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    東北膜莢黃芪內(nèi)生細菌的分離及其活性代謝物分析

    2019-05-18 06:56:38翟李欣徐慧超鄭春英
    中國食品學(xué)報 2019年3期
    關(guān)鍵詞:芒柄生藥花素

    翟李欣 徐慧超 李 偉 鄭 雪 鄭春英*

    (1 黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心 哈爾濱150500 2 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室 哈爾濱150080)

    植物內(nèi)生菌是具有豐富多樣性特征的微生物類群,幾乎存在于每種植物的不同組織器官內(nèi)。據(jù)統(tǒng)計,自然界中至少存在著一百萬種內(nèi)生菌[1]。內(nèi)生菌的多樣性表現(xiàn)以下幾個方面:同種植物的不同部位,在其組織內(nèi)所生長的內(nèi)生菌的種類及數(shù)目不同[2];同種植物在不同生理、病理狀態(tài)下,其內(nèi)生菌種類及數(shù)目也會相應(yīng)發(fā)生改變[3];產(chǎn)地、氣候等環(huán)境因素直接影響內(nèi)生菌種類及數(shù)目[4-5]。植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性是受其宿主植物中內(nèi)生細菌的多樣性所決定[6]。據(jù)報道[7-8],從植物內(nèi)生菌中分離得到的次生代謝產(chǎn)物有49%是已知結(jié)構(gòu)化合物,51%是新結(jié)構(gòu)類型的化合物。植物內(nèi)生菌是一種新型生物活性物質(zhì)資源,研究植物內(nèi)生細菌具有重要的理論意義和較高的商業(yè)應(yīng)用價值。

    黃芪(Astragalus membranaceus)為豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜莢黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.)的干燥根[9],主要分布于東北與西北等地,分布于東北的膜莢黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.)品系簡稱“北芪”[10],具有抑菌[11]、抗炎[12]、抗病毒[13]、抗腫瘤[14]、抗氧化[15]、降血糖[16]等多種活性作用。

    寒地黑土造就了東北膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)特有品質(zhì),現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于功能性保健食品、 食品添加劑、 藥品等領(lǐng)域。本文以主產(chǎn)于東北地區(qū)的膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)(北芪)為研究對象,對其內(nèi)生細菌進行分離及活性代謝物初步研究,并與生藥活性成分作對比分析,篩選出能夠產(chǎn)與宿主植物北芪相同、相似或全新的具有抑菌、抗氧化等實用價值的目的菌株,為開發(fā)新資源、創(chuàng)制新藥、 開辟新型北芪活性成分的生產(chǎn)方法奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 植物樣品

    野生豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.健康植株分別于2015年8,9月采自黑龍江省大興安嶺地區(qū)。

    1.2 培養(yǎng)基

    NA 分離培養(yǎng)基及PDA 培養(yǎng)基:同文獻[17]。

    1.3 試驗菌株

    糞腸球菌 (Enterococcus facalis)、 屎腸球菌(Enterococcus faecium)、金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、 銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、單增李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷 伯菌(Klebsiella penumoniae)、白假絲酵母(Candida albicans),均購于黑龍江省應(yīng)用微生物研究所。

    1.4 儀器與試劑

    高效液相色譜儀(FL2200 HPLC,浙江溫嶺);電子天平(METTLER TOLEDO,美國)。

    16SrDNA 序列擴增引物(上海生工生物工程股份有限公司合成),甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。

    2 方法

    2.1 北芪內(nèi)生細菌的分離

    將北芪根、莖樣品沖洗,剝?nèi)№g皮部,按下述程序進行表面消毒:75% 乙醇浸1min→5% NaCl 浸5min→75%乙醇浸360 s→無菌水沖洗3 次→10%H2O2浸15 min→浸于75%酒精1 min→無菌水沖3 次。將根、 莖韌皮部切成1 cm 的小塊(無菌操作),置于NA 液體分離培養(yǎng)基中,放入水浴搖床;同時,也將其置于NA 固體分離培養(yǎng)基中的樣品放入培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件均為:37 ℃;培養(yǎng)3~5 d。觀察,待根、莖小塊四周長出菌體后,將菌體轉(zhuǎn)入平板,多次劃線分離純化;另取表面消毒程序最后沖洗樣品的無菌水液倒入NA 液體培養(yǎng)基,或涂布平板培養(yǎng)作對照,以排除所分離得到的內(nèi)生細菌為殘留在樣品表面的菌株。

    2.2 抑菌試驗

    2.2.1 北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備 取分離得到的北芪內(nèi)生細菌,活化后分別接種于含有50 mL NB 培養(yǎng)基的三角瓶中(n=3),于37 ℃,120 r/min 搖床培養(yǎng)3d,取出,作為北芪內(nèi)生細菌供試品液(1×107CFU/mL)。以20%的裝液量將上述北芪內(nèi)生細菌供試品液接種于新配制NB 培養(yǎng)基中,同等條件下發(fā)酵培養(yǎng)5 d,取出,抽濾,濾液醇沉(3倍量95%乙醇,V/V),取上清液,回收溶劑后作為北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物備用。

    2.2.2 抑菌試驗 取2.1 節(jié)的北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物以等量的水飽和正丁醇超聲1h,于50℃條件下,將正丁醇提取液減壓濃縮后,用1 mL 甲醇溶解,作為供試品溶液,參閱文獻[18],按濾紙片法操作進行抑菌活性測定。

    2.3 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析

    2.3.1 HPLC 分析條件 色譜柱:Venusil XBPC18柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm,USA);流動相:甲醇-水-冰醋酸(50 ∶49.7 ∶0.3)流速:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:254nm;進樣量:10μL。

    2.3.2 對照品溶液的制備 稱取芒柄花素對照品適量,用甲醇稀釋溶解,制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 對照品溶液,備用。

    2.3.3 供試品溶液制備 取2.1 節(jié)北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物(n=6),分別以等量的乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取,各萃取液減壓(50 ℃水浴條件下)濃縮近干,加入1 mL 甲醇溶解,于4 ℃保存,備用;同時,另取NB 培養(yǎng)基同法操作后作為空白對照品溶液;另取北芪生藥3 g,精密加入甲醇50 mL,超聲提取1 h,取出,放冷,濾過,濾液濃縮至5 mL 后作為對照藥材液,備用。

    2.3.4 樣品測定 依照3.1 節(jié)的色譜條件,分別精密吸取對照品液、對照藥材液、供試品液、空白對照液各10 μL(n=3)進樣,檢測。

    2.4 菌種鑒定

    2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定 參照文獻[19]。

    2.4.2 16 S rDNA 序列擴增和序列分析 北芪內(nèi)生菌按照常規(guī)方法[20]進行PCR 擴增。采用16S rDNA 通用引物為:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 產(chǎn)物純化后測序(委托上海生工生物工程股份有限公司)。序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫,在GenBank 網(wǎng)站上用Blast 軟件進行相似性搜索,得到相近典型菌株的16S rDNA 基因序列后,用軟件MEGA6.0 進行多重序列比對,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分析結(jié)果并確定菌株的分類地位。

    3 結(jié)果

    3.1 北芪內(nèi)生細菌的分離

    從健康北芪根部組織、 莖部組織中共分離出36 株內(nèi)生細菌,其中,從莖中分離得到16 株,從根中分離得到20 株。

    3.2 內(nèi)生細菌的抑菌活性

    在所分離得到的36 株北芪內(nèi)生細菌中,有31 株內(nèi)生細菌發(fā)酵液對11 株供試致病菌具有不同程度的抑菌作用,占分離菌株的86.11%,北芪內(nèi)生細菌抑菌活性篩選結(jié)果見表1。

    表1 北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液抑菌試驗結(jié)果Table 1 Antimicrobial activities of endophytic bacteria isolated from Astragalus membranaceus to the tested bacteria and fungi in screening

    3.3 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果

    3.3.1 色譜條件下活性成分的分離 在3.1 節(jié)的色譜條件下,對照藥材液中各物質(zhì)得到了較好的分離,其中北芪根對照藥材液在與對照品芒柄花素相同保留時間處出現(xiàn)一相同色譜峰,該色譜峰采用對照品加入法確認為芒柄花素,結(jié)果見圖1。

    圖1 北芪生藥與對照品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC of Astragalus membranaceus and reference substance

    3.3.2 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果 采用HPLC 法分析36 株北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液不同極性部位,發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌HX8 及HX14 發(fā)酵液中含有大量活性物質(zhì),并且內(nèi)生細菌HX8、HX14 在與對照品及對照藥材對比分析后發(fā)現(xiàn),該菌株可能含有北芪活性成分芒柄花素,結(jié)果見圖2及圖3。

    由圖2可以看出,在保留時間10~12min 時,內(nèi)生細菌HX8 發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯、氯仿萃取所得的供試品液出現(xiàn)與北芪根、 莖生藥樣品相同的色譜峰;在保留時間18 min 左右時,內(nèi)生細菌HX8發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取所得供試品液中出現(xiàn)與北芪莖生藥樣品相同的色譜峰;由圖2和圖3可以看出,在保留時間44min 時,內(nèi)生細菌HX8、HX14發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取所得供試品液中出現(xiàn)與北芪根生藥樣品的活性成分——芒柄花素,上述試驗結(jié)果說明,內(nèi)生細菌HX8、HX14 發(fā)酵液中含有與北芪生藥相同或相似的活性成分,該檢測結(jié)果對深入研究北芪內(nèi)生細菌HX8、HX14 活性成分提供參考。

    圖2 北芪內(nèi)生細菌HX8 發(fā)酵液的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of fermentation broth of HX8

    3.4 菌種鑒定

    據(jù)抑菌試驗結(jié)果及HPLC 法對36 株北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果,對具有潛在應(yīng)用價值的北芪內(nèi)生細菌HX8 進行了菌種鑒定。

    3.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果 北芪內(nèi)生細菌HX8 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果見表2。

    3.4.2 16S rDNA 鑒定結(jié)果 北芪內(nèi)生細菌HX8 PCR 擴增后獲得1 條1 000 bp 左右的特異性條帶,將測序結(jié)果利用BLAST 分析并與GenBank中的核苷酸序列進行比對,然后用MEGA6.0 軟件構(gòu)建北芪內(nèi)生細菌HX8 的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4),分析其種屬關(guān)系。分析結(jié)果表明,HX8 序列(登錄號:KY010575)與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus strain MPF 15 的16S rDNA 序列的同源性最高,相似性為99%。結(jié)合菌體形態(tài)特征、生理生化鑒定結(jié)果確定菌株HX8 為枯草芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)。

    4 討論

    圖3 北芪內(nèi)生細菌HX14 發(fā)酵液的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of fermentation broth of HX14

    表2 北芪內(nèi)生細菌HX8 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characteristics for strain HX8

    圖4 HX8 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain HX8

    以東北寒地藥用植物膜莢黃芪(北芪)為研究對象,對其根、莖中的內(nèi)生細菌進行了分離,并以抑菌活性為指標,對所分離得到的北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物進行抑菌活性篩選,以便能夠得到產(chǎn)生較好抑菌活性物質(zhì)的目的菌株,為開發(fā)新型防腐劑及新型抗菌藥物提供參考;同時,以芒柄花素及北芪生藥為對照,采用HPLC 法對北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物進行對比分析;結(jié)果表明,在36 株北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物中,存在著大量具有較好抑菌作用的活性物質(zhì),其中北芪內(nèi)生細菌HX8,HX14 代謝物表現(xiàn)出了較好的抑菌活性,同時經(jīng)HPLC 比對分析發(fā)現(xiàn),此2 株內(nèi)生細菌發(fā)酵液中活性物質(zhì)可能含有與北芪生藥活性成分相同或相似,是北芪活性成分產(chǎn)生菌,因此對此2株內(nèi)生細菌中具有潛在應(yīng)用價值的HX8 進行了菌種鑒定,為該菌株的深入研究奠定基礎(chǔ)。

    以芒柄花素為代表的黃酮類成分為黃芪主要活性成分之一[21],其中芒柄花素具有降壓、抗癌及抗菌作用,是常用的藥物原料[22],本文以芒柄花素及北芪生藥為陽性雙對照,對北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液進行篩選,結(jié)果表明2 株北芪內(nèi)生細菌HX8,HX14 發(fā)酵液中疑似含有芒柄花素,該結(jié)果對后續(xù)課題組采用柱色譜法分離此2 株目的細菌活性成分奠定基礎(chǔ);同時,也為采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)芒柄花素成分提供理論依據(jù)。此外,對北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物進行系統(tǒng)篩選研究,發(fā)掘出北芪活性成分產(chǎn)生菌,并對其進行綜合利用,這對開發(fā)新資源、 采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)北芪活性成分及保護北芪藥用植物可持續(xù)利用具有重要意義。

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