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    基于實時熒光環(huán)介導等溫擴增快速檢測雞肉中的大腸桿菌O157:H7

    2019-05-18 06:56:34趙遠洋林麗萍郜彥彥吳國平
    中國食品學報 2019年3期
    關鍵詞:增菌雞肉活性炭

    趙遠洋 王 瑾 林麗萍 郜彥彥 吳國平

    (江西農業(yè)大學食品科學與工程學院 南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室 南昌330045)

    大腸桿菌(E.coli)O157:H7 是腸出血性大腸桿菌中最常見的血清型,也是其多種血清型中最主要的致病菌株,感染劑量低于5 CFU[1-2]。感染該菌可使人患腹瀉、出血性結腸炎(hemorhabic colitis,HC),還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等嚴重并發(fā)癥,致死率達5%~10%[3]。自1983年美國Riley 等[4]首次報道腸出血性大腸桿菌O157:H7以來,相繼在英國、加拿大、日本、德國等多國出現爆發(fā)性流行病例。我國自1986年江蘇徐州市首次報道大腸桿菌O157:H7 感染以來,廣西、海南、廣東等地都先后出現并分離到大腸桿菌O157:H7[5]。在世界范圍內,家畜及其肉制品是大腸桿菌O157:H7 主要的傳播途徑,其中雞、牛、豬等是該菌主要感染對象[6]。如何快速檢測食品尤其是肉類食品中污染的大腸桿菌O157:H7,是有效防控大腸桿菌O157:H7 食源性疾病爆發(fā)的必要條件。

    目前檢測大腸桿菌O157:H7 的方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、免疫學和分子生物學檢測[7-9]。這些方法在不同的檢測要求下都有各自的優(yōu)點,也都存在不足,比如耗費時間長,操作過程繁瑣及檢測靈敏度低等。環(huán)介導等溫擴增技術自2000年日本科學家Notomi 發(fā)明以來[10],因其可在等溫條件下數十分鐘內完成核酸的高倍擴增,從而成為繼PCR 技術之后又一新型快速、 簡便的分子生物學檢測技術。目前各國研究人員在此基礎上發(fā)展出多種病原菌的LAMP 檢測方法,比如副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)[11]、沙門氏菌[12]、人乳頭瘤病毒(HPV16)[13]、副溶血性弧菌[14]等。與PCR 等其它方法相比,LAMP 有獨特的優(yōu)點,如在等溫條件下即可完成擴增反應,反應時間短 (40~60 min),靈敏度較高,反應溫度較低(60~65 ℃),甚至可肉眼直接判斷反應結果[15]。

    許多研究表明,食品中存在多種水溶性DNA聚合酶抑制劑,會干擾PCR 等分子生物學方法檢測食品中致病菌?;钚蕴渴且环N具有較大表面積、復雜孔隙結構的物質,具有良好的吸附性能,可以用來消減干擾PCR 聚合酶活性的抑制劑[16]。由于活性炭同時能吸附細菌,所以需對其表面進行適當封閉,從而防止細菌被吸附。據文獻[17]報道,使用蒙脫石封閉的活性炭可以消減食品中抑制劑,不影響食品中細菌的回收。

    Midori Green 是一種新型的核酸熒光染料,具有靈敏性高,毒性低,安全性好的優(yōu)點,而利用該染料進行實時熒光定量LAMP 法 (Rti-LAMP)的報道不多[18]。本研究采用Midori Green 為核酸染料,建立大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 檢測技術;通過模擬雞肉污染大腸桿菌O157:H7,建立基于Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中的大腸桿菌O157:H7 并與國標檢測法進行對比。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大腸桿菌O157:H7 ATCC BAA-708 菌株,本實驗室保存;雞脯肉樣品,市場購買;月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)、EC 肉湯等,青島高科園海博科技有限公司產品;胰蛋白酶大豆肉湯(TSB),美國Difco 公司;Bst DNA polymerse,新西蘭Biolabs 公司;Midori Green,dNTPs,Bulldog Bio公司;2×Taq Master Mix,上海欣百諾生物科技有限公司;Whirl-Pak 均質過濾袋,美國Nasco 公司;八 連 管,BIO-RAD;Activated carbon (Filtrasorb 200),美國Calgon Carbon 公司。

    1.2 儀器與設備

    拍擊式均質機,AES chemuex 公司;紫外可見分光光度計(WFZ-UV-2100),尤尼科(上海)儀器有限公司;GL-21M 高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;XB-150B 全自動雪花制冰機,寧波新藝超聲設備有限公司;凝膠成像系統(tǒng),法國Vibler Lourmat 公司;電泳儀(EPS300)、電泳槽(VE-180),上海天能科技有限公司;熒光PCR 儀,CFX Connect Real-time System,BIORAD。

    1.3 方法

    1.3.1 引物設計與合成 針對大腸桿菌 O157:H7 (VT2)基因,參考Hara-Kudo 等[19]設計了6 條特異性引物用于Rti-LAMP,包括兩條內引物(FIP/BIP),兩條外引物(F3/B3),兩條環(huán)引物(Loop F/ Loop B),詳見表1。引物由北京鼎國生物技術有限公司合成。

    1.3.2 細菌培養(yǎng)、計數及細菌DNA 提取 將活化的大腸桿菌O157:H7 接種于3 mL TSB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min 過夜培養(yǎng)16~18 h,以3%菌液量轉接于10 mL TSB 液體培養(yǎng)基,37 ℃,150 r/min 培養(yǎng)1.5 h 左右至對數期細菌(OD600≈0.5)。將菌液用滅菌的生理鹽水按10 倍梯度依次稀釋,取100 μL 涂于平板,培養(yǎng)18~24 h 細菌計數,測定OD600的數值,建立OD600值與菌濃度的標準曲線。

    細菌總DNA 制備,生理鹽水稀釋的細菌500 μL 加入500 μL 2×TZ 裂解液[20],于99.5 ℃下加熱10 min,冰上冷卻后高速離心5 min,取上清即為細菌DNA 模板。

    表1 LAMP 引物Table 1 Primers used in the Rti-LAMP

    1.3.3 Rti-LAMP 反應 Rti-LAMP 反應體系總體積 為25 μL:2.5 μL 10×buffer,5 μL 25 mmol/L MgCl2,2.5 μL 12.5 mmol/L dNTPs,2 μL 20 mmol/L FIP,2 μL 20 mmol/L BIP,0.4 μL 20 mmol/L F3,0.4 μL 20 mmol/L B3,1.2 μL 20 mmol/L Loop F,1.2 μL 20 mmol/L Loop B,1 μL 1 ∶500 稀釋的熒光染料Midori Green,0.9 μL Bst 聚合酶,2 μL DNA 模板,無菌去離子水補足至25 μL。制備好的反應管放入BIO-RAD CFX Connect Real-time System 內65 ℃擴增反應60 min。每分鐘讀取熒光數值,設定樣品熒光值出現指數增加的時間為Tp值(類似于Rti-PCR 的Ct 值)[21-22],測定Tp 值與細菌濃度之間關系函數。

    1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳 Rti-LAMP 產物上樣于2%瓊脂糖凝膠,將1 μL 的Midori Green 原液加入到20 mL 瓊脂糖凝膠后進行電泳。電泳條件為:電壓80 V,電流60 mA,時間35 min,取出置于凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

    1.3.5 蒙脫石封閉活性炭(BCAC)的制備 16 g活性炭用蒸餾水沖洗至流水無色,放入烘箱烘干待用。取蒙脫石4 g 加蒸餾水200 mL,振蕩搖勻至完全溶解,轉移至250 mL 離心杯中室溫下700 r/min,1 min,將上清液倒入加了上述活性炭的三角瓶中,37 ℃下150 r/min,振蕩3 h。然后轉移到55℃烘箱中烘干備用。

    1.3.6 模擬大腸桿菌O157:H7 污染雞肉樣品 取25 g 經國標檢測大腸桿菌O157:H7 陰性的雞肉樣品,置于裝有75 mL PBS(50 mmol/L)緩沖液的Whirl-Pak 均質過濾袋中,加入生理鹽水稀釋至適宜濃度的大腸桿菌O157:H7 0.5 mL,以制備濃度為0,140,450,1 400,4 500,14 000,45 000 CFU/g的人工模擬污染樣品,將均質袋置于均質機中,37℃下拍打1 min,隨后放入37 ℃的水浴增菌4 h。樣品過濾液轉移至離心杯中,800 r/min 離心5 min,上清液通過含0.5 g 玻璃棉的滅菌注射器過濾,取過濾液用于樣品中細菌DNA 的提取。

    1.3.7 封閉活性炭對雞肉樣品前處理 模擬大腸桿菌O157:H7 污染雞肉樣品的步驟見1.3.6 節(jié),但不經過增菌培養(yǎng)。濾液轉移至離心杯中,10 000 r/min 離心5 min,除去上清,用30 mL PBS(50 mmol/L)緩沖液重懸,加入4 g 制備的BCAC,37℃150 r/min 振蕩15 min,用含0.2 g 玻璃棉的滅菌注射器過濾,取過濾液用于樣品中細菌DNA 的提取。

    1.3.8 樣品中細菌DNA 的提取 將過濾液于10 000 r/min 下離心5 min,棄上清,沉淀重懸于0.5 mL 生理鹽水,加入等體積2×TZ 裂解液,混勻后于99.5 ℃下加熱10 min,冰浴2 min 后12 000 r/min 離心10 min,上清即為樣品DNA 模板,取2 μL 作為Rti-LAMP 反應模板。

    1.3.9 臨床雞肉樣品的對比檢測 從市場上購買51 份冷凍雞肉樣品,利用增菌Rti-LAMP、封閉活性炭預處理未增菌的Rti-LAMP 和國標法(GB 4789.38-2012 食品安全國家標準食品微生物學檢驗),同時檢測這些雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7污染情況。

    2 結果與分析

    2.1 大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 檢測方法建立

    以大腸桿菌 O157:H7 裂解液為模板,結合Midori green 核酸熒光染料,通過設計的6 條特異性引物進行Rti-LAMP 反應,其結果顯示陽性樣品在30 min 之內出現熒光值呈指數增加,而陰性樣品則沒有熒光指數增加現象。為測定Rti-LAMP的靈敏度,設置了0,1.1,3.5,11,35,110,350 CFU/管,共7 個梯度,結果表明3.5 CFU/管可穩(wěn)定擴增檢出,低于該濃度則檢出穩(wěn)定性不夠,故該Rti-LAMP 的檢測靈敏度為3.5 CFU/管(圖1)。以熒光值500 作為衡量各反應熒光指數增加出現的時間(Tp 值),以Tp 值為縱坐標,lg(CFU/管)為橫坐標,則細菌CFU 與Tp 值之間的線性回歸方程為Y=-2.1632X+22.655,決定系數R2=0.9896,表明在3.5~350 CFU/管范圍內,其細菌濃度與其相應的Tp 值具有良好的線性關系,通過Rti-LAMP的Tp 值可實現定量檢測大腸桿菌O157:H7(圖1)。大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 擴增產物電泳圖如圖2所示,典型LAMP 擴增產物是一系列梯度的DNA 片段混合物,在電泳圖上呈現出規(guī)律的梯狀條帶,表明本研究建立的Rti-LAMP 法檢測大腸桿菌O157:H7 具有良好的特異性。

    圖1 典型Rti-LAMP 擴增大腸桿菌O157:H7 熒光曲線及Tp 值與lg(CFU/反應)的線性回歸方程Fig.1 Rti-LAMP plots and linear detection plot of E.coli O157:H7 derived from various numbers of log phase E.coli O157:H7 cells

    2.2 增菌前處理的Rti-LAMP 檢測人工模擬大腸桿菌O157:H7 污染的雞肉樣品

    為研究Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 的靈敏度和特異性,本研究人工模擬大腸桿菌O157:H7 污染雞肉樣品,經37 ℃增菌4 h后,提取樣品DNA 進行Rti-LAMP 檢測。結果表明,Rti-LAMP 能穩(wěn)定檢測140 CFU/g 的樣品,顯示該方法檢測靈敏度為140 CFU/g(圖3),整個檢測時間約為7 h。以Tp 值為縱坐標,lg(CFU/g)為橫坐標,建立的線性回歸方程為:Y=-3.9792X+31.218,決定系數R2=0.9504,表明本研究增菌前處理的Rti-LAMP 具有定量分析檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 的污染程度(圖3)。如圖4所示,擴增產物與純菌擴增產物的電泳條帶完全一致,說明該方法檢測雞肉中大腸桿菌O157:H7 特異性良好。

    圖2 Rti-LAMP 擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Product of amplicons derived from Rti-LAMP reactions by agarose gel electrophoresis

    圖3 Rti-LAMP 檢測模擬大腸桿菌O157:H7 污染的雞肉樣品的擴增曲線及Tp 值與lg(CFU/g)的線性函數Fig.3 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP and linear detection plot of E.coli O157:H7 derived from various numbers of seeded chicken

    圖4 模擬污染的雞肉樣品Rti-LAMP 擴增產物電泳圖Fig.4 Product of amplicons derived from Rti-LAMP reactions in samples filtrate of chicken by agarose gel electrophoresis

    2.3 封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測人工模擬E.coli O157:H7污染的雞肉樣品

    封閉活性炭的用量經本實驗室優(yōu)化[23]后,確定處理每份樣品的用量為4 g。使用封閉活性炭處理人工模擬污染大腸桿菌O157:H7 的雞肉樣品,不經過增菌步驟,提取樣品DNA 進行檢測。結果表明,使用封閉活性炭處理后的Rti-LAMP 能穩(wěn)定檢測出12 CFU/g 的雞肉樣品(圖5),表明經封閉活性炭預處理的Rti-LAMP 較增菌前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度提高約10 倍。3 次重復試驗,以Tp 平均值為縱坐標,lg(CFU/g)為橫坐標,線性回歸方程為:Y=-3.1888X+24.684,決定系數R2=0.9905,說明在12~4 000 CFU/g 范圍內具有良好的可定量分析特性。

    圖5 經活性炭處理后Rti-LAMP 的擴增曲線及Tp 值與lg(CFU/g)的線性函數Fig.5 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP after activated carbon treated and linear detection plot of E.coli O157:H7 derived from various numbers of seeded chicken

    2.4 3 種方法對比檢測臨床雞肉樣品

    使用上述建立的兩種大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 方法和國標法進行對比檢測分析,對市場上購買的51 份冷凍雞肉樣品進行大腸桿菌O157:H7 檢測,檢測結果見表2。結果表明,增菌前處理的Rti-LAMP 和國標法,均檢測到1 份大腸桿菌O157:H7 陽性樣品,且為同一份雞肉樣品;而使用封閉活性炭預處理的Rti-LAMP 法,還檢測到另外7 份陽性樣品(共8 份)。因此,本研究建立的雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 增菌前處理的Rti-LAMP 檢測方法與國標法靈敏度相當,而使用封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測方法則具有更高的檢測靈敏度,且檢測時間極大地縮短至4.5 h 左右。

    表2 3 種檢測方法對臨床雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 的檢測結果Table 2 Three methods detected clinical chicken samples for E.coli O157:H7

    為驗證臨床雞肉樣品大腸桿菌O157:H7 Rti-LAMP 檢測的特異性,將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳(圖6),結果DNA 擴增條帶與大腸桿菌O157:H7 純菌擴增條帶一致,表明本研究建立的Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 具有良好的特異性。

    圖6 臨床雞肉樣品Rti-LAMP 擴增產物電泳圖Fig.6 Detection of amplicons derived from Rti-LAMP reactions in clinical samples of chicken by agarose gel electrophoresis

    3 討論

    本研究根據大腸桿菌O157:H7 的VT2 基因設計了6 條特異性引物,結合Midori Green 新型核酸染料,建立了大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 檢測方法,其中純培養(yǎng)菌液靈敏度達到3.5 CFU/反應,模擬大腸桿菌O157:H7 污染的雞肉樣品中增菌前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度為140 CFU/g,整個檢測流程可在7 h 內完成;而經封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度為12 CFU/g,需時約4.5 h 左右。

    檢測的51 份臨床雞肉樣品,增菌前處理的Rti-LAMP 方法和國標法檢出率均為1.96%。據Zhang 等[5]對中國南方多個省市183 份雞肉污染情況調查,結果大腸桿菌O157:H7 的陽性檢出率為3.28%。這與本試驗的檢測結果大致相似,表明Rti-LAMP 與國標法具有相同的檢測靈敏度,但Rti-LAMP 所需時間約7 h,可在一個工作日內完成,較國標法節(jié)省了時間和人力。

    研究表明,由于食品成分的復雜性,其中存在著多種水溶性DNA 聚合酶抑制劑,對檢測的靈敏度和穩(wěn)定性產生很大的影響[16]。例如本研究中未經封閉活性炭處理的Rti-LAMP 對模擬污染的雞肉樣品進行檢測,其線性函數的R2系數較低(0.9504),顯示食品組分中的抑制劑對擴增反應有一定的影響。本研究嘗試使用蒙脫石封閉的活性炭進行前處理以消減抑制劑,結果表明經封閉的活性炭前處理人工模擬大腸桿菌O157:H7 污染的雞肉樣品,相比增菌但未使用封閉活性炭處理的Rti-LAMP 方法靈敏度提高了約10 倍。封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢出臨床雞肉樣品8份大腸桿菌O157:H7 陽性,進一步說明該方法檢測靈敏度確實有很大的提高,同時不需要增菌,極大地縮短檢測至4.5 h。封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 法檢出雞肉樣品大腸桿菌O157:H7 高陽性率,推測可能的原因主要有兩點:一是雞肉中污染的大腸桿菌O157:H7 濃度并不低,但由于食品在加工儲藏過程中會對細菌造成抑制和損傷,導致細菌活力降低甚至死亡,增菌培養(yǎng)時,損傷細菌不易生長繁殖,從而影響了國標法的檢出率;但由于Rti-LAMP 法是對目標菌DNA 的擴增檢測,損傷細菌其DNA 可以作為擴增模板;二是封閉活性炭消減雞肉中可溶性抑制劑效果好,解除了抑制劑對DNA 聚合酶的抑制作用,從而極大地提高了Rti-LAMP 檢測靈敏度。國家食品安全標準(GB 29921-2013)中規(guī)定,同一批次的5 份樣品中大腸桿菌O157:H7 的檢出率為0,說明對大腸桿菌O157:H7 有著嚴格的限定標準,所以嚴格控制大腸桿菌O157:H7 的檢出對于保障食品安全具有重要意義。當然,本研究建立的Rti-LAMP 方法無法區(qū)別目標菌是死菌還是活菌,如何利用分子生物學方法進行鑒別,實現臨床樣品致病菌更精準的檢測,仍需進一步研究。

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