益陰通絡(luò)膠囊對缺血性腦卒中大鼠腦組織病理改變及神經(jīng)保護(hù)作用的研究*

劉 溪，張 慧，馮思娜，李笑雨

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(咸陽712046)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽712021)

缺血性腦卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)是一種以高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率為特征的腦血管疾病，在臨床中占中風(fēng)發(fā)病總數(shù)的60%～80%[1-2]，中風(fēng)是僅次于缺血性心臟病的第二大死因，占全世界死亡人數(shù)的9%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)，全世界每年有1500萬人患中風(fēng)。其中有600多萬人死亡，另有500萬人永久致殘，嚴(yán)重危害人類生命和健康[1]。因此，探索CIS的新治療方法，促進(jìn)CIS患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，降低殘廢率、改善預(yù)后，具有重要意義。益陰通絡(luò)膠囊是陜西省名老中醫(yī)楊秀清教授用于治療缺血性腦卒中的經(jīng)驗(yàn)方，現(xiàn)已開發(fā)為陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑使用。本方具有滋補(bǔ)肝腎，化痰開竅，活血通絡(luò)功效，臨床上主要用于治療中風(fēng)病所致肢體癱瘓、麻木、無力、頭暈耳鳴、語言不利、煩躁不眠、面紅口干，舌紅苔少等癥。本實(shí)驗(yàn)擬通過對缺血性腦卒中大鼠血清中一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、大鼠腦勻漿中Na+-K+-ATP酶活性及缺血性腦卒中后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀、腦組織病理改變的實(shí)驗(yàn)研究來探討益陰通絡(luò)膠囊保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用機(jī)制及治療缺血性腦血管病的作用機(jī)理，為益陰通絡(luò)膠囊作為治療缺血性腦血管病的有效中藥復(fù)方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SD大鼠90只，平均體重(280±30)g，雌雄各半。由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證書號：SCXK(陜)2007-001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑：益陰通絡(luò)膠囊，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供，按每克含生藥3.6 g標(biāo)準(zhǔn)制備，批號:20080104。血塞通片(云南省玉溪市維和制藥有限公司生產(chǎn)，批號:20080206)。NOS試劑盒、SOD試劑盒、Na+-K+-ATP酶試劑盒、考馬斯亮蘭測定試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。注射用青霉素鈉粉針劑(國藥準(zhǔn)字23021439，瑞陽制藥有限公司)；10%水合氯醛溶液(由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：LD4-2型低速離心機(jī)、OLYMpUS CX31型電子顯微鏡、723分光光度計(jì)、FJ-2103γ免疫計(jì)數(shù)儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腦缺血大鼠模型制備：線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型是常用的缺血性腦卒中動物模型。造模方法參照文獻(xiàn)[2],具體操作如下：大鼠術(shù)前禁食一夜后，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠并固定于手術(shù)臺上，頸部去毛，碘伏消毒，頸部前正中線切開皮膚，沿右側(cè)胸鎖乳突肌后氣管旁鈍性分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端，并在靠近頸總動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)心端，并在距離頸總動脈分叉處3 mm處的頸動脈上剪開一小口，將一根頭端處理過的0.33 mm直徑的尼龍線從小口中插入，緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進(jìn)，尼龍線的插入深度距離頸總動脈分叉處約(18.0±0.5) mm左右時(shí)感到阻力，缺血后1 h拔掉線栓，縫合頸部傷口。腹腔注射青霉素4萬U/d，預(yù)防術(shù)后感染，連用 3 d。假手術(shù)組不插入線栓，不閉塞MCA，其他操作同模型組。

2.2 分組及給藥：空白組及假手術(shù)組各8只；造模后24 h參考Bederson評分法[3]對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。死亡及評分小于2分的大鼠剔除，采用隨機(jī)分組法將造模成功并符合入選標(biāo)準(zhǔn)的40只大鼠(90只大鼠中10只進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，手術(shù)期間及術(shù)后死亡19只，模型未成功5只)分為模型組、血塞通陽性對照組(0.03 g/kg)、益陰通絡(luò)膠囊小、中、大(0.21 g/kg、0.42 g/kg、0.84 g/kg)劑量組，每組8只，按1 ml/100g灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d?？瞻捉M不給予任何處理，假手術(shù)組及模型組灌胃生理鹽水。給藥7 d后進(jìn)行指標(biāo)檢測。

2.3 神經(jīng)功能缺損評分：在術(shù)后24 h及治療后第8天,參照Bederson 6級5分法[3]對大鼠神經(jīng)功能評分。正常為5級(0分)；不能完全伸展對側(cè)上肢為4級(1分)；向麻痹側(cè)的側(cè)向推力的抵抗力降低為3級(2分)；提尾時(shí)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈為2級(3分)；自動轉(zhuǎn)圈為1級(4分)；無自發(fā)性活動、意識喪失為0級(5分)。

2.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測：灌胃結(jié)束，以10%水合氯醛大鼠腹腔注射麻醉后心臟取血，室溫靜置5 min后，3000 r/min離心15 min，取血清，NOS活性測定采用NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成NO,NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物,比色測定OD值。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。按SOD測定試劑盒說明書進(jìn)行檢測，蛋白含量用考馬斯亮蘭法測定。取血后大鼠斷頭取腦，左右腦分開，左半腦用于制備腦勻漿。采用Na+-K+-ATP酶測定試劑盒，分別取2%腦組織勻漿1 ml(10%的組織勻漿0.2 ml加0.8 ml生理鹽水稀釋)3000～4000 r/min，離心10 min，取上清液200 μl定磷。然后再用漩渦混勻器混勻，37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，在660 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零比色測出吸光度。按公式計(jì)算Na+-K+-ATP酶活性。

2.5 腦組織病理學(xué)檢查：取血后各組大鼠開顱取腦，將右側(cè)腦組織放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24 h，4 ℃冰箱保存。切取視交叉后0.5 mm處至小腦前的腦組織，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)漂洗，乙醇脫水，二甲苯透明后，浸蠟包埋，切片，片厚5 μm，HE染色并在10×40光倍鏡下觀察各組大鼠腦組織的病理改變。具體包括：神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞樹突、軸突、尼氏體的病理改變。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠行為學(xué)觀察 空白組、假手術(shù)組大鼠均無神經(jīng)功能缺損癥狀。其他各組大鼠均有典型神經(jīng)功能缺損癥狀，得分多在2～4分之間，大鼠整體上表現(xiàn)活動不自如、精神萎靡、反應(yīng)遲緩、毛色泛黃、缺乏光澤，進(jìn)食與飲水量明顯減少。

2 大鼠神經(jīng)功能缺損分級比較 治療期間，空白組及假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損癥狀，整體精神狀態(tài)良好，活動自如，毛色白有光澤，飲水進(jìn)食無異常，符合預(yù)期。模型組大鼠在造模后神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，得分在2～4分，精神不振，活動少且遲鈍，毛色偏黃無光澤，毛松散蓬亂，飲水進(jìn)食較少，與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明模型復(fù)制成功。各組大鼠7 d后精神狀態(tài)良好，進(jìn)食飲水正常，毛色光亮，神經(jīng)功能缺損癥狀明顯減輕，得分多在0～1分。與模型組比較，益陰通絡(luò)膠囊小、中、大劑量組及血塞通陽性對照組神經(jīng)功能缺損5級比例均高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。益陰通絡(luò)膠囊大、中劑量組神經(jīng)缺損評級中5級比例高于血塞通陽性對照組及益陰通絡(luò)膠囊小劑量組。從大鼠行為學(xué)觀察比較，可以看出益陰通絡(luò)膠囊對神經(jīng)功能缺損癥狀有改善作用，以益陰通絡(luò)膠囊大、中劑量組的5級比例較高。見表1。

表1 各組大鼠治療后神經(jīng)功能缺損分級比較(只)

3 大鼠血清NOS測定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組血清NOS活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明模型復(fù)制成功。益陰通絡(luò)膠囊小、中、大劑量組及血塞通陽性對照組NOS活性較模型組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示益陰通絡(luò)膠囊小、中、大劑量及血塞通均具有升高大鼠血清NOS活性的作用。益陰通絡(luò)膠囊中、大劑量組升高NOS活性優(yōu)于血塞通陽性對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與益陰通絡(luò)膠囊小劑量組相比較，大、中劑量組中NOS活性升高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示益陰通絡(luò)膠囊大、中劑量對腦缺血損傷治療作用優(yōu)于血塞通及益陰通絡(luò)小劑量。見表2。

4 大鼠血清中SOD活性檢測結(jié)果 模型組與假手術(shù)組比較，模型組血清中SOD活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，益陰通絡(luò)膠囊小、中、大劑量組及血塞通陽性對照組SOD活性均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。益陰通絡(luò)膠囊中、大劑量組與血塞通陽性對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與益陰通絡(luò)膠囊小劑量組比較，益陰通絡(luò)膠囊中、大劑量組中SOD活性更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明益陰通絡(luò)膠囊中、大劑量均能改善腦缺血所引起的病理生理改變，且優(yōu)于益陰通絡(luò)膠囊小劑量與血塞通。見表3。

表2 各組大鼠血清NOS 活性比較(μmol/L)

表3 各組大鼠血清中SOD活性比較(μmol/L)

5 大鼠腦組織勻漿Na+-K+-ATP酶活性測定情況 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中Na+-K+-ATP酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明模型復(fù)制成功。與模型組比較，益陰通絡(luò)膠囊小、中、大劑量組及血塞通陽性對照組Na+-K+-ATP酶活性均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與血塞通陽性對照組相比，益陰通絡(luò)膠囊大、中劑量組Na+-K+-ATP酶活性升高更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與益陰通絡(luò)膠囊小劑量組相比較，益陰通絡(luò)膠囊大、中劑量組Na+-K+-ATP酶活性升高明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明益陰通絡(luò)膠囊大、中劑量均對腦缺血損傷的有治療作用，優(yōu)于血塞通及益陰通絡(luò)膠囊小劑量。見表4。

表4 各組大鼠腦組織勻漿Na+-K+-ATP酶活性比較[μmolpi/(mgprot·hour)]

6 各組大鼠腦缺血病理學(xué)改變 比較各組大鼠腦缺血病理學(xué)改變，模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的腦缺血病理改變，如神經(jīng)細(xì)胞水腫、壞死、尼氏體變淡、間質(zhì)充血、神經(jīng)細(xì)胞軸、樹突減少；而血塞通陽性對照組、益陰通絡(luò)膠囊小、中、大劑量組均比模型組改變輕(圖1)。

A：空白組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：血塞通陽性對照組；E：益陰通絡(luò)膠囊小劑量組；F：益陰通絡(luò)膠囊中劑量組；G：益陰通絡(luò)膠囊大劑量組

討 論

中風(fēng)已成為對人們不可避免的問題，并給受害者的家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[4]。中藥可通過多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，包括神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗凋亡、抗氧化、血管保護(hù)劑、記憶促進(jìn)劑、功能改善劑、毒素抑制劑等，并發(fā)掘出一系列藥物，如銀杏葉提取物[5]、三七[6]、綠茶提取物[7]、川芎[8]等，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)許多單一提取的中藥成分往往在動物實(shí)驗(yàn)中有效，而在臨床治療時(shí)面臨療效不佳或治療面較窄等問題。中藥的復(fù)方制劑在辨證的基礎(chǔ)上隨證加減，靈活組方，且長時(shí)間使用副作用較小[9]。本研究通過對益陰通絡(luò)膠囊缺血性腦卒中大鼠血清NOS、SOD、腦勻漿Na+-K+-ATP酶活性及神經(jīng)功能缺損評分、腦組織病理改變進(jìn)行的研究，為臨床有效用藥提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，益陰通絡(luò)膠囊能改善腦缺血后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀、能有效地升高大鼠腦缺血后血清NOS 活性、SOD活性、腦組織中Na+-K+-ATP酶活性，達(dá)到減輕腦缺血損傷的作用。益陰通絡(luò)膠囊能減輕神經(jīng)元的缺血性損傷程度，從病理證實(shí)該方對缺血再灌注后腦損傷治療作用。

NOS是一氧化氮合成的限速酶，是調(diào)節(jié)NO含量的最重要環(huán)節(jié)[10]。NO是一種血管擴(kuò)張劑，具有抗平滑肌細(xì)胞活性，保護(hù)內(nèi)皮，抑制血小板粘附、聚集、白細(xì)胞粘附和趨化并具有其他抗炎特性。此外，它是一種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑,參與腦血流的自動和化學(xué)調(diào)節(jié)[11]。SOD是體內(nèi)最有效的氧自由基清除劑，它可以使CRI后產(chǎn)生的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶變?yōu)樗?，以減輕組織損傷。組織內(nèi)SOD活性的高低可反映機(jī)體清除自由基的能力，與體內(nèi)自由基總體水平呈負(fù)相關(guān)[12]。Na+-K+-ATP酶活動是大腦正常神經(jīng)元功能的重要組成部分。研究表明Na+-K+-ATP酶可能是對抗興奮性毒性的重要靶標(biāo)，Na+-K+-ATP酶可以控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放，并防止在興奮性毒性應(yīng)激中Ca2+超載和神經(jīng)元凋亡[13]。

益陰通絡(luò)膠囊針對肝腎陰虛、瘀阻腦絡(luò)之中風(fēng)而設(shè)。方中生地黃、山茱萸為君，生地黃清熱涼血，補(bǔ)益肝腎，澀精固脫。山茱萸味酸、澀，滋陰益血。五味子、石菖蒲、遠(yuǎn)志、茯苓為臣藥，五味子收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心，既能滋腎以育木，又能與生地、山茱萸相裨益。石菖蒲開竅豁痰健胃。遠(yuǎn)志安神益智，交通心神。茯苓健脾、寧心，能提高機(jī)體免疫力，為中藥四君八珍之一。川芎、雞血藤、水蛭為使藥。《本草匯言》：“川芎，上行頭目，下調(diào)經(jīng)水，中開郁結(jié)……雖入血分，又能祛一切風(fēng)，調(diào)一切氣?！彪u血藤補(bǔ)血活血通絡(luò)。《要藥分劑》中記載水蛭主治為：“入肝、膀胱二經(jīng)”，具有破血、逐瘀之功，有不傷正氣，生新血之說。諸藥合用，共奏滋補(bǔ)肝腎、化痰開竅、活血通絡(luò)之功。血塞通，由三七總皂苷組成，具有活血化瘀、通絡(luò)的作用。可以擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，降低血漿黏度。用于腦脈瘀阻所致的中風(fēng)[14]。該藥用于臨床多年，療效較好。故選用此藥為對照藥。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，益陰通絡(luò)膠囊能提高腦缺血大鼠NOS、SOD、Na+-K+-ATP酶的活性，改善腦缺血后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀及神經(jīng)元等結(jié)構(gòu)的完整性，減輕自由基損傷，阻止腦缺血性神經(jīng)元損傷，促進(jìn)局部微血流，改善微循環(huán)狀態(tài)，保護(hù)損傷腦組織，從而發(fā)揮治療缺血性腦卒中的作用。