• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于實時熒光環(huán)介導等溫擴增快速檢測雞肉中的大腸桿菌O157:H7

    2019-05-18 06:56:34趙遠洋林麗萍郜彥彥吳國平
    中國食品學報 2019年3期
    關鍵詞:增菌雞肉活性炭

    趙遠洋 王 瑾 林麗萍 郜彥彥 吳國平

    (江西農業(yè)大學食品科學與工程學院 南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室 南昌330045)

    大腸桿菌(E.coli)O157:H7 是腸出血性大腸桿菌中最常見的血清型,也是其多種血清型中最主要的致病菌株,感染劑量低于5 CFU[1-2]。感染該菌可使人患腹瀉、出血性結腸炎(hemorhabic colitis,HC),還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)等嚴重并發(fā)癥,致死率達5%~10%[3]。自1983年美國Riley 等[4]首次報道腸出血性大腸桿菌O157:H7以來,相繼在英國、加拿大、日本、德國等多國出現爆發(fā)性流行病例。我國自1986年江蘇徐州市首次報道大腸桿菌O157:H7 感染以來,廣西、海南、廣東等地都先后出現并分離到大腸桿菌O157:H7[5]。在世界范圍內,家畜及其肉制品是大腸桿菌O157:H7 主要的傳播途徑,其中雞、牛、豬等是該菌主要感染對象[6]。如何快速檢測食品尤其是肉類食品中污染的大腸桿菌O157:H7,是有效防控大腸桿菌O157:H7 食源性疾病爆發(fā)的必要條件。

    目前檢測大腸桿菌O157:H7 的方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、免疫學和分子生物學檢測[7-9]。這些方法在不同的檢測要求下都有各自的優(yōu)點,也都存在不足,比如耗費時間長,操作過程繁瑣及檢測靈敏度低等。環(huán)介導等溫擴增技術自2000年日本科學家Notomi 發(fā)明以來[10],因其可在等溫條件下數十分鐘內完成核酸的高倍擴增,從而成為繼PCR 技術之后又一新型快速、 簡便的分子生物學檢測技術。目前各國研究人員在此基礎上發(fā)展出多種病原菌的LAMP 檢測方法,比如副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)[11]、沙門氏菌[12]、人乳頭瘤病毒(HPV16)[13]、副溶血性弧菌[14]等。與PCR 等其它方法相比,LAMP 有獨特的優(yōu)點,如在等溫條件下即可完成擴增反應,反應時間短 (40~60 min),靈敏度較高,反應溫度較低(60~65 ℃),甚至可肉眼直接判斷反應結果[15]。

    許多研究表明,食品中存在多種水溶性DNA聚合酶抑制劑,會干擾PCR 等分子生物學方法檢測食品中致病菌?;钚蕴渴且环N具有較大表面積、復雜孔隙結構的物質,具有良好的吸附性能,可以用來消減干擾PCR 聚合酶活性的抑制劑[16]。由于活性炭同時能吸附細菌,所以需對其表面進行適當封閉,從而防止細菌被吸附。據文獻[17]報道,使用蒙脫石封閉的活性炭可以消減食品中抑制劑,不影響食品中細菌的回收。

    Midori Green 是一種新型的核酸熒光染料,具有靈敏性高,毒性低,安全性好的優(yōu)點,而利用該染料進行實時熒光定量LAMP 法 (Rti-LAMP)的報道不多[18]。本研究采用Midori Green 為核酸染料,建立大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 檢測技術;通過模擬雞肉污染大腸桿菌O157:H7,建立基于Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中的大腸桿菌O157:H7 并與國標檢測法進行對比。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大腸桿菌O157:H7 ATCC BAA-708 菌株,本實驗室保存;雞脯肉樣品,市場購買;月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)、EC 肉湯等,青島高科園海博科技有限公司產品;胰蛋白酶大豆肉湯(TSB),美國Difco 公司;Bst DNA polymerse,新西蘭Biolabs 公司;Midori Green,dNTPs,Bulldog Bio公司;2×Taq Master Mix,上海欣百諾生物科技有限公司;Whirl-Pak 均質過濾袋,美國Nasco 公司;八 連 管,BIO-RAD;Activated carbon (Filtrasorb 200),美國Calgon Carbon 公司。

    1.2 儀器與設備

    拍擊式均質機,AES chemuex 公司;紫外可見分光光度計(WFZ-UV-2100),尤尼科(上海)儀器有限公司;GL-21M 高速冷凍離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;XB-150B 全自動雪花制冰機,寧波新藝超聲設備有限公司;凝膠成像系統(tǒng),法國Vibler Lourmat 公司;電泳儀(EPS300)、電泳槽(VE-180),上海天能科技有限公司;熒光PCR 儀,CFX Connect Real-time System,BIORAD。

    1.3 方法

    1.3.1 引物設計與合成 針對大腸桿菌 O157:H7 (VT2)基因,參考Hara-Kudo 等[19]設計了6 條特異性引物用于Rti-LAMP,包括兩條內引物(FIP/BIP),兩條外引物(F3/B3),兩條環(huán)引物(Loop F/ Loop B),詳見表1。引物由北京鼎國生物技術有限公司合成。

    1.3.2 細菌培養(yǎng)、計數及細菌DNA 提取 將活化的大腸桿菌O157:H7 接種于3 mL TSB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃,150 r/min 過夜培養(yǎng)16~18 h,以3%菌液量轉接于10 mL TSB 液體培養(yǎng)基,37 ℃,150 r/min 培養(yǎng)1.5 h 左右至對數期細菌(OD600≈0.5)。將菌液用滅菌的生理鹽水按10 倍梯度依次稀釋,取100 μL 涂于平板,培養(yǎng)18~24 h 細菌計數,測定OD600的數值,建立OD600值與菌濃度的標準曲線。

    細菌總DNA 制備,生理鹽水稀釋的細菌500 μL 加入500 μL 2×TZ 裂解液[20],于99.5 ℃下加熱10 min,冰上冷卻后高速離心5 min,取上清即為細菌DNA 模板。

    表1 LAMP 引物Table 1 Primers used in the Rti-LAMP

    1.3.3 Rti-LAMP 反應 Rti-LAMP 反應體系總體積 為25 μL:2.5 μL 10×buffer,5 μL 25 mmol/L MgCl2,2.5 μL 12.5 mmol/L dNTPs,2 μL 20 mmol/L FIP,2 μL 20 mmol/L BIP,0.4 μL 20 mmol/L F3,0.4 μL 20 mmol/L B3,1.2 μL 20 mmol/L Loop F,1.2 μL 20 mmol/L Loop B,1 μL 1 ∶500 稀釋的熒光染料Midori Green,0.9 μL Bst 聚合酶,2 μL DNA 模板,無菌去離子水補足至25 μL。制備好的反應管放入BIO-RAD CFX Connect Real-time System 內65 ℃擴增反應60 min。每分鐘讀取熒光數值,設定樣品熒光值出現指數增加的時間為Tp值(類似于Rti-PCR 的Ct 值)[21-22],測定Tp 值與細菌濃度之間關系函數。

    1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳 Rti-LAMP 產物上樣于2%瓊脂糖凝膠,將1 μL 的Midori Green 原液加入到20 mL 瓊脂糖凝膠后進行電泳。電泳條件為:電壓80 V,電流60 mA,時間35 min,取出置于凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

    1.3.5 蒙脫石封閉活性炭(BCAC)的制備 16 g活性炭用蒸餾水沖洗至流水無色,放入烘箱烘干待用。取蒙脫石4 g 加蒸餾水200 mL,振蕩搖勻至完全溶解,轉移至250 mL 離心杯中室溫下700 r/min,1 min,將上清液倒入加了上述活性炭的三角瓶中,37 ℃下150 r/min,振蕩3 h。然后轉移到55℃烘箱中烘干備用。

    1.3.6 模擬大腸桿菌O157:H7 污染雞肉樣品 取25 g 經國標檢測大腸桿菌O157:H7 陰性的雞肉樣品,置于裝有75 mL PBS(50 mmol/L)緩沖液的Whirl-Pak 均質過濾袋中,加入生理鹽水稀釋至適宜濃度的大腸桿菌O157:H7 0.5 mL,以制備濃度為0,140,450,1 400,4 500,14 000,45 000 CFU/g的人工模擬污染樣品,將均質袋置于均質機中,37℃下拍打1 min,隨后放入37 ℃的水浴增菌4 h。樣品過濾液轉移至離心杯中,800 r/min 離心5 min,上清液通過含0.5 g 玻璃棉的滅菌注射器過濾,取過濾液用于樣品中細菌DNA 的提取。

    1.3.7 封閉活性炭對雞肉樣品前處理 模擬大腸桿菌O157:H7 污染雞肉樣品的步驟見1.3.6 節(jié),但不經過增菌培養(yǎng)。濾液轉移至離心杯中,10 000 r/min 離心5 min,除去上清,用30 mL PBS(50 mmol/L)緩沖液重懸,加入4 g 制備的BCAC,37℃150 r/min 振蕩15 min,用含0.2 g 玻璃棉的滅菌注射器過濾,取過濾液用于樣品中細菌DNA 的提取。

    1.3.8 樣品中細菌DNA 的提取 將過濾液于10 000 r/min 下離心5 min,棄上清,沉淀重懸于0.5 mL 生理鹽水,加入等體積2×TZ 裂解液,混勻后于99.5 ℃下加熱10 min,冰浴2 min 后12 000 r/min 離心10 min,上清即為樣品DNA 模板,取2 μL 作為Rti-LAMP 反應模板。

    1.3.9 臨床雞肉樣品的對比檢測 從市場上購買51 份冷凍雞肉樣品,利用增菌Rti-LAMP、封閉活性炭預處理未增菌的Rti-LAMP 和國標法(GB 4789.38-2012 食品安全國家標準食品微生物學檢驗),同時檢測這些雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7污染情況。

    2 結果與分析

    2.1 大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 檢測方法建立

    以大腸桿菌 O157:H7 裂解液為模板,結合Midori green 核酸熒光染料,通過設計的6 條特異性引物進行Rti-LAMP 反應,其結果顯示陽性樣品在30 min 之內出現熒光值呈指數增加,而陰性樣品則沒有熒光指數增加現象。為測定Rti-LAMP的靈敏度,設置了0,1.1,3.5,11,35,110,350 CFU/管,共7 個梯度,結果表明3.5 CFU/管可穩(wěn)定擴增檢出,低于該濃度則檢出穩(wěn)定性不夠,故該Rti-LAMP 的檢測靈敏度為3.5 CFU/管(圖1)。以熒光值500 作為衡量各反應熒光指數增加出現的時間(Tp 值),以Tp 值為縱坐標,lg(CFU/管)為橫坐標,則細菌CFU 與Tp 值之間的線性回歸方程為Y=-2.1632X+22.655,決定系數R2=0.9896,表明在3.5~350 CFU/管范圍內,其細菌濃度與其相應的Tp 值具有良好的線性關系,通過Rti-LAMP的Tp 值可實現定量檢測大腸桿菌O157:H7(圖1)。大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 擴增產物電泳圖如圖2所示,典型LAMP 擴增產物是一系列梯度的DNA 片段混合物,在電泳圖上呈現出規(guī)律的梯狀條帶,表明本研究建立的Rti-LAMP 法檢測大腸桿菌O157:H7 具有良好的特異性。

    圖1 典型Rti-LAMP 擴增大腸桿菌O157:H7 熒光曲線及Tp 值與lg(CFU/反應)的線性回歸方程Fig.1 Rti-LAMP plots and linear detection plot of E.coli O157:H7 derived from various numbers of log phase E.coli O157:H7 cells

    2.2 增菌前處理的Rti-LAMP 檢測人工模擬大腸桿菌O157:H7 污染的雞肉樣品

    為研究Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 的靈敏度和特異性,本研究人工模擬大腸桿菌O157:H7 污染雞肉樣品,經37 ℃增菌4 h后,提取樣品DNA 進行Rti-LAMP 檢測。結果表明,Rti-LAMP 能穩(wěn)定檢測140 CFU/g 的樣品,顯示該方法檢測靈敏度為140 CFU/g(圖3),整個檢測時間約為7 h。以Tp 值為縱坐標,lg(CFU/g)為橫坐標,建立的線性回歸方程為:Y=-3.9792X+31.218,決定系數R2=0.9504,表明本研究增菌前處理的Rti-LAMP 具有定量分析檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 的污染程度(圖3)。如圖4所示,擴增產物與純菌擴增產物的電泳條帶完全一致,說明該方法檢測雞肉中大腸桿菌O157:H7 特異性良好。

    圖2 Rti-LAMP 擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Product of amplicons derived from Rti-LAMP reactions by agarose gel electrophoresis

    圖3 Rti-LAMP 檢測模擬大腸桿菌O157:H7 污染的雞肉樣品的擴增曲線及Tp 值與lg(CFU/g)的線性函數Fig.3 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP and linear detection plot of E.coli O157:H7 derived from various numbers of seeded chicken

    圖4 模擬污染的雞肉樣品Rti-LAMP 擴增產物電泳圖Fig.4 Product of amplicons derived from Rti-LAMP reactions in samples filtrate of chicken by agarose gel electrophoresis

    2.3 封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測人工模擬E.coli O157:H7污染的雞肉樣品

    封閉活性炭的用量經本實驗室優(yōu)化[23]后,確定處理每份樣品的用量為4 g。使用封閉活性炭處理人工模擬污染大腸桿菌O157:H7 的雞肉樣品,不經過增菌步驟,提取樣品DNA 進行檢測。結果表明,使用封閉活性炭處理后的Rti-LAMP 能穩(wěn)定檢測出12 CFU/g 的雞肉樣品(圖5),表明經封閉活性炭預處理的Rti-LAMP 較增菌前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度提高約10 倍。3 次重復試驗,以Tp 平均值為縱坐標,lg(CFU/g)為橫坐標,線性回歸方程為:Y=-3.1888X+24.684,決定系數R2=0.9905,說明在12~4 000 CFU/g 范圍內具有良好的可定量分析特性。

    圖5 經活性炭處理后Rti-LAMP 的擴增曲線及Tp 值與lg(CFU/g)的線性函數Fig.5 The fluorescence curves of the amplified products by Rti-LAMP after activated carbon treated and linear detection plot of E.coli O157:H7 derived from various numbers of seeded chicken

    2.4 3 種方法對比檢測臨床雞肉樣品

    使用上述建立的兩種大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 方法和國標法進行對比檢測分析,對市場上購買的51 份冷凍雞肉樣品進行大腸桿菌O157:H7 檢測,檢測結果見表2。結果表明,增菌前處理的Rti-LAMP 和國標法,均檢測到1 份大腸桿菌O157:H7 陽性樣品,且為同一份雞肉樣品;而使用封閉活性炭預處理的Rti-LAMP 法,還檢測到另外7 份陽性樣品(共8 份)。因此,本研究建立的雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 增菌前處理的Rti-LAMP 檢測方法與國標法靈敏度相當,而使用封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測方法則具有更高的檢測靈敏度,且檢測時間極大地縮短至4.5 h 左右。

    表2 3 種檢測方法對臨床雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 的檢測結果Table 2 Three methods detected clinical chicken samples for E.coli O157:H7

    為驗證臨床雞肉樣品大腸桿菌O157:H7 Rti-LAMP 檢測的特異性,將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳(圖6),結果DNA 擴增條帶與大腸桿菌O157:H7 純菌擴增條帶一致,表明本研究建立的Rti-LAMP 檢測雞肉樣品中大腸桿菌O157:H7 具有良好的特異性。

    圖6 臨床雞肉樣品Rti-LAMP 擴增產物電泳圖Fig.6 Detection of amplicons derived from Rti-LAMP reactions in clinical samples of chicken by agarose gel electrophoresis

    3 討論

    本研究根據大腸桿菌O157:H7 的VT2 基因設計了6 條特異性引物,結合Midori Green 新型核酸染料,建立了大腸桿菌O157:H7 的Rti-LAMP 檢測方法,其中純培養(yǎng)菌液靈敏度達到3.5 CFU/反應,模擬大腸桿菌O157:H7 污染的雞肉樣品中增菌前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度為140 CFU/g,整個檢測流程可在7 h 內完成;而經封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢測靈敏度為12 CFU/g,需時約4.5 h 左右。

    檢測的51 份臨床雞肉樣品,增菌前處理的Rti-LAMP 方法和國標法檢出率均為1.96%。據Zhang 等[5]對中國南方多個省市183 份雞肉污染情況調查,結果大腸桿菌O157:H7 的陽性檢出率為3.28%。這與本試驗的檢測結果大致相似,表明Rti-LAMP 與國標法具有相同的檢測靈敏度,但Rti-LAMP 所需時間約7 h,可在一個工作日內完成,較國標法節(jié)省了時間和人力。

    研究表明,由于食品成分的復雜性,其中存在著多種水溶性DNA 聚合酶抑制劑,對檢測的靈敏度和穩(wěn)定性產生很大的影響[16]。例如本研究中未經封閉活性炭處理的Rti-LAMP 對模擬污染的雞肉樣品進行檢測,其線性函數的R2系數較低(0.9504),顯示食品組分中的抑制劑對擴增反應有一定的影響。本研究嘗試使用蒙脫石封閉的活性炭進行前處理以消減抑制劑,結果表明經封閉的活性炭前處理人工模擬大腸桿菌O157:H7 污染的雞肉樣品,相比增菌但未使用封閉活性炭處理的Rti-LAMP 方法靈敏度提高了約10 倍。封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 檢出臨床雞肉樣品8份大腸桿菌O157:H7 陽性,進一步說明該方法檢測靈敏度確實有很大的提高,同時不需要增菌,極大地縮短檢測至4.5 h。封閉活性炭前處理的Rti-LAMP 法檢出雞肉樣品大腸桿菌O157:H7 高陽性率,推測可能的原因主要有兩點:一是雞肉中污染的大腸桿菌O157:H7 濃度并不低,但由于食品在加工儲藏過程中會對細菌造成抑制和損傷,導致細菌活力降低甚至死亡,增菌培養(yǎng)時,損傷細菌不易生長繁殖,從而影響了國標法的檢出率;但由于Rti-LAMP 法是對目標菌DNA 的擴增檢測,損傷細菌其DNA 可以作為擴增模板;二是封閉活性炭消減雞肉中可溶性抑制劑效果好,解除了抑制劑對DNA 聚合酶的抑制作用,從而極大地提高了Rti-LAMP 檢測靈敏度。國家食品安全標準(GB 29921-2013)中規(guī)定,同一批次的5 份樣品中大腸桿菌O157:H7 的檢出率為0,說明對大腸桿菌O157:H7 有著嚴格的限定標準,所以嚴格控制大腸桿菌O157:H7 的檢出對于保障食品安全具有重要意義。當然,本研究建立的Rti-LAMP 方法無法區(qū)別目標菌是死菌還是活菌,如何利用分子生物學方法進行鑒別,實現臨床樣品致病菌更精準的檢測,仍需進一步研究。

    猜你喜歡
    增菌雞肉活性炭
    不同檢測方法對妊娠晚期B族鏈球菌的篩查比較
    玩轉活性炭
    童話世界(2020年32期)2020-12-25 02:59:18
    3種改良B族鏈球菌檢測方法的檢測效果比較▲
    神奇的活性炭
    廚房料理小妙招
    下半年雞肉市場看好
    天熱了,吃點雞肉吧
    不吃雞肉
    大腸桿菌O157:H7快速增菌培養(yǎng)基檢測效果的研究
    沙門菌和志賀菌通用增菌液增菌效果實驗觀察
    亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久精品国产亚洲网站| 三级毛片av免费| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 大香蕉久久网| 插逼视频在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 国产高潮美女av| 欧美+日韩+精品| 国产欧美日韩精品一区二区| 看黄色毛片网站| 伦精品一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| av.在线天堂| ponron亚洲| 日本色播在线视频| 成人毛片60女人毛片免费| 日日啪夜夜撸| 日韩欧美 国产精品| 精品国产三级普通话版| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品久久久久久久久av| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲无线观看免费| 国产成人a区在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美成人a在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 嫩草影院新地址| 干丝袜人妻中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| av国产免费在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜激情欧美在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久国产乱子免费精品| 国产成人a∨麻豆精品| 晚上一个人看的免费电影| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产视频首页在线观看| 少妇熟女欧美另类| 国产又色又爽无遮挡免| 日本色播在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产v大片淫在线免费观看| 国产免费男女视频| 免费观看a级毛片全部| 一级毛片久久久久久久久女| 极品教师在线视频| 女人久久www免费人成看片 | 联通29元200g的流量卡| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 日韩欧美精品v在线| 深爱激情五月婷婷| 久热久热在线精品观看| 国产精品1区2区在线观看.| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 91精品伊人久久大香线蕉| 精品久久久久久成人av| 高清午夜精品一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| 午夜福利视频1000在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 日韩强制内射视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 青青草视频在线视频观看| 国产一级毛片在线| 色网站视频免费| 日日撸夜夜添| 亚洲国产精品成人久久小说| av在线亚洲专区| 欧美日韩在线观看h| av在线播放精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产毛片a区久久久久| 久久精品国产自在天天线| 丝袜美腿在线中文| 国产成人精品一,二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲自偷自拍三级| 三级国产精品片| videos熟女内射| 国产一区有黄有色的免费视频 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 99久久精品一区二区三区| 午夜视频国产福利| 国产黄片美女视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲综合精品二区| 国产精品国产三级国产专区5o | 国产精品一及| 97在线视频观看| 丰满少妇做爰视频| 青春草国产在线视频| 久久人妻av系列| 亚洲最大成人中文| 国产爱豆传媒在线观看| 日本一二三区视频观看| 九九热线精品视视频播放| 一级毛片久久久久久久久女| 美女内射精品一级片tv| 性色avwww在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品综合久久久久久久免费| 高清日韩中文字幕在线| 观看美女的网站| 熟女人妻精品中文字幕| 午夜精品国产一区二区电影 | 欧美又色又爽又黄视频| 床上黄色一级片| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产伦理片在线播放av一区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 少妇丰满av| 日韩强制内射视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 午夜爱爱视频在线播放| 国产精品国产三级国产专区5o | 精品久久久久久久久av| 男插女下体视频免费在线播放| 免费在线观看成人毛片| 成人亚洲精品av一区二区| 赤兔流量卡办理| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产精品国产三级专区第一集| 在线免费观看的www视频| 69av精品久久久久久| 午夜激情福利司机影院| 国产成人精品一,二区| 岛国毛片在线播放| 午夜福利在线在线| 国产精品一及| 一区二区三区四区激情视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲在线自拍视频| 全区人妻精品视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 我要看日韩黄色一级片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 哪个播放器可以免费观看大片| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲在线观看片| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜爱| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲最大成人中文| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 国产av码专区亚洲av| 成年女人永久免费观看视频| 国产久久久一区二区三区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一个人免费在线观看电影| 直男gayav资源| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 亚洲综合精品二区| 中文资源天堂在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产一级毛片在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产成人精品一,二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 能在线免费看毛片的网站| 国产午夜精品一二区理论片| 97超视频在线观看视频| 久久草成人影院| 熟女电影av网| av在线播放精品| 黄色欧美视频在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产久久久一区二区三区| 久久热精品热| 亚洲综合精品二区| 久久久久国产网址| АⅤ资源中文在线天堂| 色尼玛亚洲综合影院| 国产爱豆传媒在线观看| 一本久久精品| 内射极品少妇av片p| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 青春草国产在线视频| 欧美区成人在线视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品久久久久久成人av| 日本与韩国留学比较| 午夜老司机福利剧场| 中文字幕av在线有码专区| 久久久午夜欧美精品| 九九热线精品视视频播放| 欧美最新免费一区二区三区| 成年版毛片免费区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产成人福利小说| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产av码专区亚洲av| 免费电影在线观看免费观看| 午夜福利在线观看吧| 直男gayav资源| .国产精品久久| 精品国产三级普通话版| 性插视频无遮挡在线免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 免费看av在线观看网站| 免费观看在线日韩| 美女内射精品一级片tv| 不卡视频在线观看欧美| 青春草亚洲视频在线观看| 老女人水多毛片| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久国产成人免费| 看十八女毛片水多多多| 免费大片18禁| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品,欧美在线| 国产69精品久久久久777片| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品久久视频播放| 日本熟妇午夜| 一级毛片久久久久久久久女| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久热久热在线精品观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 性色avwww在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久久久久国产a免费观看| av黄色大香蕉| 国产真实伦视频高清在线观看| 在线免费十八禁| h日本视频在线播放| 变态另类丝袜制服| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲欧美精品专区久久| 日韩一区二区三区影片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 春色校园在线视频观看| 波野结衣二区三区在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 麻豆成人av视频| 国产精品,欧美在线| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲av免费在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 岛国在线免费视频观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产一区二区三区av在线| videossex国产| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩大片免费观看网站 | 久久精品久久精品一区二区三区| 三级毛片av免费| 色5月婷婷丁香| 日产精品乱码卡一卡2卡三| or卡值多少钱| 亚洲精品456在线播放app| 不卡视频在线观看欧美| 精品国产三级普通话版| 国产免费视频播放在线视频 | 亚洲av免费高清在线观看| 欧美潮喷喷水| 日日啪夜夜撸| 午夜精品在线福利| 天堂中文最新版在线下载 | 国产私拍福利视频在线观看| 高清毛片免费看| 美女大奶头视频| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 青春草国产在线视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 小说图片视频综合网站| 久久6这里有精品| 亚洲性久久影院| 成人特级av手机在线观看| 一级爰片在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成人免费观看mmmm| 久久久久久久久久久丰满| av国产免费在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产乱来视频区| 日韩人妻高清精品专区| 午夜爱爱视频在线播放| 精品人妻偷拍中文字幕| 水蜜桃什么品种好| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产片特级美女逼逼视频| 国产老妇女一区| 91精品伊人久久大香线蕉| 免费看光身美女| 舔av片在线| 秋霞伦理黄片| 精品久久久久久久久av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久人妻av系列| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲人成网站在线播| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费看日本二区| av在线观看视频网站免费| 热99re8久久精品国产| av在线蜜桃| 99久国产av精品国产电影| 在线天堂最新版资源| 午夜福利在线观看吧| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 天美传媒精品一区二区| 日韩国内少妇激情av| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产在线男女| 男女国产视频网站| 看黄色毛片网站| 一级毛片电影观看 | 在线免费观看的www视频| 级片在线观看| 插逼视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品.久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲美女视频黄频| 2021少妇久久久久久久久久久| 日本午夜av视频| 国产精品日韩av在线免费观看| a级毛色黄片| 亚洲经典国产精华液单| 国产男人的电影天堂91| 韩国av在线不卡| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 麻豆成人午夜福利视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 色吧在线观看| 超碰97精品在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 青春草亚洲视频在线观看| 天堂影院成人在线观看| 只有这里有精品99| 精品久久久久久久末码| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 26uuu在线亚洲综合色| 一本一本综合久久| 日本熟妇午夜| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产色婷婷99| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | av女优亚洲男人天堂| 亚洲在久久综合| 国产成年人精品一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 中文字幕熟女人妻在线| 99久久成人亚洲精品观看| 国产极品天堂在线| 久久午夜福利片| 赤兔流量卡办理| 久久久久久久久大av| a级毛色黄片| 永久网站在线| 91精品伊人久久大香线蕉| 免费无遮挡裸体视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲精品影视一区二区三区av| 大香蕉久久网| 一区二区三区免费毛片| 最近中文字幕2019免费版| 午夜福利视频1000在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 精品一区二区三区视频在线| 午夜福利在线在线| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久久久伊人网av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久久久久久成人| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲经典国产精华液单| 2021少妇久久久久久久久久久| 两个人的视频大全免费| 在线免费观看不下载黄p国产| 人人妻人人澡欧美一区二区| 午夜福利成人在线免费观看| 久久精品国产自在天天线| 一级黄片播放器| 国内精品一区二区在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 日本与韩国留学比较| 99久久精品国产国产毛片| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 久久99热6这里只有精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 久久韩国三级中文字幕| 国产免费又黄又爽又色| 热99在线观看视频| 欧美3d第一页| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 看非洲黑人一级黄片| 国产v大片淫在线免费观看| 草草在线视频免费看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 变态另类丝袜制服| 亚洲,欧美,日韩| 成人午夜高清在线视频| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成人三级黄色视频| 国产乱人偷精品视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产亚洲精品av在线| 毛片女人毛片| 两个人的视频大全免费| 日本黄色片子视频| 精品国产三级普通话版| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美人与善性xxx| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美区成人在线视频| 久久久久网色| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产69精品久久久久777片| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 乱人视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 午夜免费激情av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 婷婷色av中文字幕| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 日韩大片免费观看网站 | 亚洲18禁久久av| 国产在线男女| 亚洲av熟女| 精品国产露脸久久av麻豆 | 国产单亲对白刺激| 我的女老师完整版在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美zozozo另类| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 精品人妻熟女av久视频| 婷婷色麻豆天堂久久 | 亚洲精品,欧美精品| 亚洲自拍偷在线| 最近2019中文字幕mv第一页| 大话2 男鬼变身卡| 老司机影院成人| 日本免费在线观看一区| 久久久色成人| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩国内少妇激情av| 岛国在线免费视频观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 一级二级三级毛片免费看| 看黄色毛片网站| 成人特级av手机在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 91久久精品国产一区二区三区| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| av在线老鸭窝| 国产私拍福利视频在线观看| 国产在线一区二区三区精 | 久久久精品欧美日韩精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费av毛片视频| 久久精品国产亚洲av天美| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲av电影不卡..在线观看| 黄片wwwwww| 99久国产av精品| 日韩欧美精品v在线| 99热全是精品| 国产不卡一卡二| 国产日韩欧美在线精品| 久久精品综合一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区 | 日本三级黄在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲性久久影院| 国产精品久久视频播放| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国国产精品蜜臀av免费| 色综合色国产| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲精品自拍成人| 亚洲自拍偷在线| 美女cb高潮喷水在线观看| 97超碰精品成人国产| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品三级大全| a级一级毛片免费在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲精华国产精华液的使用体验| a级毛片免费高清观看在线播放| kizo精华| 天美传媒精品一区二区| 精品酒店卫生间| 精品久久久久久久末码| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 热99re8久久精品国产| 亚洲欧美精品专区久久| 中文字幕制服av| 国产不卡一卡二| 亚洲美女搞黄在线观看| 黑人高潮一二区| 亚洲性久久影院| 亚洲欧美清纯卡通| 日本与韩国留学比较| 日本一本二区三区精品| 18禁在线播放成人免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 麻豆国产97在线/欧美| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产成人aa在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 中国美白少妇内射xxxbb| 禁无遮挡网站| eeuss影院久久| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久久久久国产a免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 91在线精品国自产拍蜜月| 一个人看视频在线观看www免费| 国产成人精品久久久久久| 日韩欧美精品免费久久| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久久久九九精品二区国产| 美女高潮的动态| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美3d第一页| 久久国产乱子免费精品| 成人亚洲精品av一区二区| 精华霜和精华液先用哪个| 久久精品国产亚洲av天美| 日本午夜av视频| 国产91av在线免费观看| 99热网站在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成年女人永久免费观看视频| 国产毛片a区久久久久| 精品一区二区三区视频在线| 身体一侧抽搐| 欧美丝袜亚洲另类| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产大屁股一区二区在线视频| 高清av免费在线| 免费看光身美女| 久久国内精品自在自线图片| 日韩欧美 国产精品| 久久精品久久久久久久性| 久久亚洲精品不卡| 日本一本二区三区精品| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 毛片一级片免费看久久久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久精品影院6| 18+在线观看网站| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品伦人一区二区| 黑人高潮一二区| 伦精品一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 我的老师免费观看完整版| 精品人妻熟女av久视频| 男女下面进入的视频免费午夜|