• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    東北膜莢黃芪內(nèi)生細菌的分離及其活性代謝物分析

    2019-05-18 06:56:38翟李欣徐慧超鄭春英
    中國食品學(xué)報 2019年3期
    關(guān)鍵詞:芒柄生藥花素

    翟李欣 徐慧超 李 偉 鄭 雪 鄭春英*

    (1 黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心 哈爾濱150500 2 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室 哈爾濱150080)

    植物內(nèi)生菌是具有豐富多樣性特征的微生物類群,幾乎存在于每種植物的不同組織器官內(nèi)。據(jù)統(tǒng)計,自然界中至少存在著一百萬種內(nèi)生菌[1]。內(nèi)生菌的多樣性表現(xiàn)以下幾個方面:同種植物的不同部位,在其組織內(nèi)所生長的內(nèi)生菌的種類及數(shù)目不同[2];同種植物在不同生理、病理狀態(tài)下,其內(nèi)生菌種類及數(shù)目也會相應(yīng)發(fā)生改變[3];產(chǎn)地、氣候等環(huán)境因素直接影響內(nèi)生菌種類及數(shù)目[4-5]。植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性是受其宿主植物中內(nèi)生細菌的多樣性所決定[6]。據(jù)報道[7-8],從植物內(nèi)生菌中分離得到的次生代謝產(chǎn)物有49%是已知結(jié)構(gòu)化合物,51%是新結(jié)構(gòu)類型的化合物。植物內(nèi)生菌是一種新型生物活性物質(zhì)資源,研究植物內(nèi)生細菌具有重要的理論意義和較高的商業(yè)應(yīng)用價值。

    黃芪(Astragalus membranaceus)為豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜莢黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.)的干燥根[9],主要分布于東北與西北等地,分布于東北的膜莢黃芪(Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.)品系簡稱“北芪”[10],具有抑菌[11]、抗炎[12]、抗病毒[13]、抗腫瘤[14]、抗氧化[15]、降血糖[16]等多種活性作用。

    寒地黑土造就了東北膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)特有品質(zhì),現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于功能性保健食品、 食品添加劑、 藥品等領(lǐng)域。本文以主產(chǎn)于東北地區(qū)的膜莢黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)(北芪)為研究對象,對其內(nèi)生細菌進行分離及活性代謝物初步研究,并與生藥活性成分作對比分析,篩選出能夠產(chǎn)與宿主植物北芪相同、相似或全新的具有抑菌、抗氧化等實用價值的目的菌株,為開發(fā)新資源、創(chuàng)制新藥、 開辟新型北芪活性成分的生產(chǎn)方法奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 植物樣品

    野生豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.健康植株分別于2015年8,9月采自黑龍江省大興安嶺地區(qū)。

    1.2 培養(yǎng)基

    NA 分離培養(yǎng)基及PDA 培養(yǎng)基:同文獻[17]。

    1.3 試驗菌株

    糞腸球菌 (Enterococcus facalis)、 屎腸球菌(Enterococcus faecium)、金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、 銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、單增李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷 伯菌(Klebsiella penumoniae)、白假絲酵母(Candida albicans),均購于黑龍江省應(yīng)用微生物研究所。

    1.4 儀器與試劑

    高效液相色譜儀(FL2200 HPLC,浙江溫嶺);電子天平(METTLER TOLEDO,美國)。

    16SrDNA 序列擴增引物(上海生工生物工程股份有限公司合成),甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。

    2 方法

    2.1 北芪內(nèi)生細菌的分離

    將北芪根、莖樣品沖洗,剝?nèi)№g皮部,按下述程序進行表面消毒:75% 乙醇浸1min→5% NaCl 浸5min→75%乙醇浸360 s→無菌水沖洗3 次→10%H2O2浸15 min→浸于75%酒精1 min→無菌水沖3 次。將根、 莖韌皮部切成1 cm 的小塊(無菌操作),置于NA 液體分離培養(yǎng)基中,放入水浴搖床;同時,也將其置于NA 固體分離培養(yǎng)基中的樣品放入培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件均為:37 ℃;培養(yǎng)3~5 d。觀察,待根、莖小塊四周長出菌體后,將菌體轉(zhuǎn)入平板,多次劃線分離純化;另取表面消毒程序最后沖洗樣品的無菌水液倒入NA 液體培養(yǎng)基,或涂布平板培養(yǎng)作對照,以排除所分離得到的內(nèi)生細菌為殘留在樣品表面的菌株。

    2.2 抑菌試驗

    2.2.1 北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備 取分離得到的北芪內(nèi)生細菌,活化后分別接種于含有50 mL NB 培養(yǎng)基的三角瓶中(n=3),于37 ℃,120 r/min 搖床培養(yǎng)3d,取出,作為北芪內(nèi)生細菌供試品液(1×107CFU/mL)。以20%的裝液量將上述北芪內(nèi)生細菌供試品液接種于新配制NB 培養(yǎng)基中,同等條件下發(fā)酵培養(yǎng)5 d,取出,抽濾,濾液醇沉(3倍量95%乙醇,V/V),取上清液,回收溶劑后作為北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物備用。

    2.2.2 抑菌試驗 取2.1 節(jié)的北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物以等量的水飽和正丁醇超聲1h,于50℃條件下,將正丁醇提取液減壓濃縮后,用1 mL 甲醇溶解,作為供試品溶液,參閱文獻[18],按濾紙片法操作進行抑菌活性測定。

    2.3 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析

    2.3.1 HPLC 分析條件 色譜柱:Venusil XBPC18柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm,USA);流動相:甲醇-水-冰醋酸(50 ∶49.7 ∶0.3)流速:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:254nm;進樣量:10μL。

    2.3.2 對照品溶液的制備 稱取芒柄花素對照品適量,用甲醇稀釋溶解,制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 對照品溶液,備用。

    2.3.3 供試品溶液制備 取2.1 節(jié)北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物(n=6),分別以等量的乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取,各萃取液減壓(50 ℃水浴條件下)濃縮近干,加入1 mL 甲醇溶解,于4 ℃保存,備用;同時,另取NB 培養(yǎng)基同法操作后作為空白對照品溶液;另取北芪生藥3 g,精密加入甲醇50 mL,超聲提取1 h,取出,放冷,濾過,濾液濃縮至5 mL 后作為對照藥材液,備用。

    2.3.4 樣品測定 依照3.1 節(jié)的色譜條件,分別精密吸取對照品液、對照藥材液、供試品液、空白對照液各10 μL(n=3)進樣,檢測。

    2.4 菌種鑒定

    2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定 參照文獻[19]。

    2.4.2 16 S rDNA 序列擴增和序列分析 北芪內(nèi)生菌按照常規(guī)方法[20]進行PCR 擴增。采用16S rDNA 通用引物為:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 產(chǎn)物純化后測序(委托上海生工生物工程股份有限公司)。序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫,在GenBank 網(wǎng)站上用Blast 軟件進行相似性搜索,得到相近典型菌株的16S rDNA 基因序列后,用軟件MEGA6.0 進行多重序列比對,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分析結(jié)果并確定菌株的分類地位。

    3 結(jié)果

    3.1 北芪內(nèi)生細菌的分離

    從健康北芪根部組織、 莖部組織中共分離出36 株內(nèi)生細菌,其中,從莖中分離得到16 株,從根中分離得到20 株。

    3.2 內(nèi)生細菌的抑菌活性

    在所分離得到的36 株北芪內(nèi)生細菌中,有31 株內(nèi)生細菌發(fā)酵液對11 株供試致病菌具有不同程度的抑菌作用,占分離菌株的86.11%,北芪內(nèi)生細菌抑菌活性篩選結(jié)果見表1。

    表1 北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液抑菌試驗結(jié)果Table 1 Antimicrobial activities of endophytic bacteria isolated from Astragalus membranaceus to the tested bacteria and fungi in screening

    3.3 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果

    3.3.1 色譜條件下活性成分的分離 在3.1 節(jié)的色譜條件下,對照藥材液中各物質(zhì)得到了較好的分離,其中北芪根對照藥材液在與對照品芒柄花素相同保留時間處出現(xiàn)一相同色譜峰,該色譜峰采用對照品加入法確認為芒柄花素,結(jié)果見圖1。

    圖1 北芪生藥與對照品的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC of Astragalus membranaceus and reference substance

    3.3.2 北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果 采用HPLC 法分析36 株北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液不同極性部位,發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌HX8 及HX14 發(fā)酵液中含有大量活性物質(zhì),并且內(nèi)生細菌HX8、HX14 在與對照品及對照藥材對比分析后發(fā)現(xiàn),該菌株可能含有北芪活性成分芒柄花素,結(jié)果見圖2及圖3。

    由圖2可以看出,在保留時間10~12min 時,內(nèi)生細菌HX8 發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯、氯仿萃取所得的供試品液出現(xiàn)與北芪根、 莖生藥樣品相同的色譜峰;在保留時間18 min 左右時,內(nèi)生細菌HX8發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取所得供試品液中出現(xiàn)與北芪莖生藥樣品相同的色譜峰;由圖2和圖3可以看出,在保留時間44min 時,內(nèi)生細菌HX8、HX14發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取所得供試品液中出現(xiàn)與北芪根生藥樣品的活性成分——芒柄花素,上述試驗結(jié)果說明,內(nèi)生細菌HX8、HX14 發(fā)酵液中含有與北芪生藥相同或相似的活性成分,該檢測結(jié)果對深入研究北芪內(nèi)生細菌HX8、HX14 活性成分提供參考。

    圖2 北芪內(nèi)生細菌HX8 發(fā)酵液的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of fermentation broth of HX8

    3.4 菌種鑒定

    據(jù)抑菌試驗結(jié)果及HPLC 法對36 株北芪內(nèi)生細菌活性代謝物分析結(jié)果,對具有潛在應(yīng)用價值的北芪內(nèi)生細菌HX8 進行了菌種鑒定。

    3.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果 北芪內(nèi)生細菌HX8 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果見表2。

    3.4.2 16S rDNA 鑒定結(jié)果 北芪內(nèi)生細菌HX8 PCR 擴增后獲得1 條1 000 bp 左右的特異性條帶,將測序結(jié)果利用BLAST 分析并與GenBank中的核苷酸序列進行比對,然后用MEGA6.0 軟件構(gòu)建北芪內(nèi)生細菌HX8 的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4),分析其種屬關(guān)系。分析結(jié)果表明,HX8 序列(登錄號:KY010575)與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus strain MPF 15 的16S rDNA 序列的同源性最高,相似性為99%。結(jié)合菌體形態(tài)特征、生理生化鑒定結(jié)果確定菌株HX8 為枯草芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)。

    4 討論

    圖3 北芪內(nèi)生細菌HX14 發(fā)酵液的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of fermentation broth of HX14

    表2 北芪內(nèi)生細菌HX8 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of physiological and biochemical characteristics for strain HX8

    圖4 HX8 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain HX8

    以東北寒地藥用植物膜莢黃芪(北芪)為研究對象,對其根、莖中的內(nèi)生細菌進行了分離,并以抑菌活性為指標,對所分離得到的北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物進行抑菌活性篩選,以便能夠得到產(chǎn)生較好抑菌活性物質(zhì)的目的菌株,為開發(fā)新型防腐劑及新型抗菌藥物提供參考;同時,以芒柄花素及北芪生藥為對照,采用HPLC 法對北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物進行對比分析;結(jié)果表明,在36 株北芪內(nèi)生細菌次生代謝產(chǎn)物中,存在著大量具有較好抑菌作用的活性物質(zhì),其中北芪內(nèi)生細菌HX8,HX14 代謝物表現(xiàn)出了較好的抑菌活性,同時經(jīng)HPLC 比對分析發(fā)現(xiàn),此2 株內(nèi)生細菌發(fā)酵液中活性物質(zhì)可能含有與北芪生藥活性成分相同或相似,是北芪活性成分產(chǎn)生菌,因此對此2株內(nèi)生細菌中具有潛在應(yīng)用價值的HX8 進行了菌種鑒定,為該菌株的深入研究奠定基礎(chǔ)。

    以芒柄花素為代表的黃酮類成分為黃芪主要活性成分之一[21],其中芒柄花素具有降壓、抗癌及抗菌作用,是常用的藥物原料[22],本文以芒柄花素及北芪生藥為陽性雙對照,對北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵液進行篩選,結(jié)果表明2 株北芪內(nèi)生細菌HX8,HX14 發(fā)酵液中疑似含有芒柄花素,該結(jié)果對后續(xù)課題組采用柱色譜法分離此2 株目的細菌活性成分奠定基礎(chǔ);同時,也為采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)芒柄花素成分提供理論依據(jù)。此外,對北芪內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物進行系統(tǒng)篩選研究,發(fā)掘出北芪活性成分產(chǎn)生菌,并對其進行綜合利用,這對開發(fā)新資源、 采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)北芪活性成分及保護北芪藥用植物可持續(xù)利用具有重要意義。

    猜你喜歡
    芒柄生藥花素
    基于偏振光顯微鏡與λ波長補償器聯(lián)用在生藥顯微鑒別中的應(yīng)用研究
    山豆根及其混偽品生藥學(xué)研究進展
    燈盞花素分散片溶出度檢測方法的改進
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:41:28
    燈盞花素注射液對腹腔鏡全子宮切除術(shù)患者圍術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的影響
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:19:08
    芒柄花素平衡溶解度和油水分配系數(shù)的測定
    芒柄花素的現(xiàn)代研究進展
    芒柄花素抑制乳腺癌細胞HIF-1α/CXCR4信號以及細胞增殖和遷移
    制劑新技術(shù)在燈盞花素研發(fā)中的應(yīng)用
    芒柄花素對兔離體腸平滑肌舒張作用的影響
    生藥信息卡的制作與使用
    欧美区成人在线视频| 国产91av在线免费观看| 下体分泌物呈黄色| 国产高清有码在线观看视频| 日韩av免费高清视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 中国三级夫妇交换| 黄片无遮挡物在线观看| 蜜桃在线观看..| 一本色道久久久久久精品综合| 久久久久久久久久人人人人人人| 高清毛片免费看| 一二三四中文在线观看免费高清| 成人国产麻豆网| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| 高清不卡的av网站| 少妇人妻久久综合中文| 久久国产精品大桥未久av | 国产一区亚洲一区在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲精品一区蜜桃| 国模一区二区三区四区视频| 少妇人妻久久综合中文| 九九在线视频观看精品| 亚洲精品一区蜜桃| 老司机影院成人| 有码 亚洲区| 日本与韩国留学比较| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 97在线视频观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 在线播放无遮挡| 中文字幕制服av| 男男h啪啪无遮挡| 69精品国产乱码久久久| 国产有黄有色有爽视频| videos熟女内射| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产精品久久久久久精品古装| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲电影在线观看av| 亚洲第一av免费看| 久久人人爽人人片av| 国产男女内射视频| 日本色播在线视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 51国产日韩欧美| 国产视频首页在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久99热6这里只有精品| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99热国产这里只有精品6| av天堂中文字幕网| 中文字幕久久专区| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 大码成人一级视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩成人伦理影院| 国产精品久久久久久精品古装| 成人无遮挡网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 伊人久久精品亚洲午夜| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久ye,这里只有精品| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲经典国产精华液单| av黄色大香蕉| 国产亚洲一区二区精品| 春色校园在线视频观看| 日本av手机在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| 男的添女的下面高潮视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久99一区二区三区| 又爽又黄a免费视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品久久久久久久久av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久99一区二区三区| 国产永久视频网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美日韩在线观看h| 久久国产乱子免费精品| 久久精品国产自在天天线| 亚洲国产av新网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 午夜免费鲁丝| 毛片一级片免费看久久久久| av不卡在线播放| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲久久久国产精品| 国产一区二区三区综合在线观看 | 婷婷色综合www| 午夜激情福利司机影院| 欧美日韩亚洲高清精品| 老熟女久久久| 亚洲精品一二三| 国产熟女欧美一区二区| 精品久久久久久久久亚洲| 夫妻午夜视频| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜影院在线不卡| 色网站视频免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 两个人的视频大全免费| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一级a做视频免费观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 18+在线观看网站| 欧美日本中文国产一区发布| 日本黄大片高清| 婷婷色综合大香蕉| 久久ye,这里只有精品| 日韩亚洲欧美综合| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩东京热| 国产黄频视频在线观看| 色哟哟·www| 99九九在线精品视频 | √禁漫天堂资源中文www| 国产日韩欧美视频二区| 久久国产精品大桥未久av | 国产毛片在线视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲丝袜综合中文字幕| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品熟女久久久久浪| 久久毛片免费看一区二区三区| 一区在线观看完整版| 午夜福利视频精品| 日韩欧美一区视频在线观看 | 丝袜喷水一区| 亚洲av中文av极速乱| 久久精品久久精品一区二区三区| tube8黄色片| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 成年av动漫网址| 熟女电影av网| 天美传媒精品一区二区| 国产乱人偷精品视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲情色 制服丝袜| 国产91av在线免费观看| 亚洲精品自拍成人| 大片免费播放器 马上看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 一本久久精品| a级片在线免费高清观看视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲国产色片| 欧美激情国产日韩精品一区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲av二区三区四区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品亚洲成国产av| 中文欧美无线码| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www | 人妻夜夜爽99麻豆av| 我要看日韩黄色一级片| 在线观看人妻少妇| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品少妇内射三级| av视频免费观看在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 久久国内精品自在自线图片| 久久久久久久久久成人| 十分钟在线观看高清视频www | 亚洲精品aⅴ在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 欧美一级a爱片免费观看看| av在线观看视频网站免费| 久久午夜福利片| 在线观看免费视频网站a站| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲综合精品二区| 人人妻人人看人人澡| 日韩精品有码人妻一区| 欧美日韩av久久| 欧美日本中文国产一区发布| av一本久久久久| 亚洲图色成人| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日韩免费高清中文字幕av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲伊人久久精品综合| 妹子高潮喷水视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久99热这里只频精品6学生| 日日啪夜夜爽| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩欧美一区视频在线观看 | 91成人精品电影| 亚洲真实伦在线观看| 久久午夜福利片| 国产在线男女| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 少妇熟女欧美另类| 天天操日日干夜夜撸| 久久99热这里只频精品6学生| 国产色婷婷99| 99久久精品热视频| 久久精品国产亚洲网站| 天天操日日干夜夜撸| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产伦精品一区二区三区四那| av福利片在线| 人妻系列 视频| av.在线天堂| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲三级黄色毛片| 日韩大片免费观看网站| 中文字幕亚洲精品专区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产在视频线精品| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 天堂中文最新版在线下载| 久久青草综合色| 精品一区二区三卡| 日韩大片免费观看网站| 99久久人妻综合| 亚洲av国产av综合av卡| 免费观看的影片在线观看| 久久久久久久久久成人| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产淫语在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 如何舔出高潮| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 丰满少妇做爰视频| 国产精品国产av在线观看| 日韩大片免费观看网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 日日啪夜夜撸| 丝袜脚勾引网站| 久久女婷五月综合色啪小说| 日日爽夜夜爽网站| 午夜福利,免费看| 大片电影免费在线观看免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费看光身美女| 成人特级av手机在线观看| 日本91视频免费播放| 欧美日韩精品成人综合77777| 熟女人妻精品中文字幕| 制服丝袜香蕉在线| 成人无遮挡网站| 日本黄色日本黄色录像| 男女国产视频网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 新久久久久国产一级毛片| 五月伊人婷婷丁香| 婷婷色av中文字幕| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美最新免费一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 伊人久久国产一区二区| 美女主播在线视频| 妹子高潮喷水视频| 国产精品福利在线免费观看| 97精品久久久久久久久久精品| 日本免费在线观看一区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 黄色一级大片看看| 国产精品一区二区在线不卡| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级a做视频免费观看| 在线观看人妻少妇| 成人国产av品久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品国产三级国产专区5o| 交换朋友夫妻互换小说| av女优亚洲男人天堂| 熟女电影av网| 最近手机中文字幕大全| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲欧美成人精品一区二区| 午夜激情久久久久久久| 久久狼人影院| 国产亚洲91精品色在线| 男人添女人高潮全过程视频| 国产亚洲欧美精品永久| 日本欧美视频一区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品一区二区免费观看| 97在线人人人人妻| 观看av在线不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 免费高清在线观看视频在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 五月天丁香电影| av.在线天堂| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲中文av在线| 天堂8中文在线网| 赤兔流量卡办理| 九色成人免费人妻av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品午夜福利在线看| 一个人免费看片子| 大码成人一级视频| 男女无遮挡免费网站观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产日韩欧美在线精品| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩欧美一区视频在线观看 | 99re6热这里在线精品视频| 我要看日韩黄色一级片| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费看光身美女| 综合色丁香网| 不卡视频在线观看欧美| 国产黄片视频在线免费观看| 一个人看视频在线观看www免费| 免费大片18禁| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 色视频在线一区二区三区| 欧美+日韩+精品| 青春草亚洲视频在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 我要看日韩黄色一级片| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲,一卡二卡三卡| 伦精品一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 国产毛片在线视频| 免费观看性生交大片5| 伦精品一区二区三区| 人人澡人人妻人| 在线播放无遮挡| 久久久久人妻精品一区果冻| 在线精品无人区一区二区三| 中文字幕av电影在线播放| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜福利视频精品| 欧美区成人在线视频| 最后的刺客免费高清国语| .国产精品久久| 一区二区三区免费毛片| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品久久久久成人av| 欧美xxⅹ黑人| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲精品日本国产第一区| 国产免费福利视频在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| a级毛色黄片| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产视频内射| 亚洲熟女精品中文字幕| 高清毛片免费看| 国产一区二区在线观看av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲国产欧美在线一区| 赤兔流量卡办理| 久久久久人妻精品一区果冻| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久久国产网址| 国模一区二区三区四区视频| 制服丝袜香蕉在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产极品天堂在线| 欧美 日韩 精品 国产| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 人妻 亚洲 视频| 国产视频首页在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 黄色怎么调成土黄色| 成年人免费黄色播放视频 | 亚洲久久久国产精品| 亚洲色图综合在线观看| 黄色日韩在线| 婷婷色综合www| 两个人的视频大全免费| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产一区二区三区av在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 精品久久久精品久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 男人和女人高潮做爰伦理| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品偷伦视频观看了| 超碰97精品在线观看| 日本午夜av视频| 亚洲人成网站在线播| 亚洲综合色惰| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品国产成人久久av| 麻豆成人av视频| 免费观看无遮挡的男女| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 久久久久精品性色| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产一级毛片在线| 久久久久久伊人网av| 成人综合一区亚洲| av福利片在线观看| 高清欧美精品videossex| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 天堂俺去俺来也www色官网| 日韩中字成人| 十八禁高潮呻吟视频 | 18+在线观看网站| 黄色怎么调成土黄色| h日本视频在线播放| 婷婷色综合www| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品伦人一区二区| 日本wwww免费看| 观看免费一级毛片| 激情五月婷婷亚洲| 欧美激情极品国产一区二区三区 | av国产精品久久久久影院| av天堂中文字幕网| 下体分泌物呈黄色| 欧美日韩视频精品一区| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 少妇被粗大猛烈的视频| 国产深夜福利视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品国产av在线观看| 综合色丁香网| 九九在线视频观看精品| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品福利在线免费观看| 久久久久久久久久久丰满| 日韩三级伦理在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 中文字幕av电影在线播放| 全区人妻精品视频| 秋霞在线观看毛片| 99热国产这里只有精品6| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成人特级av手机在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费观看a级毛片全部| 91成人精品电影| 久久久精品94久久精品| 国产成人精品福利久久| 国产亚洲精品久久久com| freevideosex欧美| 久久精品国产亚洲av天美| 国产亚洲欧美精品永久| 国产探花极品一区二区| 精品久久久精品久久久| 亚洲av中文av极速乱| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人国产av品久久久| 三级国产精品欧美在线观看| 老司机亚洲免费影院| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久久伊人网av| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲av日韩在线播放| 日韩一区二区三区影片| 亚洲伊人久久精品综合| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 三级国产精品欧美在线观看| 久热久热在线精品观看| av免费观看日本| 乱人伦中国视频| 国国产精品蜜臀av免费| 三级经典国产精品| av女优亚洲男人天堂| 国产熟女午夜一区二区三区 | 边亲边吃奶的免费视频| 国产精品蜜桃在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲无线观看免费| 国产高清有码在线观看视频| 久久人妻熟女aⅴ| 久久精品久久久久久久性| 日韩制服骚丝袜av| 另类亚洲欧美激情| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| a级毛片在线看网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 国产成人一区二区在线| 国产亚洲精品久久久com| 欧美精品一区二区免费开放| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久久久久久久久人人人人人人| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲欧洲国产日韩| 赤兔流量卡办理| 99久久综合免费| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| www.色视频.com| 在线播放无遮挡| 插阴视频在线观看视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲国产精品国产精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 中文在线观看免费www的网站| 99九九线精品视频在线观看视频| 人体艺术视频欧美日本| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产伦在线观看视频一区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产黄频视频在线观看| 亚洲第一av免费看| 国产av国产精品国产| 美女大奶头黄色视频| 国产91av在线免费观看| 男女国产视频网站| 熟女电影av网| 丝袜在线中文字幕| 啦啦啦在线观看免费高清www| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 成人午夜精彩视频在线观看| 午夜91福利影院| 黄片无遮挡物在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久99热这里只频精品6学生| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美成人午夜免费资源| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 我的女老师完整版在线观看| 免费看光身美女| 国产片特级美女逼逼视频| 少妇人妻 视频| 熟女av电影| 一本一本综合久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| 在线播放无遮挡| 国产精品熟女久久久久浪| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 69精品国产乱码久久久| 赤兔流量卡办理| 婷婷色综合www| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品国产av在线观看| 一本大道久久a久久精品| 日韩中字成人| 国产精品人妻久久久久久| 一本久久精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 18+在线观看网站| 99久国产av精品国产电影| 国内揄拍国产精品人妻在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 老司机亚洲免费影院| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产毛片在线视频| 久久久久精品性色| 亚洲综合色惰| 国产在线视频一区二区| 久久精品夜色国产| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 五月开心婷婷网| 韩国av在线不卡| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av天堂中文字幕网| 美女视频免费永久观看网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 插逼视频在线观看|