石斛屬植物再生及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

夏 科, 吳巧芬, 趙志國(guó), 蔣慶鴻, 仇 碩

(廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

石斛屬(DendrobiumSwartz)為蘭科(Orchidaceae)三大屬之一，其原種將近2 000種，我國(guó)約60多種[1]。石斛屬植物有白色、黃色、綠色、粉紅色、粉紫色、紫紅色、紅棕色和棕色等諸多花色，形態(tài)各異，具有很高的觀賞價(jià)值，是世界“四大觀賞洋蘭”之一，也被譽(yù)為“父親節(jié)之花”。石斛屬植物含有石斛堿、石斛銅堿、石斛胺等多種生物堿類中成藥成分，其中鐵皮石斛更被譽(yù)為“中華九大仙草”之首[2]。因而，石斛屬植物是一類兼具觀賞和藥用價(jià)值的重要植物，備受消費(fèi)者鐘愛(ài)。

早期，國(guó)內(nèi)對(duì)石斛屬植物的研究主要集中在資源調(diào)查與引種栽培[3]、分類鑒定[4]、雜交育種[5]、組織培養(yǎng)[6]、花期調(diào)控[7]等方面，并取得很多重要的研究成果。近年來(lái)，隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已利用分子生物學(xué)技術(shù)開(kāi)展石斛屬分類鑒定[8]、基因的克隆與分析[9]、遺傳轉(zhuǎn)化[10-11]等研究。成熟的組織培養(yǎng)體系是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)，隨著組織培養(yǎng)技術(shù)在石斛屬植物中的廣泛應(yīng)用, 其基因工程研究也取得了很大進(jìn)展[12-14]。本文從石斛屬植物再生體系建立及遺傳轉(zhuǎn)化等方面進(jìn)行概述，探討了目前遺傳轉(zhuǎn)化存在的問(wèn)題并提出解決方案，分析了石斛屬植物的組織培養(yǎng)未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)和商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，以期為石斛屬植物分子生物學(xué)相關(guān)的研究以及基因工程培育新品種奠定基礎(chǔ)。

1 石斛屬植物組織培養(yǎng)及再生體系的建立

1.1 培養(yǎng)基質(zhì)及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

自1937年第1個(gè)植物組織培養(yǎng)基誕生以來(lái)，已衍生出上千種培養(yǎng)基[15]，但能滿足多數(shù)物種常用的培養(yǎng)基種類卻相對(duì)較少，主要有White、MS、B5、SH、N6、NN、DKW、WPM、H、Miller、Heller、ER、NT、LS等14種[16]。石斛屬植物組織培養(yǎng)以MS和1/2MS培養(yǎng)基為主，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)奶烊惶崛∥?，如椰子汁[17]和香蕉泥[18]等，對(duì)石斛原球莖的形成及生長(zhǎng)有較大的促進(jìn)作用。石斛屬植物組織培養(yǎng)過(guò)程中常需要添加外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如NAA、BA、KT等，其對(duì)外植體的誘導(dǎo)、增殖分化、生根、發(fā)芽均起到關(guān)鍵性的作用[19]。植物細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)器官形成和次生產(chǎn)物的合成所需植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、配比和濃度不同，因此不同的石斛品種應(yīng)選擇合適的1種或多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行誘導(dǎo)。此外，培養(yǎng)基中加入適量的生物胺，能促進(jìn)鐵皮石斛的原球莖轉(zhuǎn)化為芽[20]。目前，石斛屬已有多種組培快繁的成功報(bào)道，如鐵皮石斛[21]、秋石斛[22]、翅萼石斛[23]和報(bào)春石斛[24]等。

1.2 外植體材料的選擇

目前，石斛屬組培苗大多通過(guò)誘導(dǎo)外植體形成原球莖(類原球莖)，然后分化培養(yǎng)產(chǎn)生芽或者叢生芽而獲得。陳齊明等[25]研究表明，石斛屬莖尖和側(cè)芽頂端分生區(qū)細(xì)胞的分裂能力強(qiáng)，容易誘導(dǎo)出原球莖；明興加等[26]認(rèn)為，利用假鱗莖可誘導(dǎo)出腋芽。雖然莖尖、側(cè)芽和莖段都是高質(zhì)量的外植體，但其來(lái)源有限，特別是對(duì)于珍稀石斛品種，很可能喪失母本。石斛種子可進(jìn)行非共生萌發(fā)，目前已有多個(gè)物種通過(guò)無(wú)菌播種技術(shù)進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，如鐵皮石斛[27]、竹葉石斛[28]和兜唇石斛[29]等，但利用種子進(jìn)行培養(yǎng)易產(chǎn)生性狀分離。此外，石斛屬植物的根、葉、莖段等部位也可以作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，但成功率較低或者難度較大。目前，已有利用根尖作外植體進(jìn)行誘導(dǎo)的成功報(bào)道[30]，但根部因有大量的內(nèi)生菌，較難脫毒，易污染。而以葉片和莖段作為外植體具有母本傷害小、數(shù)量大、取材不受季節(jié)影響等優(yōu)勢(shì)，但誘導(dǎo)率較低，葉片誘導(dǎo)率僅1.95 %～11.99 %，莖段僅1.02%～35.57%[31]。

外植體的選擇是能否成功誘導(dǎo)原球莖的關(guān)鍵，選取較幼嫩且生長(zhǎng)旺盛的部位作為外植體是誘導(dǎo)原球莖形成的理想來(lái)源，如莖尖、側(cè)芽、莖切段和種子等。

1.3 離體培養(yǎng)條件

無(wú)論是在自然條件還是在離體培養(yǎng)條件下，植物的光和溫度信號(hào)都是互相聯(lián)系的[32]。不同的光照和溫度等培養(yǎng)條件對(duì)石斛屬原球莖增殖分化的影響不同[33]，可能是光照改變了激素水平從而影響原球莖增殖分化[34]。Lin et al[33]研究表明，藍(lán)光誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖的分化率最高。秦廷豪[35]研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖有明顯影響，低溫有利于減少分生苗的數(shù)量，形成健壯高大的試管苗。Luo et al[36]發(fā)

現(xiàn)，低溫處理可以顯著提高霍山石斛原球莖的分化率。目前，石斛屬植物組培快繁過(guò)程中通常選擇的溫度為(25±1) ℃、光照強(qiáng)度1 600～2 000 lx、光照時(shí)間10～12 h。

1.4 移栽馴化

張玲菊等[37]研究表明，光照強(qiáng)度會(huì)影響不同種源鐵皮石斛的凈光合速率、光補(bǔ)償點(diǎn)和光飽和點(diǎn)。不同光源對(duì)石斛種苗的影響不同，如紅光有利于鐵皮石斛種苗根系與苗高生長(zhǎng)，藍(lán)光有利于莖增粗與生物堿積累，而紅藍(lán)混光(紅光∶藍(lán)光=8∶2)則有利于提高葉綠素、多糖含量及酶活性[38]。光照強(qiáng)度對(duì)霍山石斛生長(zhǎng)速度影響較大，僅早晚光強(qiáng)較低時(shí)有光合積累[39]；光照強(qiáng)度還會(huì)改變金釵石斛吸收和同化CO2的途徑，使其在CAM途徑與C3途徑間轉(zhuǎn)換[40]。溫度和濕度對(duì)石斛光合速率的變化也有顯著影響，在不同的溫度和濕度下，光照強(qiáng)度的變化對(duì)凈光合速率的影響有較大差異[41]，從而影響石斛屬植物的生長(zhǎng)及多糖含量的積累[42-43]。此外，不同移栽基質(zhì)和移栽季節(jié)對(duì)組培苗移栽成活率也有很大影響，石斛屬植物組培苗移栽馴化常用的栽培基質(zhì)是樹(shù)皮和水苔，但需要根據(jù)具體種類或者栽培地的環(huán)境選擇不同配比[23-24]。

2 石斛屬植物遺傳轉(zhuǎn)化研究

2.1 遺傳轉(zhuǎn)化的受體

原球莖是蘭科等少數(shù)植物特有的一種生長(zhǎng)狀態(tài)，易誘導(dǎo)，共培養(yǎng)后瞬時(shí)表達(dá)率非常高，通過(guò)誘導(dǎo)形成愈傷組織，可再生成類原球莖，進(jìn)而再生植株，是最理想的轉(zhuǎn)化受體[44]。石斛屬植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體大多采用原球莖或類原球莖，如鐵皮石斛[45]、流蘇石斛[46]、金釵石斛[47]等。此外，石斛的愈傷組織和花序頂端組織也可作為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究，Tee et al[48]認(rèn)為，轉(zhuǎn)化的愈傷組織細(xì)胞不需經(jīng)過(guò)愈傷化發(fā)育或胚發(fā)育階段，能有效避免嵌合體的產(chǎn)生，是較理想的轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，但其最佳轉(zhuǎn)化狀態(tài)難以控制。

2.2 遺傳轉(zhuǎn)化的方法

植物遺傳轉(zhuǎn)化主要有以載體為媒介的基因轉(zhuǎn)移和直接轉(zhuǎn)移2種方法[49]。其中，載體法需要借助農(nóng)桿菌侵染才能實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入；直接轉(zhuǎn)移法則是通過(guò)物理化學(xué)方法將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，主要包括：基因槍法、電擊法、超聲波法、花粉管通道法、多聚物介導(dǎo)法等[50]。每個(gè)物種受體的特征不一樣，應(yīng)選擇最適的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。目前，石斛屬植物遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最多的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法。

2.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是指將目的基因融合到農(nóng)桿菌細(xì)胞中含有Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒的一段T-DNA(transferring DNA)，使目的基因整合到植物的染色體上[51]。雖然農(nóng)桿菌介導(dǎo)法插入的外源基因多數(shù)為單拷貝，且具有符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律和方法簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，但該方法存在物種選擇有限、易產(chǎn)生嵌合體、耗時(shí)、轉(zhuǎn)化效率低等缺陷。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前石斛屬植物遺傳轉(zhuǎn)化使用最頻繁的方法之一。Uddain et al[44]研究表明，與大腸桿菌相比，農(nóng)桿菌對(duì)石斛屬植物原球莖的趨向性更積極。目前，用于石斛屬植物遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌有：LBA4404[10]、EHA105[52]、AGL1[52]、GV3101[53]、C58[46]等，其中LBA4404和EHA105是使用最頻繁和侵染能力較強(qiáng)的2種菌株。張妙彬等[54]研究表明，相同條件下，EHA105比LBA4404對(duì)石斛蘭類原球莖的侵染能力更強(qiáng)。適合石斛屬植物表達(dá)的載體有：pCAMBIA1301[52，55]、pCAMBIA1303[56]、pCAMBIA1304[14,57]、pCAMBIA1305[58]、pCAMBIA3301[45]、pBI121[10]、pIG121[53]等，其中使用較頻繁的載體是pCAMBIA1301。抗生素在石斛屬遺傳轉(zhuǎn)化中十分重要，會(huì)直接影響轉(zhuǎn)化子的篩選。常用于石斛屬遺傳轉(zhuǎn)化篩選的抗生素有：氨芐青霉素、羧芐青霉素、頭孢噻肟、頭孢哌酮、潮霉素和卡那霉素。Cao et al[53]研究發(fā)現(xiàn)，美羅培南作為一種新型抗生素比其他常用抗生素具有更高效的抗農(nóng)桿菌特性。

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究在一些石斛雜交種[10]、金釵石斛[52]、春石斛[59-60]、密花石斛[61]、鐵皮石斛[62]和流蘇石斛[46]等石斛屬植物中已見(jiàn)報(bào)道。Yu et al[10]將反義DOH1序列導(dǎo)入石斛蘭并成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)植株出現(xiàn)多芽發(fā)育異常表型；李鳳華等[63]利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化金釵石斛莖、葉片和葉柄，并成功誘導(dǎo)出石斛毛狀根，此結(jié)果將為石斛生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)；張振華[64]將建蘭的花葉病毒外殼蛋白基因(CyMV-CP)成功導(dǎo)入秋石斛的2個(gè)品種體內(nèi)，開(kāi)創(chuàng)了石斛屬抗花葉病毒的研究先河；崔波等[45]將ACC合成酶反義序列成功導(dǎo)入鐵皮石斛；黃超群[46]和楊翠芹[47]利用正交設(shè)計(jì)方案優(yōu)化石斛屬遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)研究石斛屬品種的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的參考價(jià)值。

2.2.2 基因槍法 基因槍法又稱粒子轟擊細(xì)胞法或微彈技術(shù)，是把粘有DNA的細(xì)微金粉打向細(xì)胞，整合到植物染色體上，完成基因轉(zhuǎn)移[65]。該方法具有不受受體類型限制、操作簡(jiǎn)單省時(shí)、可控度高、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化頻率相對(duì)較高等優(yōu)勢(shì)，但存在價(jià)格昂貴、后代遺傳不穩(wěn)定等缺陷。1992年，Kuehnle et al[66]最早采用基因槍法轉(zhuǎn)化石斛蘭并成功獲得轉(zhuǎn)化子，此后該方法被應(yīng)用于多種石斛屬植物遺傳轉(zhuǎn)化。Chia et al[67]利用基因槍法將luc標(biāo)記基因?qū)胧m原球莖，并首次成功獲得轉(zhuǎn)化植株；密花石斛、金釵石斛和蝴蝶石斛也用該方法成功獲得轉(zhuǎn)基因植株[55,68]；楊雪飛[12]利用基因槍法將大麥抗旱耐鹽基因LEA3導(dǎo)入鐵皮石斛原球莖，成功獲得抗旱耐鹽新品種。

目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法已應(yīng)用于多種石斛屬植物遺傳轉(zhuǎn)化，但相對(duì)于雙子葉植物和被子植物，其轉(zhuǎn)化效率較低，一般瞬時(shí)轉(zhuǎn)化頻率不超過(guò)60%，而通過(guò)抗生素篩選后，獲得抗性植株的概率更低[55，59]。崔波等[45]研究表明，不同農(nóng)桿菌濃度和AS濃度對(duì)鐵皮石斛原球莖的GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率分別為0～22.22%和9.52%～58.82%；Yu et al[68]利用基因槍轉(zhuǎn)化Dendrobiumhybrid時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)潮霉素篩選后，僅得到5%～10%的抗性植株；Men et al[55]研究蝴蝶石斛和金釵石斛遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)潮霉素篩選后，分別得到12%和2%的抗性植株。因此，如何提高石斛屬植物的轉(zhuǎn)化效率仍是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。

2.2.3 蘭科植物其他遺傳轉(zhuǎn)化方法 蘭科作為一個(gè)進(jìn)化程度較高的大科，至今已開(kāi)展很多遺傳轉(zhuǎn)化的研究，除利用上述兩種常見(jiàn)的遺傳轉(zhuǎn)化方法外，還有利用其他轉(zhuǎn)化方法的研究報(bào)道。Steinhart et al[69]應(yīng)用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化萬(wàn)帶蘭花的原生質(zhì)體，22 h后檢測(cè)到GUS的瞬時(shí)表達(dá)；Griesbach et al[70]使用電激發(fā)法，以蝦脊蘭為受體材料，導(dǎo)入GUS并獲得轉(zhuǎn)基因植株。但石斛屬植物利用其他轉(zhuǎn)化方法的報(bào)道較少，冼康華等[71]將攜帶GFP和GUS報(bào)告基因的載體通過(guò)花粉管通道成功轉(zhuǎn)化了鐵皮石斛。

3 石斛屬植物再生及遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用

石斛屬植物多為名貴的觀賞和藥用植物，多數(shù)品種已建立成熟的再生體系。國(guó)外多年前已對(duì)觀賞類的石斛蘭進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)，日本20世紀(jì)60年代就設(shè)立了專門的蘭花研究機(jī)構(gòu)，成立高度集約化生產(chǎn)的株式會(huì)社，效益顯著[72]；泰國(guó)于1967年開(kāi)始進(jìn)行石斛蘭切花產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，已成為世界上最大的蘭花出口國(guó)[73]。我國(guó)海南因其得天獨(dú)厚的地理優(yōu)勢(shì)成為發(fā)展石斛蘭(主要是觀賞類秋石斛)的主要基地，多通過(guò)科研院校聯(lián)合企業(yè)開(kāi)發(fā)，規(guī)?；a(chǎn)不斷擴(kuò)大，經(jīng)營(yíng)多種石斛蘭[74]；云南省是我國(guó)藥用類石斛主產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的70%以上[75]，建立了鐵皮石斛、紫皮石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛等成熟的組織快繁技術(shù)，并進(jìn)行工廠化種苗生產(chǎn)[76]；安徽的霍山石斛通過(guò)“胚培養(yǎng)—原球莖—完整植株”的快繁模式實(shí)現(xiàn)了種苗的規(guī)?；焖俜敝砙77]；近年來(lái)，獨(dú)角石斛[78]和串珠石斛[79]等多個(gè)種的組培快繁技術(shù)體系也達(dá)到了規(guī)?；a(chǎn)的水平。然而，石斛組培快繁技術(shù)在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用上仍然存在培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣，人力、物力成本較高等問(wèn)題，今后應(yīng)加強(qiáng)縮短種苗培養(yǎng)周期及提高生產(chǎn)效率等方面的研究。

石斛屬植物大部分種類遺傳轉(zhuǎn)化體系不成熟，仍存在轉(zhuǎn)化效率低以及轉(zhuǎn)基因植株難獲得等難題，使得石斛屬很多基因功能的研究只能轉(zhuǎn)向模式植物，如花器官發(fā)育相關(guān)基因功能研究，只能利用擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)

基因功能驗(yàn)證[80-81]。目前僅有少數(shù)成功的轉(zhuǎn)基因報(bào)道，如利用基因槍法將LEA3導(dǎo)入鐵皮石斛并成功獲得抗性植株的研究[12]。石斛屬植物遺傳轉(zhuǎn)化體系不成熟的問(wèn)題嚴(yán)重制約了很多基礎(chǔ)理論的研究以及基因工程的應(yīng)用發(fā)展，今后應(yīng)持續(xù)加大科研力度。

4 展望

成熟的組織培養(yǎng)再生體系及穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是獲得轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵。石斛屬植物多為名貴的觀賞和藥用植物，目前已建立成熟的再生體系，也開(kāi)發(fā)了SSR等分子標(biāo)記[82]，但其遺傳轉(zhuǎn)化體系還存在許多難以解決的問(wèn)題，如多數(shù)種類遺傳轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定，仍然存在轉(zhuǎn)化效率低以及很難獲得轉(zhuǎn)基因植株等問(wèn)題。而諸如研究花發(fā)育、花色、花香、抗逆性等相關(guān)的基礎(chǔ)理論以及通過(guò)轉(zhuǎn)基因工程培育優(yōu)良品種等，均會(huì)利用遺傳轉(zhuǎn)化這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，針對(duì)目前研究現(xiàn)狀，提出如下建議：

(1)完善農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。進(jìn)一步研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法的影響因素，包括受體處理方式、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、AS添加量、共培養(yǎng)時(shí)間、抗生素的選擇及用量、最佳培養(yǎng)方式等，以確定適合不同品種的最佳轉(zhuǎn)化條件。(2)將農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與基因槍法相結(jié)合，提高轉(zhuǎn)化效率。建立一套新的遺傳轉(zhuǎn)化途徑，包括農(nóng)桿槍法[83]、基因槍轟擊/農(nóng)桿菌感染法[84]、以金粉或鎢粉包裹菌體作為微彈的轟擊法[85]等。(3)探索其他植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前，有關(guān)植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法還包括：花粉管通道法、真空滲入法、莖尖轉(zhuǎn)化法、超聲波輔助的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、碳化硅纖維介導(dǎo)法、葉綠體轉(zhuǎn)化法以及藻酸鈣微珠介導(dǎo)法等[86]。同時(shí)，可以借鑒一種應(yīng)用于擬南芥的新型遺傳轉(zhuǎn)化方法——蘸花法，該法能有效避開(kāi)植物組培，具有轉(zhuǎn)化效率高、重復(fù)性好、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)[87-88]。探索新的遺傳轉(zhuǎn)化方法可以彌補(bǔ)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法的缺點(diǎn)，使其更加適用于石斛屬植物的遺傳轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。