異葉南洋杉外植體預(yù)處理及消毒滅菌的研究

黃松殿 俞建妹 龍敏 劉芳 沈遐

摘 要：采用5%濃度的洗潔精對(duì)異葉南洋杉莖段預(yù)處理后污染率為80.00%。選用添加PVP藥品0.05g的5%次氯酸鈉溶液消毒滅菌時(shí)間12min，污染率為53.33%，但對(duì)莖段有一定的損傷作用。始芽誘導(dǎo)最佳時(shí)間為春末夏初，從母株基部采取健壯芽，保留鉆形葉接種后分化不定芽時(shí)間為26d，始芽生長(zhǎng)健康。

關(guān)鍵詞：異葉南洋杉;外植體;預(yù)處理;消毒滅菌

中圖分類號(hào)：S722.3+7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201115025

收稿日期：2020-10-10

基金項(xiàng)目：南寧良鳳江國(guó)家森林公園“南寧樹木園優(yōu)質(zhì)用材樹種科研項(xiàng)目培育與深化”（項(xiàng)目編號(hào)：ky2018001）

作者簡(jiǎn)介：黃松殿（1966-），男，本科，高級(jí)工程師。研究方向：森林培育、植物栽培、植物分類學(xué)。

異葉南洋杉（學(xué)名：Araucaria heterophylla（Salisb.）Franco）是南洋杉科南洋杉屬植物，喬木，在原產(chǎn)地高可達(dá)50m以上[1]。異葉南洋杉樹干通直，樹皮暗灰色，樹冠塔形，樹姿優(yōu)美，我國(guó)廣東、福建、廣西等地均有引種栽培，是南方園林綠化的優(yōu)良樹種，也是世界著名的公園綠化樹種。其木材紋理美觀，是木質(zhì)家具貼面的優(yōu)良用材樹種。異葉南洋杉種子結(jié)實(shí)率較低，南寧樹木園于20世紀(jì)80年代初引種的數(shù)十棵異葉南洋杉苗木至今仍未見結(jié)實(shí)現(xiàn)象。關(guān)于異葉南洋杉育苗方面的報(bào)道甚少，迄今只查到危孝棋團(tuán)隊(duì)于1989—2004年報(bào)道關(guān)于異葉南洋杉根接、萌條扦插及根插繁殖技術(shù)研究的3篇文章[2-4]，及彭東輝等申請(qǐng)的專利“一種異葉南洋杉水培根誘導(dǎo)與培養(yǎng)技術(shù)”[5]，并未見組培方面的報(bào)道。異葉南洋杉不定芽小枝的葉排列密集，開展，鉆形，光綠色，向上彎曲，通常兩側(cè)扁，具3～4棱，上面具多數(shù)氣孔線，易附著微生物，清理難度大，不易獲得無(wú)菌體。為此，南寧樹木園于2018年開始立項(xiàng)進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，力爭(zhēng)篩選出異葉南洋杉組織培養(yǎng)適宜的外植體類型，取材時(shí)間及其消毒方法，為之后的無(wú)性繁殖提供技術(shù)支持，為以后規(guī)模化培育優(yōu)質(zhì)苗木應(yīng)用于市場(chǎng)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于良鳳江國(guó)家森林公園（南寧樹木園）。以三十二年生，胸徑30.0～33.9cm，樹高22.6～25.0m，枝下高5.6～8.8m，樹干通直、寶塔式樹冠的優(yōu)良單株基部萌芽、樹干不定芽為外植體。試驗(yàn)時(shí)間為2018年8月—2020年9月。

1.2?方法

1.2.1?外植體的預(yù)處理對(duì)外植體消毒效果的影響

將采回的外植體修剪成4～6cm，在流水中沖洗5～8min后用干凈的棉花擦拭莖段及鉆形葉除去表皮上的灰塵和雜物等，選用洗潔精、洗衣粉、多菌靈5%濃度的溶劑分別浸泡15min，再用流水沖洗30min，后用蒸餾水沖洗6次，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，備用。消毒劑選用0.1%升汞消毒6min，待消毒處理后的外植體均接到始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)污染率。

1.2.2?不同消毒劑組合對(duì)外植體消毒效果的影響

將外植體按1.2.1方法預(yù)處理后，分別放入不同消毒劑中進(jìn)行處理，消毒劑組合有：先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒（①）;先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒，滴入3mL吐溫80（②）;先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒，添加PVP藥品0.05g（③）;5%次氯酸鈉溶液，滴入600青霉素（④）;5%次氯酸鈉溶液，滴入3mL吐溫80（⑤）;5%次氯酸鈉溶液，添加PVP藥品0.05g（⑥）。

①②③處理的消毒時(shí)間分別為3min、6min和9min，④⑤⑥處理的消毒時(shí)間分別為8min、10min和12min，不間斷攪拌后再用無(wú)菌水沖洗4～6次，每個(gè)處理接種30個(gè)，3次重復(fù)。3～60d后統(tǒng)計(jì)污染率及枯死率。

1.2.3?不同外植體取材部位消毒效果的影響

依據(jù)植物生長(zhǎng)特性，供體植株的外植體取材部位的不同可導(dǎo)致外植體生理狀態(tài)上的差異[6]。有研究表明，同一器官的不同部位取下的相同類型組織，其再生能力也不同[7]。本試驗(yàn)外植體采集分為伐木樹樁萌芽、完整木基部促芽萌芽及樹干節(jié)間處促芽萌芽，莖段在進(jìn)行預(yù)處理及消毒處理后接入始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種30個(gè)，3次重復(fù)。3d后觀察，統(tǒng)計(jì)污染率與萌芽時(shí)間。

1.2.4?不同外植體取材季節(jié)對(duì)消毒效果的影響

在春季3月、夏季4—6月、秋季7—9月及冬季10—11月連續(xù)取材，分別取伐木樹樁萌芽、完整木基部促芽萌芽及樹干結(jié)節(jié)處促芽萌芽。進(jìn)行取材季節(jié)對(duì)外植體萌芽率的影響的比較。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，3次重復(fù)。3d后觀察，統(tǒng)計(jì)污染率與萌芽率。

1.2.5?去留外植體鉆形葉對(duì)消毒效果的影響

莖段在進(jìn)行預(yù)處理及消毒處理后分為保留鉆形葉及去除鉆形葉2種外植體，分別接入始芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中觀察其感菌及褐化情況。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，3次重復(fù)。3d后觀察，統(tǒng)計(jì)污染率及褐化率。

1.3?培養(yǎng)條件

初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS加6-BA2.0～5.0mg·L-1加IAA1.0～3.0mg·L-1加CH250mg·L-1，白糖30g·L-1，瓊脂5g·L-1，pH6.0。培養(yǎng)基在1.1MP，121℃高溫高壓條件下滅菌消毒15min。培養(yǎng)室溫度26±2℃，光照時(shí)間12～14h·d-1，光照強(qiáng)度800～2000lx。新轉(zhuǎn)接的培養(yǎng)物，在800lx光照條件下培養(yǎng)7～10d。

1.4?數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2017、SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及顯著性分析，統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率、萌芽率。

2?結(jié)果與分析

2.1?預(yù)處理對(duì)外植體消毒滅菌效果的影響

從圖1可知，采用洗潔精、洗衣粉為預(yù)處理劑對(duì)異葉南洋杉莖段處理后，莖段在前3d開始出現(xiàn)污染現(xiàn)象，說(shuō)明其表面菌類未得到較好清理，在30d內(nèi)污染情況持續(xù)上升趨向穩(wěn)定，在30～60d仍然有部分莖段存在污染現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為內(nèi)源菌污染;采用多菌靈預(yù)處理劑處理后的莖段，表面污染開始時(shí)間在3d后，且在30d內(nèi)污染率相對(duì)低，可能原因?yàn)槎嗑`對(duì)莖段表面菌類具有相對(duì)較好的殺菌效果，但其對(duì)莖段內(nèi)源菌的消毒效果相對(duì)較差，在30～60d期間內(nèi)源菌污染率近40.00%，總污染率達(dá)90.00%。綜上所述，洗潔精對(duì)莖段的預(yù)處理效果相對(duì)較好，接種后60d污染率控制在80.00%。

2.2?不同消毒劑組合對(duì)外植體消毒效果的影響

從表1可知，5%次氯酸鈉溶液對(duì)異葉南洋杉莖段消毒效果相對(duì)較好，污染率低于64.00%，但其對(duì)莖段的損傷力較大，莖段枯死率在15.00%以上;為了能較好地降低污染率及枯死率，在消毒劑溶液中添加吐溫80或PVP，一定程度能起到助力消毒及抑制污染的效果;PVP的抑制污染效果相對(duì)較好，而在5%次氯酸鈉溶液中添加600青霉素對(duì)消毒作用也起到一定的改善作用。

2.3?不同外植體取材部位對(duì)消毒及萌芽的影響

從表2可知，完整木樹干節(jié)間萌芽污染率相對(duì)較低，伐樁萌芽其次，完整木基部萌芽最高，這與植株所處環(huán)境相關(guān)，取材地位于森林景區(qū)，菌類繁多，越接近地面，菌種越繁雜，去除外植體表面菌類難度越大。伐樁萌芽莖段因集聚樹兜及根系的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，粗壯，始芽分化時(shí)間快，在第26天開始分化成可視芽，芽尖圓潤(rùn)飽滿，健康;完整木基部萌芽莖段開始分化成可視芽時(shí)間為第45天，芽尖飽滿;完整木樹干節(jié)間萌芽莖段開始分化成可視芽時(shí)間為第62天，芽尖纖細(xì)，偏淡黃。從莖段的始芽分化情況可知，其分化出的新芽跟其莖段內(nèi)含養(yǎng)分有關(guān)，芽分化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，原莖段基部形成愈傷時(shí)間長(zhǎng)不能從培養(yǎng)基中吸取養(yǎng)分，如其體內(nèi)的養(yǎng)分含量不足易導(dǎo)致不定芽難以分化，抽長(zhǎng)生長(zhǎng)，莖段易褐化枯死。因此，從母株基部采取健壯芽為外植體利于不定芽分化及抽長(zhǎng)生長(zhǎng)。

2.4?不同外植體取材季節(jié)對(duì)消毒效果的影響

從圖2可知，在四季中采集外植體的時(shí)間對(duì)消毒及不定芽萌芽影響較大，根據(jù)自然界的菌類繁衍規(guī)律及植株的生物學(xué)特性，植株不同時(shí)節(jié)的抽芽生長(zhǎng)結(jié)實(shí)均需遵循物候期。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可知，異葉南洋杉進(jìn)行消毒建立無(wú)菌體系的最佳時(shí)節(jié)為春末夏初，外植體生長(zhǎng)點(diǎn)集聚的養(yǎng)分多，分化能力強(qiáng)，利于形成健康的不定芽。秋冬季分化的少量不定芽長(zhǎng)勢(shì)弱，難以自養(yǎng)，易褐化，難以形成健壯芽苗。

2.5?去留外植體鉆形葉對(duì)消毒效果的影響

從試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)可知，保留外植體鉆形葉的污染率為70.00%，褐化率為13.33%;去除外植體鉆形葉的污染率為46.67%，褐化率為100.00%。異葉南洋杉嫩枝鉆形葉排列密集，保留時(shí)難以清理葉腋菌類個(gè)體，去除后由于莖段傷口過多既不利于消毒劑處理也不利于接種后傷口愈合，易導(dǎo)致褐化枯死。因此，在進(jìn)行外植體消毒過程中最好是保留鉆形葉。

3?結(jié)論與討論

異葉南洋杉鉆形葉密集，葉腋處易積菌難以清除，用軟毛刷除塵易傷皮，莖段易褐化枯死;用流水沖洗或棉布清洗不易清除邊角灰塵，滋生真菌、細(xì)菌，不易獲得無(wú)菌體。在試驗(yàn)中采用5%濃度的洗潔精對(duì)異葉南洋杉莖段的預(yù)處理效果相對(duì)較好，接種后60d污染率控制在80.00%;在消毒過程中選擇5%次氯酸鈉溶液及添加PVP藥品0.05g的消毒劑消毒時(shí)間12min，污染率可控制在53.33%內(nèi)，但對(duì)莖段有一定損傷作用。從母株基部采取健壯芽開始分化不定芽時(shí)間為第26天，始芽生長(zhǎng)健康;始芽誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需60d才發(fā)生始芽分化，而莖段保鮮時(shí)間通常在26～62d逐漸出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，難以維持到不定芽分化生長(zhǎng)階段。從目前情況來(lái)看，為了能獲得較多可應(yīng)用的外植體，需加大消毒數(shù)量，通過增加消毒基數(shù)，或在林區(qū)時(shí)先進(jìn)行不定芽消毒處理后再進(jìn)行采集，以獲得更多可用芽。

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（責(zé)任編輯?李媛媛）