桑樹(shù)組織培養(yǎng)研究進(jìn)展及應(yīng)用

王曉紅，韓世玉，羅澤虎，張芳，孫運(yùn)鵬，吳康云

（貴州省農(nóng)科院蠶業(yè)研究所，貴陽(yáng)550006）

桑樹(shù)（Morus alba L.）屬多年生雙子葉木本植物，是重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，其栽培歷史可追溯到公元前2800年。桑葉是最能滿(mǎn)足家蠶正常生理代謝的飼料，是蠶絲業(yè)得以持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，人們?cè)耘嗌?shù)主要目的也是為了采收桑葉用于養(yǎng)蠶。除此之外，桑樹(shù)是一種具有藥用保健價(jià)值的植物，富含多種植物活性成分，廣泛應(yīng)用于中草藥和保健品的開(kāi)發(fā)，其果實(shí)——桑椹富含營(yíng)養(yǎng)與活性成分，而且風(fēng)味獨(dú)特，深受人們喜愛(ài)。

由于桑樹(shù)是異花授粉的木本植物，其基因型高度雜合，給桑樹(shù)育種、資源保護(hù)和生理研究帶來(lái)極大的不便。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以加快植物繁殖速度，結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)用于遺傳育種極大地促進(jìn)了對(duì)植物種質(zhì)資源的研究與利用。桑樹(shù)組織培養(yǎng)研究相對(duì)于其它植物起步較晚，但發(fā)展很快。1968年，日本的大三勝夫[1]首先利用桑樹(shù)冬芽培養(yǎng)再生植株，經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)無(wú)數(shù)學(xué)者不斷的研究，桑樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)快速發(fā)展，取得了很多重要的成果。目前，已經(jīng)建立了桑芽、葉片、子葉、下胚軸、原生質(zhì)體、花藥等組織培養(yǎng)快繁體系，并在桑樹(shù)育種、生理研究等方面有所應(yīng)用，已成為研究桑樹(shù)重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 桑樹(shù)組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

1.1 芽培養(yǎng)

用桑的冬芽、腋芽或頂芽在含有植物激素的MS培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)臏囟群凸庹?，可以獲得植株。70年代以來(lái)日本和我國(guó)相繼建成了冬芽技術(shù)體系。研究發(fā)現(xiàn)，在冬芽的離體培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞分裂素是莖葉生長(zhǎng)的必要條件，其中6-BA的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最強(qiáng)，ZT次之，KT最弱，IAA與GA對(duì)培養(yǎng)冬芽的生長(zhǎng)幾乎無(wú)效，ABA 則起抑制作用[2]。Hossain等[3]用MS+BA 0.5～5.0 mg/L培養(yǎng)基再生出了10年生植株，并發(fā)現(xiàn)腋芽增殖率隨著B(niǎo)A的濃度增加而增加，但超過(guò)2.5 mg/L就會(huì)抑制芽的生長(zhǎng)。當(dāng)BA濃度為1.0 mg/L，外植體的生長(zhǎng)長(zhǎng)度達(dá)到最大；而濃度為2.5 mg/L時(shí)每個(gè)外植體增殖得到的芽的個(gè)數(shù)最多（7.5）。Zaman等[4]將外植體置于MS+6-BA1.0 mg/L+Kin1.0 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)單個(gè)外植體增殖得到的不定芽數(shù)量達(dá)到最大；IAA和IBA對(duì)于冬芽的生長(zhǎng)同樣被證明極為有效。最近，魏佳等[5]以桑樹(shù)帶腋芽的莖段為外植體，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基激素濃度的優(yōu)化，篩選出藥桑的增殖芽繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.10 mg/L，滇桑的增殖芽繼代培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.1 mg/L，川桑的增殖芽繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，印度桑K2的增殖芽繼代培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.05 mg/L。4份桑種質(zhì)資源的無(wú)菌幼苗莖段繼代培養(yǎng)45 d后，產(chǎn)生的增殖芽數(shù)達(dá)到1.6～6.8個(gè)，再生幼苗株高可達(dá)4 cm以上，分別轉(zhuǎn)移至篩選的生根培養(yǎng)基MS+IBA0.5 mg/L或MS+IBA1.0 mg/L中培養(yǎng)。除川桑再生幼苗的生根率（41.7%～45.8%）和移栽成活率（40%～50%）較低外，其他3份桑種質(zhì)資源再生幼苗的生根率均可達(dá)90%以上，移栽成活率為100%。馮蔚等[6]以農(nóng)桑14號(hào)冬芽為外植體，通過(guò)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比，篩選出最適的芽增殖培養(yǎng)基為WPM+NAA0.1 mg/L+6-BA0.6 mg/L，在此條件下，桑樹(shù)冬芽膨大明顯，可略見(jiàn)葉形，有大葉長(zhǎng)出。李鎮(zhèn)剛等[7]在MS+6-BA3.0 mg/L+GA30.5 mg/L的培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)滇桑冬芽萌發(fā)，已萌發(fā)的小芽在MS+6-BA1.0 mg/L+GA30.2 mg/L的培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移到1/2MS+IBA0.5 mg/L培養(yǎng)基能生根成活，初步建立了滇桑的無(wú)性繁殖技術(shù)體系。新疆藥桑的冬芽能夠在MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并在1/2MS+IBA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上能生根成活[8]。

除了激素以外，其他一些重要成分對(duì)芽培養(yǎng)也有很大的影響。Yamanouchi等[9]研究了無(wú)機(jī)氮源對(duì)不定芽形成的影響，將從冬芽中分離出的葉置于不同濃度的銨離子、硝酸鹽金屬離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)氮影響了不定芽的形成、葉片的生長(zhǎng)及形態(tài)。Zaman等[10]將桑樹(shù)的芽置于MS+6-BA1.0 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)，研究不同的氨基酸對(duì)芽增殖的影響，發(fā)現(xiàn)脯氨酸是體外芽的增殖必要的成份，酪氨酸比脯氨酸更加有效，然而谷氨酰胺抑制增殖。另外，還有學(xué)者對(duì)冬芽的培養(yǎng)方式進(jìn)行了研究。Katagiri等[11]從冬芽中取出嫩葉片，將其置于MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)速為150 rpm振蕩培養(yǎng)，然后將外植體轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果表明，使用MS+6-BA 2.0 mg/L+丙氨酸100 mg/L培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)對(duì)于誘導(dǎo)不定芽的效果非常明顯。Tewary等[12]將桑樹(shù)頂芽和腋芽置于 MS+Kin 0.5～2.0 mg/L培養(yǎng)基中120 rpm振蕩培養(yǎng)6周。在前4周當(dāng)中，可見(jiàn)芽的萌發(fā)和延伸，并在接下來(lái)的2周中對(duì)其進(jìn)行生根培養(yǎng)，這種使用一種液體培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)獲得試管苗是一種節(jié)省勞力、成本的方法。

1.2 葉片、子葉、下胚軸培養(yǎng)

對(duì)于桑樹(shù)葉片組織培養(yǎng)的研究已經(jīng)積累了大量經(jīng)驗(yàn)。Bhau等[13]將桑樹(shù)無(wú)菌苗的葉片、莖尖、葉柄外植體在MS+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，試驗(yàn)證明，葉片是誘導(dǎo)愈傷組織最好的外植體。Oka等[14]研究了BA對(duì)誘導(dǎo)葉片形成叢生芽的影響，反映出BA對(duì)于葉片的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。2000年，張和禹等[15]以無(wú)菌的桑樹(shù)組織培養(yǎng)苗葉片為材料，通過(guò)正交試驗(yàn)研究了5種不同因素（IAA、NAA、BA、KT、agar）配合使用對(duì)桑樹(shù)葉片的不定芽分化率的誘導(dǎo)，篩選出了誘導(dǎo)桑樹(shù)葉片不定芽分化最佳的培養(yǎng)基為MS+IBA 0.2 mg/L+BA 2.0 mg/L+KT 5.0 mg/L+瓊脂6 g/L。王彥文等[16]對(duì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽分化影響因素進(jìn)行了深入的研究。他們通過(guò)正交試驗(yàn)，探討了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ、NAA、桑品種、葉齡、葉位等五種因素對(duì)桑樹(shù)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選出了桑樹(shù)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件為：選取21 d苗齡的“陜305”組培苗葉片，在MS+TDZ1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)。在此條件下，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)93.9%。對(duì)得到的葉片愈傷組織進(jìn)行了不定芽分化誘導(dǎo)。結(jié)果表明，最佳分化培養(yǎng)基為MS+TDZ 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+2%果糖，愈傷組織不定芽分化率高達(dá)100%。

子葉和下胚軸同樣可作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行再生培養(yǎng)。Kim等[17]使用子葉、下胚軸在含有較高濃度BA（有或者無(wú)NAA）的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出了不定芽，證明了子葉和下胚軸具有再生能力。2001年，周安蓮等[18]以子葉為材料，誘導(dǎo)子葉產(chǎn)生愈傷組織，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基附加2，4-D 2.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+6-BA1.0 mg/L誘導(dǎo)效果最好，愈傷組織形成率最高達(dá)87.5%。王茜齡等[19]以桑的子葉、下胚軸作為外植體，并將子葉等分為子葉尖部、子葉中部、子葉基部（靠近胚芽的一段），將下胚軸等分為下胚軸上段（靠近胚芽的一段）、中段、下段，置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)果表明，子葉基部與下胚軸的上段離體再生效果好，子葉基部的離體再生成苗率可以達(dá)到63.5%，下胚軸上段的離體再生成苗率為47.1%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)分區(qū)子葉和分段下胚軸都是越接近胚芽生長(zhǎng)點(diǎn)的部位用作外植體，其誘導(dǎo)出芽的時(shí)間短，并且能很好地分化再生成苗。

1.3 生殖器官培養(yǎng)

花藥與胚培養(yǎng)是將桑樹(shù)的花藥（包括花穗或花粉）、胚（包括胚珠等）接種到適宜的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成愈傷組織，或直接誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，進(jìn)一步培養(yǎng)為再生植株。通過(guò)花藥和子房培養(yǎng)形成單倍體植株，可以快速獲得純系，縮短育種時(shí)間。

1.3.1 孤雄生殖 林壽康等[20]首先就桑樹(shù)花藥培養(yǎng)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。在供試的5個(gè)品種中，以團(tuán)頭荷葉白的胚狀體誘導(dǎo)率和國(guó)桑21號(hào)的分化成苗率較高，認(rèn)為花粉發(fā)育至單核靠邊期是花藥培養(yǎng)的取材適期。誘導(dǎo)花藥內(nèi)花粉細(xì)胞形成小胚狀體的適宜培養(yǎng)基為MS+BA1-2 ppm+IBA1-2 ppm，當(dāng)小胚狀體發(fā)育至子葉型時(shí)轉(zhuǎn)移其分化，成苗率最高，可達(dá)20%以上，無(wú)根幼苗經(jīng)繼代培養(yǎng)及誘導(dǎo)生根即可發(fā)育為完整植株。經(jīng)幼葉染色體鑒定證實(shí)，花藥培養(yǎng)植株中約9%的個(gè)體為單倍體植株。Sethi等[21]使用MS+IBA5-10 μM+BAP5-15 μM培養(yǎng)基接種花藥，在黑暗下保持15 d，其中一個(gè)品種“Cv.RFS-175”的誘導(dǎo)率達(dá)到了1.82%，表明黑暗是誘導(dǎo)花藥的重要的條件。Katagiri等[22]以每毫升106個(gè)花粉細(xì)胞的密度懸浮培養(yǎng)于含0.1 M的不同糖類(lèi)或糖醇類(lèi)的1/2 B5附加5 mM谷氨酰胺、0.4M甘露醇、l ppm BA和l ppm IBA培養(yǎng)基中，放置在28℃的暗處培養(yǎng)。結(jié)果表明，不同糖類(lèi)和糖醇類(lèi)作碳源對(duì)花粉分裂的誘導(dǎo)作用不同，雙糖比單糖的效果要好，其中果糖對(duì)花粉分裂誘導(dǎo)作用最明顯，這種分裂現(xiàn)象幾乎和生長(zhǎng)在側(cè)芽花序中花粉分裂現(xiàn)象相類(lèi)似，而木糖和乳糖對(duì)花粉分裂的誘導(dǎo)作用要比生長(zhǎng)在側(cè)芽中的花粉分裂旺盛得多。Jain等[23]將單核期的花藥培養(yǎng)6～20 d即看到有微孢子分裂，將孢子再轉(zhuǎn)接于MB+NAA 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L+8%蔗糖培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)；在培養(yǎng)基MB+NAA 0.5 mg/L+BA 1.0 mg/L+肌醇75 mg/L中進(jìn)行生根培養(yǎng)，細(xì)胞學(xué)鑒定出愈傷組織為單倍體。

1.3.2 孤雌生殖 目前對(duì)桑樹(shù)子房組織培養(yǎng)研究的較多。Sita等[24]用子房培育得到了完整植株，他們?cè)诨ㄐ蛐纬缮ｉ┲安上伦臃?，在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最終獲得了65個(gè)植株，其中加入了14.4 μM BAP和4.6 μM Kin的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得了由單個(gè)子房發(fā)育得到的植株。Thomas等[25]也用未受精的子房獲得了單倍體植株，他們培養(yǎng)花序3周后，將單個(gè)子房接入MS+4.5 μM 2，4-D+甘露醇500 mg/L+脯氨酸200 mg/L培養(yǎng)基中，16%的子房成苗，有60%的植株為單倍體，其余的卻為非整倍體。Thomas[26]又直接將生長(zhǎng)了4周的花序切成含有4～5個(gè)小花的小片接種在MS+8.5 μM BAP+4.5 μM 2，4-D培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周再轉(zhuǎn)接入MS+4.5 μM 2，4-D+甘氨酸500 mg/L+脯氨酸200 mg/L培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達(dá)到了16%。此外，也有人對(duì)次生胚胎發(fā)育進(jìn)行了研究。其中Agarwal等[27]對(duì)桑樹(shù)的體細(xì)胞胚次生胚胎發(fā)育和成熟進(jìn)行了研究，在MS+2，4-D 2.0 mg/L+BAP 0.50 mg/L培養(yǎng)基中培育合子胚得到原始體細(xì)胞胚，然后接種于MS+2，4-D 0.05 mg/L+BAP 0.1 mg/L+6%蔗糖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)次級(jí)胚胎，誘導(dǎo)率達(dá)到了98.9%，其中17%為完整的含子葉的胚胎。

1.4 原生質(zhì)體培養(yǎng)

植物原生質(zhì)體是去除了細(xì)胞壁后被質(zhì)膜所包圍的、具有生活力的“裸露細(xì)胞”，能在適宜的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)再生植株。由于沒(méi)有細(xì)胞壁的障礙，原生質(zhì)體能夠直接高效地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)、各種細(xì)胞器甚至細(xì)胞核，也可與異源原生質(zhì)體經(jīng)誘導(dǎo)融合形成體細(xì)胞雜種，其培養(yǎng)技術(shù)與有關(guān)的細(xì)胞、分子和遺傳等學(xué)科的交叉滲透，使植物原生質(zhì)體的研究越來(lái)越受到重視。

原生質(zhì)體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵在于對(duì)材料的酶解。陳愛(ài)玉等[28]對(duì)桑樹(shù)原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了多年的研究，建立了一個(gè)有效的原生質(zhì)體培養(yǎng)體系。他們選用桑子葉、桑幼葉、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、愈傷組織四種材料，分別進(jìn)行了原生質(zhì)體的分離方法及有關(guān)條件的研究，結(jié)果在適宜酶溶液濃度下，桑原生質(zhì)體的釋放速度和產(chǎn)量順序?yàn)樽尤~＞幼葉＞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞＞愈傷組織。此外，他們對(duì)提取桑葉原生質(zhì)體的酶解時(shí)間、纖維素酶的用量進(jìn)行了初步研究。酶液中纖維素酶的用量不宜低于3%，25℃的溫度下酶解5～6 h，原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到最高峰[29]。Futoshi等[30]也對(duì)酶解條件進(jìn)行了探索，他們研究發(fā)現(xiàn)ES5酶系（3.0%纖維素酶，0.1%果膠酶，1.0%離析酶和1.0%木纖維素酶）的作用效果最好，最佳作用時(shí)間4 h。還發(fā)現(xiàn)以子葉作為外植體得到的原生質(zhì)體的產(chǎn)量要高于成熟的葉片，使用ES5酶系處理子葉得到了6.2×107個(gè)原生質(zhì)體的高產(chǎn)量。

要對(duì)分離得到的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)獲得完整的再生植株，培養(yǎng)基的使用和培養(yǎng)條件十分關(guān)鍵。衛(wèi)志明等[31]以30～45 d苗齡的無(wú)菌苗葉片為材料，經(jīng)適當(dāng)酶處理獲得原生質(zhì)體，將其培養(yǎng)在KBP+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+BA 0.5 mg/L液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)密度為5×l04個(gè)/mL，黑暗（25±1）℃下用液體淺層、靜置方法培養(yǎng)。培養(yǎng)第4 d原生質(zhì)體的再生細(xì)胞有15%以上進(jìn)行第一次分裂，第10 d時(shí)統(tǒng)計(jì)分裂頻率為24%，在5～6周后形成了多細(xì)胞團(tuán)和小愈傷組織，植板頻率為8%。將其轉(zhuǎn)入MS+NAA 0.1 mg/L+BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)芽，分化率達(dá)到了35%。幼芽長(zhǎng)到4～5 cm高時(shí)切下，轉(zhuǎn)到1/2MS生根培養(yǎng)基上，經(jīng)2～3周后可形成具發(fā)達(dá)根系并生長(zhǎng)健壯的完整再生植株。Umate等[32]選取由種子進(jìn)行組織培養(yǎng)得到的嫩葉作為材料，用2%纖維素酶和1%離析酶混合酶消化細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體。培養(yǎng)4 d后開(kāi)始細(xì)胞分裂，用含有2.3 μM玉米素和2.3 μM 2，4-D培養(yǎng)基培養(yǎng)原生質(zhì)體，誘導(dǎo)率達(dá)到了29%，轉(zhuǎn)接到含2.3 μM玉米素和13.5 μM麥草畏的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，40～42 d后，約有50個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)出。轉(zhuǎn)入到MS+4.5 μM TDZ+17.1 μM IAA中繼續(xù)培養(yǎng)，再以MS+4.9 μM IBA培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，最終獲得完整植株。

1.5 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指植物細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體在液體培養(yǎng)基中，于搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。與傳統(tǒng)的整株材料相比，植物細(xì)胞懸浮體系由于其分散性好、細(xì)胞形狀及細(xì)胞團(tuán)大小基本相同，而且生長(zhǎng)迅速、重復(fù)性好、易于控制等有利因素，已成為植物生物技術(shù)中十分有用的手段之一[33]。Katagiri等[34]研究發(fā)現(xiàn)將葉片在MS+8.8 μM BAP培養(yǎng)基中液體振蕩培養(yǎng)相比固體培養(yǎng)，其誘導(dǎo)不定芽生成率提高了1倍。接著，他們從冬芽中取出嫩葉片，將其置于MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)速為150 rpm振蕩培養(yǎng)，最佳的培養(yǎng)基為MS+BAP 2 mg/L+丙氨酸100 mg/L，對(duì)于誘導(dǎo)不定芽的效果非常明顯。Shajiahan等[35]將由下胚軸誘導(dǎo)得到的愈傷組織置于MS+2，4-D0.1-1.0 mg/L液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得了類(lèi)胚胎，每隔一周更換培養(yǎng)液繼代培養(yǎng)。懸浮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)大量富集，分化形成絲狀結(jié)構(gòu)，接下來(lái)該結(jié)構(gòu)連續(xù)分化形成球狀和心型結(jié)構(gòu)。李勇等[36]以桑品種粵椹大10誘導(dǎo)出的愈傷組織為接種材料，研究了不同激素對(duì)桑樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)速度的影響。結(jié)果表明，在桑樹(shù)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中單因子植物激素NAA最佳濃度為0.5 mg/L，并發(fā)現(xiàn)組合因子比單因子更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，以生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.1mg/L的效果最好。并發(fā)現(xiàn)B5+6-BA1.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L液體培養(yǎng)基較適合桑品種粵椹大10細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。近年來(lái)，王超等[37]以桑品種育-711的愈傷組織為材料，在MS液體培養(yǎng)基中添加6-BA1.5 mg/L+2，4D 0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L能較好地誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，16 d后細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大。

目前已經(jīng)有多種農(nóng)作物和藥用植物的懸浮培養(yǎng)研究得較為深入，并進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用。我們較為熟知的西洋參[38]、長(zhǎng)春花[39]、飛廉[40]等植物都已建立懸浮細(xì)胞系，并進(jìn)行了活性物質(zhì)發(fā)酵工藝的研究。桑樹(shù)是一種傳統(tǒng)的藥用植物，能產(chǎn)生很多重要的生物活性物質(zhì)，懸浮細(xì)胞系的建立和完善，將為利用桑樹(shù)資源提供一條新的路徑。

2 桑樹(shù)組織培養(yǎng)的應(yīng)用

2.1 種質(zhì)資源保存

種質(zhì)資源是培育優(yōu)良品種的物質(zhì)基礎(chǔ)和原始材料，妥善保存種質(zhì)資源并加以利用已成為育種工作的當(dāng)務(wù)之急。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，很多學(xué)者將該技術(shù)運(yùn)用于重要種質(zhì)資源的保存當(dāng)中，此種方法具有很多優(yōu)點(diǎn)和特殊的應(yīng)用價(jià)值。因?yàn)榕囵B(yǎng)物可以在培養(yǎng)條件下生存，室內(nèi)就能繁殖再生成全植株。它的繁殖速度較快，繁殖系數(shù)高，繁殖后在基因型上穩(wěn)定，能表現(xiàn)種質(zhì)的遺傳特性。同時(shí)，這種方法還能在較小的場(chǎng)所內(nèi)保存大量的種質(zhì)資料，而且成本較低[41]。Enomoto等[42]認(rèn)為通過(guò)組織培養(yǎng)對(duì)于珍貴的桑樹(shù)基因資源的保存非常有效，他成功地再生了24種不同基因型品種的離體芽，并長(zhǎng)成了全植株。為了保護(hù)長(zhǎng)穗桑這一瀕臨滅絕的具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值桑樹(shù)野生近緣種，姜華武等[43]進(jìn)行了長(zhǎng)穗桑幼葉和莖尖培養(yǎng)的研究，建立了長(zhǎng)穗桑組織培養(yǎng)快繁體系。由以上案例可見(jiàn)，組織培養(yǎng)對(duì)于桑樹(shù)種質(zhì)資源保存的意義極其重大。而隨著桑樹(shù)原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)及桑樹(shù)組織培養(yǎng)的整體發(fā)展，將為種質(zhì)資源的保存提供更多、更加有效的辦法。

2.2 多倍體育種

目前國(guó)內(nèi)外桑樹(shù)多倍體育種材料只能通過(guò)人工途徑獲得，在國(guó)內(nèi)主要是采用物理輻射方法或者化學(xué)誘導(dǎo)方法。這種傳統(tǒng)育種周期長(zhǎng)，受天氣、季節(jié)影響大，獲得的多倍體桑育種材料也局限在已有的一些地方桑樹(shù)品種中，基因資源多樣化有限。而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)和化學(xué)誘變相結(jié)合的方法獲取桑樹(shù)多倍體育種材料可克服諸多不良影響[44-45]?；瘜W(xué)誘變與組培方式的結(jié)合，使得多倍體誘導(dǎo)中融入了組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。首先試驗(yàn)條件易于控制，由于組培是在室內(nèi)進(jìn)行的，在很大程度上降低了外界環(huán)境因素對(duì)于試驗(yàn)的干擾和影響。其次，可以縮短育種時(shí)間。第三，利用組織培養(yǎng)技術(shù)可對(duì)誘導(dǎo)成功的材料進(jìn)行快速繁殖，獲得更多的多倍體材料。另外由于所選材料大多幼嫩，且處在分生狀態(tài)的組織細(xì)胞，容易受秋水仙堿的影響，誘導(dǎo)成功率較高。同時(shí)方便鑒定，在短期內(nèi)可快速鑒定大批量株系，篩選出多倍體，且多倍體純度高[46]。

1998年，Chakraborti等[47]首先報(bào)道了通過(guò)組織培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)桑樹(shù)四倍體的研究。他們將頂芽在含秋水仙素（0.05%，0.10%，0.20%）的MS培養(yǎng)基中處理24 h。當(dāng)秋水仙素的濃度為0.10%時(shí)，四倍體的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了（39.4±4.8）%。然后將四倍體芽置于MS+2.6 μM NAA培養(yǎng)基中生根。四倍體芽的再生率達(dá)到了80.8%，顯示出使用組織培養(yǎng)方法誘導(dǎo)四倍體的可行性。王茜齡[48]對(duì)利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)和化學(xué)誘變相結(jié)合的方法獲取桑樹(shù)四倍體育種材料進(jìn)行了連續(xù)幾年的研究。她采用桑樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)與秋水仙堿誘變相結(jié)合的新型育種方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，桑樹(shù)組織培養(yǎng)與秋水仙堿誘導(dǎo)相結(jié)合，在試管內(nèi)可以獲得桑樹(shù)多倍體育種材料。但是材料的種類(lèi)，秋水仙堿的濃度和處理時(shí)間都非常關(guān)鍵，用秋水仙堿直接處理種子、胚軸、子葉，再培養(yǎng)都未獲得多倍體植株。用秋水仙堿處理桑組培不定芽，雖然生長(zhǎng)緩慢，葉片發(fā)生畸變，但經(jīng)過(guò)體細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)法鑒定，獲得了純合的桑四倍體植株，其誘導(dǎo)頻率可達(dá)14%～20%。何健等[49]以長(zhǎng)穗桑枝條為外植體，采用組織培養(yǎng)技術(shù)和多倍體育種技術(shù)相結(jié)合的方法，用0.2%的秋水仙素浸泡莖段3 d，然后轉(zhuǎn)入MS+BA0.2 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基中，四倍體誘導(dǎo)率最高為16.7%。

化學(xué)誘變與組培方法結(jié)合常用誘導(dǎo)方式是浸漬法、點(diǎn)滴法和混培法，材料的選取也較為豐富，種子、愈傷組織、叢生芽、幼苗、葉片、莖段、莖尖、體細(xì)胞胚胎、胚根皆可，而且誘導(dǎo)離體胚乳也可得到三倍體。因此，今后我們結(jié)合組織培養(yǎng)研究桑樹(shù)多倍體育種，還有比較多的研究方法可供我們選擇和研究，以建立切實(shí)可行的體系，為育種工作帶來(lái)幫助。

2.3 人工種子

所謂人工種子，就是將植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚和性細(xì)胞胚包在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并有保護(hù)功能的凝膠膠囊中，形成類(lèi)似種子的結(jié)構(gòu)并保持種子的機(jī)能。人工種子具有諸多優(yōu)點(diǎn)和發(fā)展?jié)摿Γ┤绮皇茏匀画h(huán)境的影響，一年四季均可進(jìn)行，還可節(jié)省大面積種子田；繁殖速度快，能大大提高育種效率，縮短育種時(shí)間；人工種子可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，且不存在品種退化；可利用重組DNA、細(xì)胞融合等現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)出人類(lèi)所需要的任意優(yōu)良性狀的作物；可在人工種皮中加入天然種子所沒(méi)有的特殊成分，如加入殺蟲(chóng)劑、除草劑、各種肥等，可使苗木生長(zhǎng)健壯且可提高苗木的抗性；節(jié)省勞動(dòng)力并可降低成本[50]。

上世紀(jì)80年代，Bapat等[51]就開(kāi)始對(duì)人工桑樹(shù)種子進(jìn)行研究。他們將腋芽包埋進(jìn)含海藻酸鹽和瓊脂的膠化劑中制成膠囊。該膠囊在4℃下儲(chǔ)存45 d沒(méi)有失去生命力，海藻酸鈉經(jīng)測(cè)試為最好的基體，最佳濃度為4%，隨后在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)再生獲得了幼苗。90年代，日本的町井博明等[52-54]對(duì)桑樹(shù)人工種子和生長(zhǎng)條件進(jìn)行了連續(xù)的研究。他們將不定芽包埋進(jìn)含3%藻酸鈉和100 μM氯化鈣的溶液中，制成球形膠囊，在此膠囊中還添加桑生長(zhǎng)必要的營(yíng)養(yǎng)（無(wú)機(jī)鹽、糖、氨基酸）和植物激素等，制成的人工種子種于MS培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)芽生長(zhǎng)良好，即使冷藏80 d，也有60%以上的人工種子生長(zhǎng)。隨后他們研究了不同培養(yǎng)基質(zhì)（沙、土和蛭石）對(duì)于種子生長(zhǎng)的影響。結(jié)果證明土是最好的基質(zhì)，種子正常發(fā)芽并生根。但直接播種的人工種子在幾種基質(zhì)中均不能生根，而經(jīng)4℃存放30 d的人工種子都能生根，發(fā)芽率達(dá)到了50%。2001年，葉志毅等[55]對(duì)桑樹(shù)體細(xì)胞胚人工種子的制作進(jìn)行了探究。他們將經(jīng)誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚切出小芽，用4%海藻酸鈉和1%CaCl2溶液包裹，包裹時(shí)間為30 min。對(duì)設(shè)計(jì)的3種人工胚乳的效果進(jìn)行了測(cè)試，其中在海藻酸鈉溶液中加入MS+蔗糖250 g/L是最佳組合。將人工播入三種不同的培養(yǎng)介質(zhì)，其中MS+果糖20 g/L+0.8%瓊脂和MS+蔗糖30 g/L+0.8%瓊脂較好，它們的發(fā)芽率和莖發(fā)生率都達(dá)到了100%。2008年，Kamareddi[56]對(duì)人工胚乳中添加殺菌劑進(jìn)行了研究。他在胚乳中加入0.1%硫酸鏈霉素和0.1%苯菌靈，不僅能夠抵抗外界的污染物，還能夠使膠囊腋芽的發(fā)芽率達(dá)到60%左右。

目前桑樹(shù)人工種子僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，并未應(yīng)用到實(shí)際桑樹(shù)生產(chǎn)中。由于植物人工種子普遍在包埋方法、人工種皮、人工種子的干化、貯藏和防腐方法這些問(wèn)題上還有一些不完善，桑樹(shù)人工種子研究也不多，而且還要考慮桑樹(shù)自身的生理特性，因此，桑樹(shù)人工種子的研究還是一項(xiàng)任重而道遠(yuǎn)的工作。

2.4 轉(zhuǎn)基因育種

通過(guò)植物組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，是近年來(lái)植物品種改良的重要方法。目前有關(guān)桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因報(bào)道當(dāng)中，絕大部分都或多或少利用了組織培養(yǎng)的技術(shù)。

自從 1990 年日本學(xué)者 Machii[57]通過(guò)農(nóng)桿菌將β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因?qū)肷?shù)葉盤(pán)并在桑苗中表達(dá)以來(lái)，很多學(xué)者在桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因這一領(lǐng)域進(jìn)行了大量的探索和研究，已取得了一系列的成就。目前，葡萄糖苷酸酶（GUS）基因[57]、抗菌肽基因[58]、大豆球蛋白基因[59]、幾丁質(zhì)酶基因[60]、水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因[61]等外源基因成功轉(zhuǎn)到了桑樹(shù)中，育成轉(zhuǎn)基因植株。已報(bào)道的研究當(dāng)中，幾乎都是以農(nóng)桿菌為載體介導(dǎo)的外源基因進(jìn)入桑樹(shù)。以談建中等[59]的工作為例，他們以試管苗的幼葉和莖尖作為遺傳轉(zhuǎn)化的起始材料，于含大豆球蛋白基因載體的農(nóng)桿菌菌液中浸漬5～10 min，接種于基本分化培養(yǎng)基共培養(yǎng)，然后將受體材料轉(zhuǎn)移至含抗生素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選，再生得到小植株，最后通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的PCR-Southern雜交及RNA點(diǎn)雜交等鑒定，證實(shí)大豆球蛋白基因轉(zhuǎn)化桑樹(shù)成功。

目前，桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因受體使用作為成熟且最好的受體材料是叢生芽。2007年，Agarwal等[62]首次比較了使用不同組織培養(yǎng)再生體系進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的效果。他們將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptII）和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）報(bào)告基因以農(nóng)桿菌為介質(zhì)，分別導(dǎo)入愈傷組織、叢生芽和體細(xì)胞胚中再生培養(yǎng)。其中以叢生芽為基因轉(zhuǎn)移的載體效率最高，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了18.6%。

3 展望

植物組織培養(yǎng)為研究植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗性生理、器官發(fā)生及胚胎發(fā)生提供了有效途徑，已在具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的農(nóng)作物、花卉及果木中應(yīng)用。目前桑樹(shù)組織培養(yǎng)在芽、葉片、花藥方面的研究較為成功，而在原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)等方面的研究水平還較低。總體而言，桑樹(shù)組織培養(yǎng)的研究水平與其他一些植物相比較還有一定的差距。從而使桑樹(shù)組織培養(yǎng)的應(yīng)用受到一定限制，遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有發(fā)揮其在桑樹(shù)研究中的重要作用。鑒于桑樹(shù)組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀，在今后的工作中應(yīng)該加強(qiáng)一下幾個(gè)方面的研究：（1）加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，盡快建立不同桑樹(shù)種質(zhì)資源的快繁技術(shù)體系，加快優(yōu)良品種的繁育。（2）將桑樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，建立桑樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系，將一部分抗病與抗逆基因轉(zhuǎn)入桑樹(shù)植株，對(duì)桑樹(shù)進(jìn)行遺傳改良。（3）重點(diǎn)研究原生質(zhì)體培養(yǎng)、花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù)，為桑樹(shù)倍性育種奠定基礎(chǔ)。隨著桑樹(shù)基因組測(cè)序計(jì)劃的完成，桑樹(shù)的研究即將進(jìn)入更快的軌道，組織培養(yǎng)是現(xiàn)代作物科學(xué)研究必不可少的技術(shù)基礎(chǔ)，也是現(xiàn)代遺傳育種研究的重要路徑，可以為桑樹(shù)多用途綜合利用與開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐，必將為桑樹(shù)科學(xué)的發(fā)展貢獻(xiàn)其應(yīng)有的價(jià)值。