一種太子參環(huán)肽單體的分離制備及結(jié)構(gòu)表征

賀瀟宇 趙 立 魏 丹 蔣靜怡 龐文生 胡 娟,2*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003

環(huán)肽(Cyclic Peptide)是指氨基酸以肽鍵的形式連接形成的環(huán)狀化合物[1]。研究結(jié)果表明環(huán)肽類化合物僅存在于一些高等植物體內(nèi)存在，這些環(huán)肽結(jié)構(gòu)新奇多樣，骨架中除了肽鍵外還有酯鍵、醚鍵、二硫鍵等，很多環(huán)肽具有良好的生物活性，如抗菌、抗腫瘤和免疫抑制等活性[2]。環(huán)肽能夠形成穩(wěn)定的限制性空間構(gòu)象，而且其在生物體內(nèi)抗降解的能力也強(qiáng)于線性多肽。奇特的結(jié)構(gòu)和豐富的活性使天然活性環(huán)肽成為化學(xué)家和藥學(xué)家研究的熱點。

太子參，系石竹科孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根[3]，其含有多種生物活性成分，如多糖類、環(huán)肽類、微量元素、皂苷類、揮發(fā)油類、油脂類、氨基酸類、脂肪酸類等[4]。目前已報道的太子參環(huán)肽有16種，有環(huán)八肽、環(huán)七肽、環(huán)五肽等數(shù)種大小不同的環(huán)肽[5]。本課題組建立了一種太子參環(huán)肽提取物(CPE)的制備方法，并且研究了環(huán)肽提取物抗慢性阻塞性肺病(COPD)，結(jié)果表明CPE給藥組大鼠肺氣道阻力急劇下降，動態(tài)肺順應(yīng)性升高。肺組織切片圖像分析顯示，CPE可減輕肺泡破壞程度，減輕肺組織炎癥，增加肺泡間隙，改善COPD大鼠肺通氣功能，這可能與其抑制TLR4-MyD88-JNK/p38通路異常激活有關(guān)[6-7]。李軍等[8]發(fā)現(xiàn)太子參環(huán)肽HB具有酪氨酸酶抑制活性，可以用于色素沉積引起的皮膚病。

本實驗利用柱層析、制備級高效液相色譜等技術(shù)，分離純化得到一種太子參環(huán)肽單體，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，確定了該環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為太子參環(huán)肽單體的分離制備提供了一種方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備 Shimazu LC-8A 型制備液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-500DV型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；600Y型多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)；AE240s型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；DW-86L728J超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán))；MODULYOD-230真空冷凍干燥機(jī)(美國Thermo公司)；R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；GZY-P2D-W型超純水機(jī)(湖南科爾頓水務(wù)有限公司)；Bruker Esquire 2000 MS(德國布魯克公司)；Bruker AV400 NMR(德國布魯克公司)。玻璃器皿均購于天津玻璃儀器廠。

1.2 實驗材料 太子參[Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.]，購于福建柘榮。甲醇(色譜純，德國默克公司)，無水乙醇(AR，西隴化工股份有限公司)、乙酸乙酯(AR，西隴化工股份有限公司)、石油醚(AR，西隴化工股份有限公司)、環(huán)己烷(AR，西隴化工股份有限公司)、硅膠(100～200目，北京索萊寶科技有限公司)、硅膠(200～300目，北京索萊寶科技有限公司)、實驗用水為電阻率為18.2 MΩ的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 太子參環(huán)肽的柱層析分離 稱取干燥太子參200 g(粉碎過3號篩)，按料液比1∶8加入85%乙醇回流提取2 h，減壓濃縮得乙醇浸膏。乙醇浸膏加水溶解，按體積比1∶1加入石油醚萃取3次，棄去水層，合并石油醚層。減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預(yù)凍2 h，冷凍干燥；得石油醚萃取部位。

取石油醚萃取部位100 g，等量硅膠拌樣后，600 g 硅膠(100～200目)裝柱，濕法上樣，以石油醚、乙酸乙酯(體積比50∶1→1∶1)系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度至少洗5個柱體積，每300 mL為一個餾分，經(jīng)薄層色譜法定性檢驗，收集可能為環(huán)肽的餾分。得粗分片段，減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預(yù)凍2 h，冷凍干燥，得粗分物粉末。

取粗分物35 g，50 g硅膠拌樣，300 g硅膠(200～300目)裝柱，經(jīng)環(huán)己烷、乙酸乙酯(體積比100∶0→20∶1→10∶0→8∶1→5∶1)系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度至少洗5個柱體積，每300 mL為一個餾分,經(jīng)薄層色譜法定性檢驗，收集可能為環(huán)肽的餾分。

2.2 太子參環(huán)肽單體的純化 所得餾分采用制備級HPLC純化。色譜柱為SinoChrom ODS-BP Cl8(250 mm×10 mm，5 μm)；流速5 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量1 mL。已甲醇(A)：水(B)=65∶35為流動相；檢測波長203 nm。收集環(huán)肽單體峰，減壓濃縮，濃縮液置于超低溫冰箱-80 ℃預(yù)凍2 h，冷凍干燥，得到淡黃色粉末。

所收集環(huán)肽組分峰HPLC測定純度。采用大連依利特Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流速1mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；以乙腈(A)：水(B)=10∶90為流動相，檢測波長203 nm。

2.3 太子參環(huán)肽結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 MS結(jié)構(gòu)表征 Bruker Esquire 2000 質(zhì)譜儀進(jìn)樣條件：離子源：ESI；離子模式：陽離子模式；正負(fù)離子切換：關(guān)閉；掃描模式：標(biāo)準(zhǔn)/正常；質(zhì)量范圍50～2200 m/z；毛細(xì)出口電壓：116.7 V；透鏡：40.8 V；阱驅(qū)動參數(shù)：30.1；采集時間：2992 μs。

2.3.2 NMR結(jié)構(gòu)表征 取所得淡環(huán)肽10 mg，溶于0.6 mL氘代DMSO中，轉(zhuǎn)移至直徑為5 mm的核磁管中，使用四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)，恒溫25 ℃，由Bruker AV400 NMR測定其1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY及HMBC譜圖。

2.4 結(jié)果

2.4.1 太子參環(huán)肽HPLC純度測定 所得太子參環(huán)肽單體純度按照面積歸一化法測定為95.16%，HPLC色譜圖如圖1所示，峰面積見表1。

表1 太子參環(huán)肽HPLC色譜數(shù)據(jù)

1.雜質(zhì)峰;2.環(huán)肽峰

2.4.2 MS譜圖及結(jié)構(gòu)解析 由圖2A可知，正離子模式的分子離子峰為m/z=502.2的[M+H]+峰；m/z=524.2的[M+Na]+峰;由圖2 B可知，負(fù)離子模式下的分子離子峰為m/z=500的[M-H]-提示該環(huán)肽分子量為501.26。且正離子模式下有m/z=540.1的[M+K]+峰；m/z=474.3的[M-CO]+峰，分子量為單數(shù),提示化合物含有奇數(shù)氮原子。表2為環(huán)肽正負(fù)離子模式下的離子峰質(zhì)荷比。

表2 環(huán)肽正負(fù)離子模式下的離子峰質(zhì)荷比

A.正離子模式下的環(huán)肽質(zhì)譜圖；B.負(fù)離子模式下環(huán)肽質(zhì)譜圖

2.4.3 NMR譜圖及結(jié)構(gòu)解析 由表3可知，1H-NMR、13C-NMR譜圖中C原子、H原子的化學(xué)位值，并給出了基于HMBC、1H-1H COSY的C-H，H-H耦合關(guān)系。

表3 核磁共振波譜C、H化學(xué)位移及耦合關(guān)系歸屬

由圖3A1H-NMR(400MHz,in DMSO)可知：高場區(qū)δ 1.25、0.77、0.95為3個甲基氫；低場區(qū)δ 8.50、7.95、7.85、7.23為氨基氫信號；δ6.63、6.93兩組氫信號，為同一個苯環(huán)上的4個氫信號。由圖3 B13C-NMR(400MHz,in DMSO)：該化合物含有25個碳原子，低場區(qū)有5個羰基碳信號，還有1個芳香連氧碳信號，5個芳香碳信號，且氫譜數(shù)據(jù)中有對稱的芳香氫信號，提示此化合物連有1個4-羥基苯。

A.1H-NMR；B.13C-NMR

由圖4 A1H-1H COSY譜圖可以判斷出質(zhì)子間的2鍵、3鍵耦合關(guān)系；由圖4 B HMBC譜圖可以判斷出碳原子與質(zhì)子的2鍵、3鍵耦合關(guān)系，綜合二維譜圖推測出環(huán)肽可能含有的片段如圖5所示。

A.1H-1H COSY；B.HMBC

圖5 HMBC、1H-1H COSY推測可能含有的片段

綜合以上NMR譜圖并結(jié)合MS信息確定環(huán)肽化學(xué)結(jié)構(gòu)，其分子式為C25H35N5O6，并給按照表2中的原子編號順序給出了NMR信號歸屬，如圖6所示。

圖6 環(huán)肽化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 討論

實驗前期對太子參的提取條件進(jìn)行了考察，以指紋圖譜作為評價指標(biāo)，確定了以85%乙醇作為提取溶劑，料液比(g/mL)為1∶8，回流提取2 h。柱層析采用濕法裝柱，先在層析柱中加入少量洗脫劑，然后將洗脫劑浸泡的硅膠攪拌成勻漿后倒入層析柱中，用玻璃棒輕輕敲打柱兩側(cè)，待硅膠層沉積后，加壓，趕走柱內(nèi)殘留的小氣泡，最后用真空泵將填料抽實。

太子參環(huán)肽作為太子參的特色活性成分，具有多種藥理活性，但由于含量較低，分離制備具有一定的難度，限制了太子參環(huán)肽的應(yīng)用。目前，已經(jīng)有較多的研究人員從指紋圖譜的角度對太子參環(huán)肽進(jìn)行了研究，但這些研究的重點均在于應(yīng)用GC-MS、LC-MS對指紋圖譜中的色譜峰進(jìn)行鑒定。并沒有解決目前太子參環(huán)肽單體分離制備方法不足的問題。

4 結(jié)論

通過柱層析技術(shù)分離獲得環(huán)肽粗分物，經(jīng)制備級HPLC純化獲得環(huán)肽單體，對其進(jìn)行MS、NMR結(jié)構(gòu)表征，并結(jié)合參考文獻(xiàn)[9-10]確定其為環(huán)肽化合物Pseudostellarin A(PA)。2 kg太子參藥材提取得環(huán)肽PA約65 mg，提取率(PA/藥材)為32.5 μg/g，所得環(huán)肽PA純度為95.16%。

本實驗建立了一種太子參環(huán)肽PA的分離純化方法，通過柱層析初步分離獲得環(huán)肽粗分物，再經(jīng)過制備級HPLC純化獲得純度較高的PA單體，并運用現(xiàn)代波譜分析技術(shù)確定了環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)太子參環(huán)肽PA藥理活性研究提供了一定的基礎(chǔ)。