危重新生兒遺傳性疾病快速全基因組測序專家共識

危重新生兒遺傳性疾病快速全基因組測序專家共識工作組

危重癥患兒是遺傳性疾病(遺傳病)的高發(fā)人群，遺傳因素導致的臟器功能衰竭是危重癥患兒死亡的重要原因之一[1-3]。遺傳病的臨床表現(xiàn)在疾病早期往往不典型，尤其在NICU的新生兒中可能尚未完全顯現(xiàn)。危重癥狀態(tài)下的患兒遺傳病表型還可能被其他臨床癥狀所掩蓋，給病因的診斷帶來困難[4, 5]。在明確診斷的過程中，這些患兒通常需要完成多種常規(guī)檢測，重復采集血樣，進行各種輔助檢查，甚至實施侵入性操作，這不僅給患兒帶來較多痛苦，也使家庭承受了很大的經(jīng)濟負擔[6]。但即使是完成了上述各種檢查，可能還是難以找到真正的致病原因。部分疾病的臨床進展十分迅速，如果不能早期明確診斷，及時采取針對性的治療措施，可能有致死、致殘等嚴重后果。

隨著分子診斷技術的發(fā)展，基因檢測在遺傳病的診斷中發(fā)揮越來越重要的作用[7-10]。在危重癥患兒中應用現(xiàn)有的基因診斷技術，建立快速診斷流程，及時明確病因，可以為這些患兒爭取關鍵的治療時間窗，改變治療決策，提供預后判斷，影響臨床轉歸，避免嚴重不良結局的發(fā)生，對患兒的診治具有非常重要的現(xiàn)實意義[11]。

全基因組測序是目前檢測范圍最廣的分子基因檢測技術，針對生物體完整的基因組序列進行測序，涵蓋基因組編碼區(qū)和非編碼區(qū)，能同步檢測多種變異類型[12, 13]，由于沒有捕獲建庫過程，整體實驗流程較其他需要捕獲建庫的高通量測序實驗更短，可以滿足疑難危重癥患兒需要快速診斷的需求，是非常有應用前景的技術。本共識就快速全基因組測序(WGS)在危重癥新生兒群體中的應用作如下建議。

1 適用人群

存在下列危重癥表現(xiàn)的新生兒：(1)呼吸、循環(huán)系統(tǒng)，①新生兒持續(xù)性肺動脈高壓，②心肌病，③影響血流動力學的心律失常，④經(jīng)過機械通氣等常規(guī)治療仍難以糾正的嚴重低氧血癥；(2)神經(jīng)系統(tǒng)：①臨床病因不能解釋的新生兒腦病，②頻繁發(fā)作的新生兒驚厥，③不明原因的松軟兒；(3)內(nèi)環(huán)境及代謝相關：①難以糾正的代謝性酸中毒，②嚴重高氨血癥，③嚴重的電解質紊亂，④進展性肝功能損傷、肝功能衰竭，⑤進展性腎功能損傷、腎功能衰竭；(4)免疫及血液相關：①膿毒癥，②嚴重凝血功能障礙，③嚴重血小板減少，④噬血細胞綜合征；(5)其他危及生命的畸形和癥狀。

2 不適用人群

①高度懷疑某種單基因疾病或染色體病，②存在假基因，對序列比對造成干擾；③遺傳病因已明確的患兒；④家屬拒絕進行檢測或無法采集家系樣本；⑤采血樣前有輸血史。

3 倫理和知情同意

快速WGS技術在臨床實施的過程中必須遵循醫(yī)學倫理學的基本原則[14-17]：包括但不限于尊重自主原則、有利原則、不傷害原則和公正原則。 需要強調(diào)的是，臨床醫(yī)生應嚴格把控適用人群，避免非必要或非危重癥新生兒占用快速WGS檢測的醫(yī)療資源。知情同意書的內(nèi)容建議包括如下幾方面：檢測的目的和意義；檢測的適應證和局限性；采集樣本類型和檢測方法；可能存在的風險；替代性診斷方法；患兒及其家人的信息和隱私保護；在數(shù)據(jù)分析中可能出現(xiàn)的二次發(fā)現(xiàn)結果。

4 實施流程

快速WGS測序應用于危重癥新生兒病因診斷的關鍵點在于，能在最短時間內(nèi)得到檢測結果，為臨床決策提供依據(jù)。因此在整個檢測實施流程中需要臨床和實驗室相互配合，做到無縫對接。臨床和實驗室均需建立快速WGS檢測的綠色通道，對于適用的新生兒病例提供不同于常規(guī)樣本處理的快速流程(圖1)。建議組建一支由新生兒、重癥醫(yī)學、分子醫(yī)學、生物信息學和影像學等專家組成的快速WGS項目的多學科團隊(MDT)，以定期例會和隨時網(wǎng)絡會議的形式，參與病例的評估、決策和管理。

5 臨床醫(yī)生的作用

5.1 檢測前知情告知 需要向新生兒家長或監(jiān)護人充分告知檢測的必要性，實施檢測的益處，預期的檢測結果及可能存在的其他發(fā)現(xiàn)，得到新生兒家長或監(jiān)護人的理解和認可，并簽署知情同意書。

5.2 采集臨床信息 詳細的病史信息，完善體格檢查，記錄特征性的臨床表型。

圖1 快速WGS臨床和實驗室實施流程

5.3 檢測后遺傳咨詢 根據(jù)快速WGS的檢測結果，包括致病變異/可疑致病變異、臨床意義未明變異、其他發(fā)現(xiàn)等，向新生兒家長或監(jiān)護人進行結果的解釋。

5.4 參加快速WGS項目MDT討論。

6 樣本采集

6.1 外周血樣本 ①新生兒及其生物學的父母；②無菌注射器采集靜脈血1～2 mL，放置于EDTA抗凝管(紫色蓋子)中,不能使用肝素抗凝管；③標本即刻送達實驗室。

6.2 組織樣本 將厚度<0.5 cm的新鮮樣品 (如果厚度>0.5 cm，先切薄) 浸入5～10 倍體積的 RNAlater中。將浸泡有樣品的 RNAlater 置于室溫下保存。

6.3 樣本采集后處理 臨床醫(yī)生應立即通知實驗室樣本管理組成員，做好樣本接收和實驗準備，由醫(yī)院運送中心專人將血樣或組織樣本盡快送達實驗室。

7 分子生物學實驗室

7.1 實驗室資質 為確保第一時間啟動檢測，避免因多方人員接觸檢測所增加的管控難度，建議將整個測序實驗流程部署在醫(yī)院。檢測醫(yī)院應是經(jīng)國家衛(wèi)計委審核通過的高通量測序試點單位或三級以上綜合性醫(yī)院，擁有獨立的基因檢測實驗室，有開展WGS和數(shù)據(jù)分析的能力。

7.2 場地 實驗室功能區(qū)域劃分可參考國家衛(wèi)計委臨檢中心針對遺傳病檢測高通量測序實驗室各功能區(qū)基本分區(qū)的原則，結合醫(yī)院現(xiàn)有實驗場地，在保證有效通風、工作有序開展、防止交叉污染的前提下，因地制宜地進行設計。

7.3 人員 開展快速WGS檢測的實驗室，應組建一個檢測專項團隊并做好應對方案，保證每例樣本到達實驗室后能得到及時處理，在第一時間將檢測結果報告臨床。

檢測專項團隊成員應包括：項目負責人、實驗室技術員、生物信息分析員、報告解讀員和遺傳咨詢醫(yī)生等。

項目負責人：具有醫(yī)學遺傳學或分子生物學知識背景，全面負責整個快速WGS實驗流程實施和質量控制。

實驗室技術員：從事基因測序工作3年以上，熟練掌握高通量測序實驗技術操作流程，具備臨床檢驗資格證書，PCR上崗證。

生物信息分析員：生物信息學或計算機專業(yè)，外顯子組數(shù)據(jù)分析3年以上從業(yè)經(jīng)驗，熟練使用至少1種主流編程語言，熟悉基因組學數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)結構并能熟練處理必要信息。

變異評級和解讀員：醫(yī)學、遺傳或生物學背景，高通量測序數(shù)據(jù)分析2年以上經(jīng)驗，具有較強英文文獻閱讀和綜述能力，熟悉遺傳病常用數(shù)據(jù)庫，能對變異位點進行正確評級和解讀。 包括但不限于以下工作：①結合患兒的HPO、基因變異類型、遺傳模式，家系共分離情況和文獻記錄等，篩選候選變異位點；②位點解讀中，對深度內(nèi)含子區(qū)、新發(fā)剪切位置、基因調(diào)控區(qū)域變異的分析和解讀需要慎重；③基因變異命名依據(jù)人類基因組變異協(xié)會(HGVS)制定的命名規(guī)則，變異評級基本原則參考美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)在2015 年制定的“序列變異解讀標準和指南”[18]；④分析發(fā)現(xiàn)P/LP變異后，實驗室應第一時間將檢測結果口頭報告給臨床咨詢醫(yī)生。

8 基因檢測數(shù)據(jù)分析

快速WGS檢測實驗應就近開展，以便第一時間展開數(shù)據(jù)分析；若需遠程傳輸測序數(shù)據(jù)，至少要保證100 Mb·s-1的下載速度。

測序讀段拼接和變異位點識別，每例樣本應控制在1 h內(nèi)完成。需要240個以上CPU核心并行計算，或是運用FPGA芯片加速。

變異分析應包含針對單核苷酸變異、插入缺失和拷貝數(shù)變異的分析。針對染色體結構、線粒體基因、宏基因組等變異的分析可視情況開展。

臨床表型的收集和整理應符合標準規(guī)范，如ICD條目和人類表型標準術語(HPO)等。

報告解讀和咨詢，變異分析和解讀需要由具有遺傳咨詢醫(yī)師資質或具備遺傳咨詢能力的醫(yī)生完成，該醫(yī)生需要熟練掌握常見遺傳病的發(fā)病機制、遺傳模式、臨床表現(xiàn)，能對家系遺傳病再發(fā)風險進行計算和評估，并給出臨床指導意見。發(fā)動MDT專家討論，制定臨床決策。

9 臨床隨訪

利用遺傳咨詢和MDT聯(lián)合門診，對已完成檢測的新生兒進行隨訪，建議設立線上專家?guī)?，共同參與MDT會診，結合基因檢測報告和臨床診斷，對新生兒行進一步臨床評估。

對于診斷明確的患兒，在給予針對性治療的基礎上，做好療效評估和轉歸隨訪，對新生兒家系成員開展遺傳咨詢和再生育風險評估，必要時提供產(chǎn)前診斷建議。

對于尚未明確診斷的病例，制訂隨訪計劃，及時更新表型，在疾病數(shù)據(jù)庫更新的基礎上，定期對檢測數(shù)據(jù)再分析，當隨訪新生兒出現(xiàn)新的有意義的臨床表型時，也可以由臨床醫(yī)生即時申請數(shù)據(jù)再分析。

在整個快速檢測實施的過程中，需要臨床和實驗室各司其職，密切配合，不斷優(yōu)化改進流程，以期達到最優(yōu)的檢測效果。

10 優(yōu)勢及局限性

存在的問題和局限性：①檢測成本相對較高，因此納入檢測的新生兒病例需要有選擇性。未來隨著測序成本的進一步下降，WGS測序在臨床診斷中的應用有望進一步拓展。②數(shù)據(jù)量大，生物信息分析和臨床解讀是關鍵，WGS不僅能檢測到大量基因組編碼區(qū)的變異，同時能檢測到基因組深度內(nèi)含子區(qū)、調(diào)控區(qū)的各種變異，對于上述變異的解釋需要慎重。③染色體結構變異檢測等結構分析依然存在難點，且缺乏有效的驗證手段。部分染色體特殊結構區(qū)，如三堿基重復序列、假基因干擾序列等，之前認為短讀長為主的WGS測序對上述類型變異檢測能力有限。但是隨著技術的發(fā)展、讀長的增加以及算法的優(yōu)化，WGS測序對于這些特殊結構區(qū)域的檢測能力也在不斷提升。④WGS測序深度通常在30～60 bp，對于基因組中存在的嵌合突變不能進行有效檢測。

目前臨床常用的分子檢測技術都有其各自的針對性：①基因芯片僅能對微缺失、微重復這類不平衡的基因組拷貝數(shù)異常進行檢測，但對平衡性的染色體重排、基因內(nèi)點突變檢測能力有限; ②基因包(Panel)為基礎的二代測序技術，可以檢測探針設計范圍內(nèi)的基因變異，但檢測的基因數(shù)目相對較少; ③全外顯子組測序(WES)雖然檢測范圍更廣，但只針對基因組編碼區(qū)變異進行檢測，對非編碼區(qū)及其他拷貝數(shù)異?；蚧蚪M結構異常檢測能力有限，而且因為存在建庫捕獲過程，檢測的周期相對較長，難以滿足臨床對于危重癥患兒全面、快速基因診斷的需求。

快速WGS的優(yōu)勢：①沒有對目標序列捕獲建庫過程，耗時較WES和基因Panel更短，在危重癥新生兒遺傳病病因檢測中能發(fā)揮更大的作用; ②檢測范圍最廣, 對全基因組進行測序，能涵蓋基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)的變異；③可以檢測多種變異類型,包括單核苷酸變異、基因組拷貝數(shù)變異和染色體結構變異等；④可以對線粒體基因組變異進行分析，能診斷部分線粒體基因組突變導致的疾??；⑤可以進行宏基因組分析，對于合并重癥感染的新生兒，在進行分子病因檢測的同時，亦能對病原微生物進行同步分析，為臨床合理使用抗生素提供重要依據(jù)。

危重新生兒遺傳性疾病快速全基因組測序專家共識工作組(按姓氏筆畫排序)韋秋芬(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院)，史源 (重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院)，莊德義(復旦大學附屬廈門兒童醫(yī)院)，李龍(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院)，李紅(江西省兒童醫(yī)院)，吳冰冰(復旦大學附屬兒科醫(yī)院)，湯澤中(北京大學第一醫(yī)院)，陳麗萍(江西省兒童醫(yī)院)，周偉(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心)，周文浩 (復旦大學附屬兒科醫(yī)院)，楊琳(復旦大學附屬兒科醫(yī)院)，康文清(河南省兒童醫(yī)院)，黑明燕(首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院)