频| 美女国产视频在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜激情欧美在线| 亚洲国产欧洲综合997久久,|