滇黃精多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究

李智敏,石 瑤,趙純希,于麗娟,張易蓮,張 庭,李晚誼,肖 丹

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650200；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650223；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665099)

滇黃精(Polygonatumkingianumcoll.et Hemsl in Journ)屬百合科(Liliaceae)多年生草本植物，為藥食同源植物.2015年版《中國藥典》中記載滇黃精具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎的功效[1].前人研究報道滇黃精中富含多糖、皂苷、生物堿、黃酮、氨基酸等多種對人體有益的活性成分，多糖作為主要活性成分，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血糖血脂等生理作用[2-5].黃精多糖主要包括中性多糖和酸性多糖，酸性多糖主要由甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和巖藻糖組成，中性多糖主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和木糖組成[6-7].

目前，研究中報道的應(yīng)用于黃精多糖提取的方法有很多種，主要包括水提醇沉法、堿水提取法、超聲波輔助提取法、生物酶提取法、閃式提取法等[8-12].各提取方法提取效果不同，都存在各自優(yōu)缺點(diǎn).本研究主要采用傳統(tǒng)的水提醇沉法對滇黃精中的黃精多糖進(jìn)行提取，采用正交試驗設(shè)計，系統(tǒng)地優(yōu)化提取參數(shù)，獲得最佳的提取工藝，并對提取的多糖進(jìn)行抗氧化性研究.此方法操作簡單，對提取設(shè)備要求不高，可應(yīng)用于大量提取.旨在為滇黃精多糖工業(yè)化提取和滇黃精多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

QYJ旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)(上海南崛中藥機(jī)械制造有限公司)；CY-500A高速多功能粉碎機(jī)(上海塞耐機(jī)械有限公司)；UV-5500紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)； R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(BUCHI公司)；超聲波清洗儀(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)，101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，DW-FL288低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司).

滇黃精由云南玉溪市祥馨農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司提供，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為滇黃精；蒽酮，葡萄糖購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)購于梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；硫酸亞鐵，抗壞血酸(Vc)購于廣東光華科技股份有限公司；水楊酸，過氧化氫，鄰苯三酚，無水乙醇購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；鹽酸購于西隴化工股份有限公司；Tris-HCl購于北京酷來搏科技有限公司(所有試劑均為分析純).

1.2 實驗方法

1.2.1 滇黃精預(yù)處理

取若干新鮮滇黃精根莖，去除表面雜質(zhì)，洗凈，瀝干表面大部分水分，切片機(jī)切片，干燥，粉碎，過 0.301 mm 篩備用.

1.2.2 滇黃精多糖的提取和純化

提取方法參照文獻(xiàn)[13]，略有改動.

稱取干燥的滇黃精粉末適量，1∶30料液比加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇水浴回流脫脂2 h，過濾，再以1∶20 料液比加入蒸餾水，并在80 ℃下回流提取，過濾，濾液減壓濃縮至適量，按體積比1∶5加入95%乙醇進(jìn)行醇沉，4 ℃放置過夜.過濾，濾渣加適量蒸餾水溶解，并加入1/5的Sevage試劑(V氯仿∶V正丁醇=6∶1)進(jìn)行脫蛋白處理，棄去中間的變性蛋白層和下層有機(jī)溶劑，取上層多糖溶液減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑并濃縮，冷凍干燥制得滇黃精多糖提取物.

1.2.3 多糖含量測定

1) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 稱取干燥至恒重的葡萄糖適量，精密稱定，加水溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶配制成為質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.取一定體積標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配置質(zhì)量濃度為0.01、0.02、 0.03、 0.04、0.05、0.06、0.08 mg/mL的葡萄糖對照品溶液，依次取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL于7支干燥潔凈的試管中，以水為空白對照，在冰水浴冷卻下緩慢加入4 mL 0.2%蒽酮硫酸溶液，邊加邊輕輕搖動試管，混合均勻，滴加完畢后置于沸水浴中反應(yīng)10 min，取出后置于冰水浴中冷卻10 min，取出，待恢復(fù)至室溫后，測定吸光度，檢測波長為582 nm.以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=10.115x+0.0427，R2=0.997.

2) 供試品的測定方法 準(zhǔn)確移取樣品溶液1.0 mL，按照1.2.3下1項操作進(jìn)行吸光度測定.

3) 滇黃精多糖含量計算 采用硫酸-蒽酮對滇黃精多糖的含量進(jìn)行測定，計算公式為：

其中，ρ為測得多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)；D為稀釋倍數(shù)；V為多糖溶液的體積；m為稱取的滇黃精質(zhì)量(mg).

1.2.4 單因素試驗

1) 料液比 當(dāng)固定提取時間為2 h，提取次數(shù)為1次，提取溫度為80 ℃時，試驗研究料液比對滇黃精多糖提取率的影響，每組平行3次.

2) 提取時間 當(dāng)固定料液比為1∶20，提取次數(shù)為1次，提取溫度為80 ℃時，試驗研究提取時間對滇黃精多糖提取率的影響，每組平行3次.

3) 提取次數(shù) 當(dāng)固定料液比為1∶20，提取時間為2 h，提取溫度為80 ℃時，試驗研究提取次數(shù)對滇黃精多糖提取率的影響，每組平行3次.

4) 提取溫度 當(dāng)固定料液比為1∶20，提取時間為2 h，提取次數(shù)為1次時，試驗研究提取溫度對滇黃精多糖提取率的影響，每組平行3次.

1.2.5 正交試驗

研究以滇黃精多糖提取率為指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定影響因素的范圍，考察料液比、提取時間、提取溫度中對滇黃精多糖提取率的影響，設(shè)計正交試驗，其因素水平設(shè)計表如表1.

表1 因素水平設(shè)計表

1.2.6 滇黃精多糖抗氧化活性測定

1) 對DPPH自由基清除能力 參照文獻(xiàn)[14]中的方法并略作修改.稱取適量的DPPH，配制成0.04 mg/mL的DPPH溶液(無水乙醇配制).分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL多糖溶液(10 mg/mL)稀釋到2 mL，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫避光放置反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液測定吸光度，檢測波長為 517 nm，Vc為陽性對照.DPPH自由基的清除能力計算公式為：

其中，A0為蒸餾水代替樣品吸光度；A1為樣品吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH吸光度.

2) 對超氧自由基清除能力 參照文獻(xiàn)[15]的方法并略作修改.取3 mL濃度為50 mmol/L Tris-HCl于試管中，于25 ℃水浴下保溫放置20 min，隨后分別加入1 mL不同濃度的滇黃精多糖溶液以及0.2 mL濃度為5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻，25 ℃避光放置5 min，加8 mmol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，測定吸光度，檢測波長為325 nm，Vc作為陽性對照.超氧自由基清除能力計算公式為：

其中，A0為蒸餾水代替樣品吸光度，Ax為樣品吸光度.

3) 對羥基自由基清除能力 參照文獻(xiàn)[16]中的方法并略作修改.分別取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8，1 mL滇黃精多糖溶液(10 mg/mL)于試管中，并加蒸餾水稀釋到1 mL，依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、9 mmol/L水楊酸溶液(乙醇配制)、 8.8 mmol/L過氧化氫各1 mL，混合均勻，37 ℃下保溫反應(yīng) 30 min，于510 nm處測定吸光度，用Vc作為陽性對照.羥基自由基清除能力計算公式為：

其中，A0為蒸餾水代替樣品吸光度，A1為樣品吸光度，A2為蒸餾水代替過氧化氫吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比

由圖1可看出，當(dāng)料液比在1∶10～1∶50之間變化時，滇黃精多糖的提取率出現(xiàn)先增大后減小，并在1∶30處取得最大值，故本研究將1∶30作為正交試驗中料液比的中心點(diǎn).

圖1 料液比對滇黃精多糖提取率的影響

2.1.2 提取時間

由圖2可看出，隨著提取時間的延長滇黃精多糖的提取率出現(xiàn)先增大再減小后趨于穩(wěn)定的趨勢，并且當(dāng)提取時間為2 h時達(dá)到最大值，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因是前期隨著時間延長，滇黃精多糖不斷溶出，提取率不斷增大，但是過長時間的高溫環(huán)境容易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，因而后一段時間多糖提取率顯著下降后趨于平穩(wěn).故本研究將2 h作為正交試驗中提取時間的中心點(diǎn).

2.1.3 提取次數(shù)

由圖3可看出，隨著提取次數(shù)的增加，滇黃精多糖提取率的變化并不明顯，說明提取次數(shù)對于滇黃精多糖的提取率影響不顯著，綜合考慮時間及價格成本，將提取次數(shù)定為1次.

圖2 提取時間對滇黃精多糖提取率的影響

圖3 提取次數(shù)對滇黃精多糖提取率的影響

2.1.4 提取溫度

由圖4可以看出，在60～80 ℃內(nèi)，隨著提取溫度的升高，滇黃精多糖的提取率不斷增大，當(dāng)溫度超過80 ℃，多糖提取率反而下降.探究其原因，可能是在60～80 ℃這個溫度段內(nèi)，溫度升高會導(dǎo)致分子運(yùn)動加快，分子間的相互碰撞增加，從而促使多糖的溶出增加，但是當(dāng)溫度過高時，高溫會使多糖中的糖苷鍵遭到破壞，使得提取率降低.故本研究將80 ℃作為正交試驗提取溫度的中心點(diǎn).

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇料液比、提取時間、提取溫度這3個對滇黃精多糖提取率影響較大的因素進(jìn)行正交試驗設(shè)計，正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果如表2、表3所示.

根據(jù)正交試驗及方差分析結(jié)果可以得出當(dāng)以滇黃精多糖提取率為指標(biāo)時，3個因素對提取率的影響大小順序為：提取溫度C>料液比A>提取時間B，最佳提取工藝為A1B2C2，即料液比為1∶20，提取時間為2 h，提取溫度為80 ℃.

2.3 驗證試驗

按照正交優(yōu)化的最佳工藝對3份滇黃精樣品進(jìn)行多糖提取，結(jié)果測得多糖的提取率分別為13.06%、13.35%、13.28%，RSD為1.14%，結(jié)果表明該提取工藝無顯著性差異，重復(fù)性良好，可行.

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

2.4 抗氧化性測定結(jié)果

2.4.1 對DPPH自由基的清除效果

由圖5可知，Vc質(zhì)量濃度(ρ)為0.8 mg/mL時，DPPH自由基的清除率接近100%，說明Vc對DPPH自由基的清除能力強(qiáng)；滇黃精多糖質(zhì)量濃度(ρ)為10 mg/mL時，對DPPH自由基表現(xiàn)出一定的清除效果，清除率為43.8%.

2.4.2 對超氧自由基的清除效果

由圖6可知，滇黃精多糖質(zhì)量濃度與超氧自由基的清除率呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度達(dá)6 mg/mL以后增長趨向趨于平穩(wěn)；質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，清除率達(dá)50.6%；陽性對照組Vc對超氧自由基依然表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除能力，在質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，清除率基本達(dá)100%.與DPPH自由基相比，相同質(zhì)量濃度的滇黃精多糖對超氧自由基表現(xiàn)出更好的清除能力.

2.4.3 對羥基自由基的清除效果

由圖7可知，在質(zhì)量濃度0.4～0.8 mg/mL內(nèi)，陽性對照Vc對羥基自由基的清除能力不斷增強(qiáng)，質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時清除率基本已接近100%，表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除能力.滇黃精多糖對羥基自由基的清除表現(xiàn)出濃度越高，清除能力越強(qiáng)，質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，清除率高達(dá)87.3%.與DPPH自由基和超氧自由基相比，相同濃度的滇黃精多糖對羥基自由基的清除能力更強(qiáng).

圖5 滇黃精多糖對DPPH自由基的清除曲線

圖6 滇黃精多糖對超氧自由基的清除曲線

圖7 滇黃精多糖對羥基自由基的清除曲線

3 結(jié)語

滇黃精是食藥同源的多年生草本植物，其分布廣泛，同時具有多種藥理作用，受到研究者越來越廣泛的關(guān)注.但由于滇黃精的品種、產(chǎn)地、多糖組成等不同，各研究中報道的多糖含量及生物活性表現(xiàn)出較大差異.本研究以產(chǎn)自云南玉溪的滇黃精為原料，對其中滇黃精多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過正交試驗得出其最佳提取工藝為：料液比為1∶20，提取時間為2 h，提取溫度為80 ℃，在最佳工藝條件下提取率可達(dá)13.34%，可以用于放大試驗中滇黃精多糖的提取.同時，體外抗氧化實驗結(jié)果表明，所提取的滇黃精多糖對DPPH自由基，超氧自由基以及羥基自由基均表現(xiàn)出一定的清除能力，且多糖質(zhì)量濃度和清除能力之間有一定的量效關(guān)系.在多糖質(zhì)量濃度相同時，其對羥基自由基的清除效果最好，達(dá)87.3%，而對DPPH自由基的清除能力較弱，為43.8%.抗氧化性研究結(jié)果與已有報道的研究結(jié)果[15,17]存在一定差異，可能原因是滇黃精產(chǎn)地、種類以及提取工藝的不同，這對于以后研究滇黃精的品種和產(chǎn)地、滇黃精多糖提取工藝、抗氧化性以及它們之間的關(guān)系提供一定的參考.