點(diǎn)按手法對(duì)CCI模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)PKC及P2X3表達(dá)的影響

陳樂春， 林志剛， 陳少清， 張幻真， 秦 麗， 陳水金， 王詩(shī)忠

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，坐骨神經(jīng)痛、腰椎間盤突出癥等多種常見疾病均屬于NP[1]。NP常反復(fù)發(fā)作，持續(xù)過程長(zhǎng)，需長(zhǎng)期治療[2]。目前，針對(duì)NP的總體療效欠佳，約50%的患者疼痛不能得到充分緩解。持續(xù)的疼痛感受導(dǎo)致患者的情緒、睡眠、工作和生活質(zhì)量受到影響，也給社會(huì)醫(yī)療資源和患者的經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[1,3]。中醫(yī)推拿屬于祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，臨床應(yīng)用鎮(zhèn)痛效果顯著，在治療神經(jīng)根型頸椎病、腰椎間盤突出癥、坐骨神經(jīng)痛等疾病均有良好的臨床療效[4-6]，且副作用小[7]，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究擬通過疼痛行為學(xué)、蛋白免疫印跡、蘇木精-伊紅染色(H-E染色)等方法觀察推拿常用的鎮(zhèn)痛手法——點(diǎn)按對(duì)慢性壓迫性神經(jīng)損傷模型(chronic constriction injury, CCI)大鼠的鎮(zhèn)痛作用，觀察點(diǎn)按法干預(yù)對(duì)CCI模型大鼠DRG神經(jīng)元PKC及P2X3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 SPF級(jí)180～220 g雄性SD大鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005] 80只，統(tǒng)一飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，模擬標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)，予以自由飲食及飲水。隨機(jī)分為4組(每組20只)：空白組、模型組、假手術(shù)組、造模+點(diǎn)按組。

1.2主要藥品及試劑β-actin抗體、P2X3抗體、兔抗PKC多克隆抗體、戊巴比妥鈉(批號(hào)：B20150801，大連美侖生物技術(shù)有限公司)。

1.3主要儀器 恒溫水浴鍋、顯微鏡、蛋白核酸分析儀、無(wú)線觸覺力按摩指套(日本Finger TPS公司)、自制推拿固定器。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備

1.2.1.1建模 采用Bennett和Xie模型制備方法建立大鼠CCI模型[8]，假手術(shù)組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)后縫合，不打結(jié)，其余按模型制備手術(shù)操作。

1.2.1.2模型評(píng)估 CCI模型制備后大鼠出現(xiàn)跛行，足呈輕度外翻狀，且有時(shí)出現(xiàn)舔舐、懸空等后肢保護(hù)現(xiàn)象，表明坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷模型(CCI模型)制備成功。造模后常規(guī)肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染，若出現(xiàn)感染及其他疾患者棄去不用，對(duì)應(yīng)補(bǔ)充，直到滿足實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.2觸誘發(fā)痛的測(cè)定(von Frey 測(cè)試) 正式測(cè)試前大鼠靜置籠中15 min適應(yīng)環(huán)境。采用1～26 g不同等級(jí)的von Frey纖維絲由低等級(jí)向高等級(jí)逐一刺激大鼠雙側(cè)后肢足底心，加壓至纖維絲彎曲持續(xù)5 s。每個(gè)纖維絲等級(jí)測(cè)試5次，其中有3次刺激出現(xiàn)大鼠縮足(記3個(gè)“+”號(hào))則停止向上一等級(jí)測(cè)試，改向下一級(jí)重復(fù)測(cè)試，確定下一級(jí)不出現(xiàn)3個(gè)“+”號(hào)。機(jī)械痛足反射閾值為首個(gè)出現(xiàn)3個(gè)“+”的纖維絲等級(jí)。同一只大鼠兩次測(cè)試需間隔至少30 s。

1.2.3干預(yù)措施 空白組不做任何處理，正常喂養(yǎng)；模型組、假手術(shù)組按上述手術(shù)操作；造模+點(diǎn)按組在造模后第4天介入點(diǎn)按手法，各組在相同環(huán)境及條件下正常喂養(yǎng)。

點(diǎn)按手法操作及取穴：先將大鼠固定，適應(yīng)環(huán)境15 min。用手握空拳，拇指伸直并緊貼于食指中節(jié)的橈側(cè)面，以拇指端為力點(diǎn)緊貼于大鼠術(shù)側(cè)“委中穴”(后肢腘橫紋中央)，用力要由輕到重(最大8 N)，穩(wěn)而持續(xù)，至最大力時(shí)維持并停留3 s，后緩慢瀉力，為1遍，重復(fù)10遍為1組。忌用暴力。為規(guī)范手法刺激量，采用拇指帶上無(wú)線觸覺力按摩指套進(jìn)行手法操作，可實(shí)時(shí)顯示作用力大小，控制力度最大為8 N，每天1組，連續(xù)干預(yù)18 d。

1.2.4蛋白免疫印跡(Western-blot)方法 干預(yù)完成后第2天，每組取10只大鼠斷頭處死，立即置于冰上，快速取出L4～L5背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)，置于離心管中，稱體質(zhì)量。經(jīng)組織裂解，超聲粉碎、勻漿、離心、取上清，依BCA蛋白定量法檢測(cè)各組蛋白濃度。

蛋白電泳：按順序安裝好轉(zhuǎn)膜裝置，排出氣泡，轉(zhuǎn)膜，染色，漂洗，標(biāo)記Marker位置，除染色，抗原抗體反應(yīng)及顯色(兔抗P2X3一抗，山羊抗兔二抗)，洗膜，膜片條帶掃描及分析，圖像采用Smart view分析軟件得出條帶密度值。

2 結(jié) 果

2.1大鼠觸誘發(fā)痛指標(biāo)結(jié)果 造模后，與空白組和假手術(shù)組比較，模型組和造模+點(diǎn)按組大鼠的觸誘發(fā)痛在術(shù)后即開始下降(P<0.01)，表明存在痛覺過敏現(xiàn)象。點(diǎn)按手法干預(yù)后，與模型組比較，造模+點(diǎn)按組大鼠的觸誘發(fā)痛在術(shù)后1～7 d無(wú)明顯差別，至術(shù)后14 d開始上升，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，至21 d差別更為明顯(P<0.01，表1，圖1)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)觸誘發(fā)痛von Frey測(cè)試結(jié)果

2.2大鼠DRG中PKC及P2X3的表達(dá)情況 與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠DRG中PKC及P2X3的表達(dá)水平差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；推拿手法干預(yù)后，造模+點(diǎn)按組大鼠DRG中的PKC表達(dá)水平低于模型組[差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)],高于空白組和假手術(shù)組[差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)];P2X3受體的表達(dá)水平低于模型組(P<0.01)，高于空白組和假手術(shù)組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

3 討 論

NP表現(xiàn)為慢性的自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、異常疼痛和感覺異常等臨床特征[3,9]，從外周痛覺感受器到DRG再到脊髓上行至更高級(jí)的疼痛中樞，這個(gè)通路上任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會(huì)導(dǎo)致疼痛信號(hào)傳導(dǎo)異常。信號(hào)異常放大則引起疼痛過敏，相反則出現(xiàn)疼痛減退。

DRG細(xì)胞作為疼痛信號(hào)傳遞的中轉(zhuǎn)站，在疼痛信息傳遞和整合過程中發(fā)揮著重要作用[10-11]。DRG細(xì)胞的離子通道功能改變，可導(dǎo)致初級(jí)傷害感受性神經(jīng)元的敏感性和興奮性增加，引起中樞敏化[12]。P2X3受體是一個(gè)對(duì)PKC調(diào)整敏感的表型開關(guān)，在DRG細(xì)胞中PKC信號(hào)傳遞途徑可導(dǎo)致神經(jīng)元表面的P2X3受體激活，受體的活性和表達(dá)上調(diào)可引發(fā)一系列反應(yīng)，是外周和中樞痛敏形成的病理基礎(chǔ)[10-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，造模組大鼠DRG中的PKC和P2X3的表達(dá)水平較空白組和假手術(shù)組增高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示坐骨神經(jīng)CCI模型大鼠DRG細(xì)胞中存在PKC和P2X3過表達(dá)，證實(shí)PKC及P2X3與NP相關(guān)。通過推拿手法干預(yù)后，PKC表達(dá)水平(P<0.05)及P2X3受體的表達(dá)水平(P<0.01)均下降。筆者推測(cè)，推拿手法可能抑制DRG細(xì)胞中PKC表達(dá)及介導(dǎo)P2X3受體表達(dá)，抑制離子通道功能，降低DRG對(duì)于疼痛的敏感性和興奮性，從而降低傳遞效能，使疼痛信號(hào)上行傳遞抑制或中斷，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

中醫(yī)推拿在治療慢性疼痛方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，而推拿手法在神經(jīng)信號(hào)通路方面如何發(fā)揮作用值得研究。本研究通過點(diǎn)按法干預(yù)CCI模型大鼠，證實(shí)DRG神經(jīng)元PKC-P2X3通路與NP相關(guān)。與假手術(shù)組及空白組比較，CCI模型大鼠的DRG細(xì)胞存在PKC和P2X3過表達(dá)，推拿手法干預(yù)可抑制CCI模型大鼠DRG中PKC及P2X3的表達(dá)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。