基質(zhì)金屬蛋白酶?9及金屬蛋白酶組織抑制劑1在呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎進(jìn)展為哮喘中的意義

康平 孫曉敏 趙少聰 馮一川 李奕

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院1呼吸科，2普內(nèi)科，3檢驗科，4過敏原治療室（鄭州450000）

70%以上的毛細(xì)支氣管炎（以下簡稱毛支）是由呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起的［1］。臨床研究證實，嬰幼兒時期RSV毛支與兒童時期支氣管哮喘的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］，需及早干預(yù)以改善預(yù)后［4］。臨床目前尚缺乏預(yù)測毛支進(jìn)展性哮喘發(fā)生的有效指標(biāo)?；|(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopro?teinase?9，MMP?9）及其組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase?1，TIMP?1）是參與呼吸道炎癥、哮喘氣道高反應(yīng)性的細(xì)胞因子之一［5］，被認(rèn)為是RSV毛支病情評估的潛在標(biāo)志物［6-7］。然而，目前關(guān)于MMP?9、TIMP?1及二者平衡狀態(tài)與RSV毛支發(fā)展為哮喘的關(guān)系尚未見報道。本研究旨在探討RSV毛支患兒外周血中MMP?9和TIMP?1水平在其發(fā)展為哮喘中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年6月至2017年6月本院收治的RSV毛支患兒300例（RSV組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）癥狀、體征和相關(guān)輔助檢查符合《諸福棠實用兒科學(xué)》中毛細(xì)支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］，經(jīng)咽拭子或鼻咽部抽吸等呼吸道分泌物病原學(xué)檢測明確為RSV感染；（2）30 d～1周歲；（3）首次感染和發(fā)病；（4）臨床及病史資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他病原體感染；（2）繼發(fā)于肺結(jié)核等肺部感染；（3）合并心腦血管疾病、自身免疫性疾病、肝腎功能障礙；（4）早產(chǎn)兒（胎齡36周）；（5）入組前1個月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素。收集同期健康體檢幼兒200例為對照組，年齡42 d～1周歲。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，相關(guān)研究獲得受試者家屬知情同意。

1.2 臨床資料及分組統(tǒng)計研究對象的一般臨床資料，包括年齡、性別、過敏史、家族過敏性疾病史、父母吸煙史以及咳嗽、氣促、喘息、心動過速、三凹征和發(fā)紺等臨床查體癥狀。輔助檢查包括呼吸頻率、血氧飽和度等。參照RSV毛細(xì)支氣管炎評分標(biāo)準(zhǔn)（呼吸評分法）對RSV毛細(xì)支氣管炎患兒進(jìn)行病情評估［9］。從入組開始對RSV毛細(xì)支氣管炎患兒進(jìn)行隨訪，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］將RSV毛細(xì)支氣管炎患兒分為非哮喘組和哮喘組，隨訪截止至2019年12月。

1.3 實驗室指標(biāo)采集所有研究對象入組時指腹血3 mL，全自動生化分析儀檢測血常規(guī)指標(biāo)，觀察白細(xì)胞計數(shù)（white blood cell，WBC）、中性粒細(xì)胞計數(shù)（neutrophil count，NEUC）及比例、淋巴細(xì)胞計數(shù)（lymphocyte count，LMC）及比例；放射免疫法測定C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）；酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中MMP?9和TIMP?1的含量并計算二者比值：血液樣本于非抗凝管中靜置2 h，3 000 r/min離心30 min后取上清，按照試劑盒（北京Solarbio科技有限公司）說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較行χ2檢驗；采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析MMP?9、TIMP?1和MMP?9/TIMP?1對RSV毛支診斷及其發(fā)展為哮喘的預(yù)測價值；logistic多因素回歸分析影響RSV毛支發(fā)展為哮喘的危險因素。當(dāng)P ＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV 組與對照組一般及臨床資料比較RSV組NEUT及比例、LMC及比例、CRP顯著高于對照組（P ＜0.05）；RSV組血清MMP?9、TIMP?1水平和MMP?9/TIMP?1均顯著高于對照組（P ＜0.05），見表1。

2.2 MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 與RSV毛支相關(guān)性分析以RSV組和對照組作為分類變量進(jìn)行ROC曲線分析顯示，血清MMP?9、TIMP?1和MMP?9/TIMP?1診斷RSV毛支的曲線下面積（AUC）分別為0.942、0.579、0.827，最佳截斷值分別為1 705.9、115.75 ng/mL和6.57，特異性分別為86.7%、93.0%、91.0%，敏感性分別為90.0%、21.5%、71.0%。見圖1。

相關(guān)性分析顯示，RSV毛細(xì)支氣管炎患兒MMP?9與臨床評分呈正相關(guān)；MMP?9/TIMP?1與臨床評分及LMC均呈正相關(guān)，與NEUT呈負(fù)相關(guān)（P ＜0.05），提示其與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。見表2。

2.3 血清MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 與RSV毛支發(fā)展為哮喘的關(guān)系300例RSV組毛支患兒的隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共88例（29.33%）患兒發(fā)展為哮喘。比較哮喘組和非哮喘組一般及實驗室資料，兩組在年齡、接觸過敏原、家族過敏史、LMC、呼吸頻率、臨床評分等指標(biāo)上差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），且哮喘組MMP?9水平及MMP?9/TIMP?1比值均顯著高于非哮喘組（P ＜0.05）。見表3。ROC曲線分析顯示，血清MMP?9、TIMP?1及MMP?9/TIMP?1診斷RSV毛支發(fā)展為哮喘的曲線下面積分別為0.612、0.547、0.708，特異性分別為86.3%、75.5%、90.6%，敏感性分別為37.5%、37.5%、61.4%。最佳截斷值分別為3 733.7、190.3 ng/mL和14.56。見圖2。

表1 RSV 組與對照組一般及臨床資料比較Tab.1 Comparison of general and clinical data between RSV group and control group±s

表1 RSV 組與對照組一般及臨床資料比較Tab.1 Comparison of general and clinical data between RSV group and control group±s

對照組RSV組t/χ2值P值年齡（d）男［例（%）］接觸過敏原［例（%）］家族過敏史［例（%）］父母吸煙［例（%）］WBC（×109/L）NEUT（×109/L）NEUT比例（%）LMC（×109/L）LMC比例（%）CRP（mg/L）氧飽和度（%）呼吸頻率（次/min）MMP?9（ng/mL）TIMP?1（ng/mL）MMP?9/TIMP?1（n=200）176.9±89.1 113（56.50）43（21.50）49（24.50）83（41.50）8.74±1.21 4.74±1.04 54.3±9.7 3.13±0.91 35.8±9.8 4.56±1.65 96.4±1.3 45.0±7.4 1 115.6±528.0 249.7±132.4 6.1±5.1（n=300）183.1±74.5 187（62.33）49（16.33）55（18.33）120（47.67）8.82±1.79 3.45±1.99 37.7±17.9 4.9±1.49 52.3±17.9 4.93±1.14 96.2±1.3 45.3±7.3 2 776.3±944.9 284.0±131.4 11.4±6.1 0.811 1.701 2.134 2.770 0.112 0.594 9.465 13.375 15.599 13.283 2.762 1.442 0.305 22.609 2.847 10.178 0.418 0.192 0.144 0.096 0.738 0.553＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.003 0.150 0.760＜0.001 0.005＜0.001

圖1 MMP?9、TIMP?1 及MMP?9/TIMP?1 診斷RSV 毛支的ROC 曲線Fig.1 ROC curves of MMP?9，TIMP?1 and MMP?9/TIMP?1 in diagnosing RSV bronchiolitis

2.4 RSV 毛支發(fā)展為哮喘的危險因素分析以是否發(fā)展為哮喘為因變量，納入表3中P ＜0.05的指標(biāo)為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析。結(jié)果顯示，家族過敏史、臨床評分、MMP9及MMP?9/TIMP?1是RSV毛支向哮喘發(fā)展的危險因素，而發(fā)病年齡是其保護(hù)因素（P ＜0.05）。見表4。

3 討論

約30% RSV毛支可發(fā)展為哮喘，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肺部病變甚至心力衰竭［11］。該致病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為與炎癥反應(yīng)及過度免疫有關(guān)。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的重要酶類，參與組織重建、修復(fù)、血管形成及炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程［12］。TIMP?1是MMPs的特異性抑制因子，二者共同參與多種呼吸道氣道重塑相關(guān)疾病［13］。此外，MMP?9和TIMP?1作為一對互為抑制的分子，二者的平衡在疾病中具有重要意義。NAVRATI?LOVA等［14］研究發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺病（COPD）患者中存在MMP?9及TIMP?1濃度的顯著升高，且患者可能在肺局部及全身水平上存在MMP/TIMP的失衡和紊亂。GILOWSKA等［15］研究也顯示，COPD患者血清MMP?9和MMP?9/TIMP1水平顯著高于對照組，且隨著患者肺功能的下降逐漸升高。ZHOU等［16］研究顯示，MMP?9/TIMP?1比值的升高與患者的肺功能呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。有研究顯示，COPD患者肺血管中存在MMP?9的高表達(dá)，且可以介導(dǎo)TLR?4的炎癥反應(yīng)以影響肺血管重塑［17］。然而，MMP?9和TIMP?1在毛支患兒中的表達(dá)情況及意義尚不明確。BRAND等［18］的一項前瞻性研究表明，病毒性呼吸道感染兒童血液和鼻咽標(biāo)本中MMP?9的表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)，可作為病毒性呼吸道感染疾病嚴(yán)重程度的潛在標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RSV毛支患兒血清MMP?9、TIMP?1水平及MMP?9/TIMP?1明顯升高，且MMP?9/TIMP?1與RSV毛支患兒病情嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)，提示其可能與RSV毛支的發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)。

表2 MMP?9、TIMP?1 及MMP?9/TIMP?1 與臨床評分及血常規(guī)指標(biāo)相關(guān)性Tab.2 Correlation of MMP?9，TIMP?1 and MMP?9/TIMP?1 with clinical scores and blood routine indicators

表3 哮喘組與非哮喘組一般及臨床資料比較Tab.3 Comparison of general and clinical data between asthma group and non?asthma group ±s

表3 哮喘組與非哮喘組一般及臨床資料比較Tab.3 Comparison of general and clinical data between asthma group and non?asthma group ±s

年齡（d）性別（男/女）接觸過敏原［例（%）］家族過敏史［例（%）］父母吸煙［例（%）］WBC（×109/L）NEUT（×109/L）NEUT比例（%）LMC（×109/L）LMC比例（%）CRP（mg/L）氧飽和度（%）呼吸頻率（次/min）臨床評分（分）MMP?9（ng/mL）TIMP?1（ng/mL）MMP?9/TIMP?1非哮喘組（n=212）190.9±71.9 133/79 28（13.2）29（13.7）78（36.8）8.76±1.78 3.53±1.96 38.7±17.5 4.36±1.42 51.32±17.53 1.90±1.17 96.20±1.36 44.85±7.14 2.38±0.80 2 747±953 290.3±128.9 10.7±4.9哮喘組（n=88）164.3±77.7 54/34 21（23.9）26（29.5）42（47.7）8.98±1.80 3.28±2.06 35.2±18.7 4.81±1.61 54.81±18.66 1.99±1.06 96.18±1.31 46.41±7.39 3.07±0.92 3 334±1445 268.7±136.9 14.5±5.8 t/χ2值2.858 0.050 5.167 10.456 3.098 0.989 0.994 1.541 2.291 1.541 0.610 0.123 1.706 6.153 3.504 1.297 5.473 P值0.005 0.823 0.023 0.001 0.078 0.323 0.321 0.124 0.023 0.124 0.543 0.902 0.089＜0.001 0.001 0.196＜0.001

圖2 MMP?9、TIMP?1 及MMP?9/TIMP?1 預(yù)測RSV 毛支進(jìn)展為哮喘的ROC 曲線Fig.2 ROC curves of MMP?9，TIMP?1 and MMP?9/TIMP?1 predicting the progression of RSV bronchiolitis to asthma

表4 RSV 毛細(xì)支氣管炎發(fā)展為哮喘的logistic 回歸分析Tab.4 Logistic regression analysis of RSV bronchiolitis progressing to asthma

現(xiàn)有研究表明，MMP?9與TIMP?1共同參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解從而影響哮喘發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——支氣管組織破壞和修復(fù)［19］。NAIK等［20］發(fā)現(xiàn)哮喘患者誘導(dǎo)痰液中MMP?9水平顯著高于對照組，提示MMP?9與哮喘的發(fā)生有關(guān)；CHAUHAN等［21］發(fā)現(xiàn)在慢性哮喘患者中，MMP?9及TIMP?1活性均隨著氣道炎癥和肺纖維化的進(jìn)展而升高，隨其緩解而降低。GRZELA等［22］研究認(rèn)為MMP?9在哮喘的病理機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，對MMP?9抑制的研究有望成為提高哮喘治療效果的新視角。本研究結(jié)果顯示，發(fā)展為哮喘的RSV毛支患兒血清MMP?9水平及MMP?9/TIMP?1明顯高于非哮喘組，提示該指標(biāo)可能對RSV毛支向哮喘轉(zhuǎn)化具有一定預(yù)測效能，與現(xiàn)有結(jié)論基本一致。此外，MMP?9/TIMP?1與RSV患兒的淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平密切相關(guān)，提示其可能還參與患兒的炎癥及免疫反應(yīng)過程。因此可以推測，RSV感染誘發(fā)哮喘的機(jī)制之一可能在于感染誘導(dǎo)氣道內(nèi)炎性因子釋放，激活機(jī)體免疫反應(yīng)的同時進(jìn)一步誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致氣道黏膜上皮完整性的破壞以及嚴(yán)重時哮喘的發(fā)生，因此，表征胞外基質(zhì)降解水平的MMP?9/TIMP?1指標(biāo)可以對哮喘的發(fā)生起到預(yù)警作用。此外，本研究結(jié)果還顯示，年齡依賴的免疫能力、遺傳因素、個體特應(yīng)性體質(zhì)及首次發(fā)病的嚴(yán)重程度等均是毛支患兒發(fā)展為哮喘的影響因素，與現(xiàn)有研究［23］一致。

綜上所述，本研究認(rèn)為RSV毛支患兒血清MMP?9、TIMP?1水平和MMP?9/TIMP?1與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，且MMP9及MMP?9/TIMP?1可能是RSV毛支發(fā)展為哮喘的預(yù)后因素，可以作為RSV毛支患兒臨床診療的參考指標(biāo)。