多波長(zhǎng)HPLC結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的漳州陳皮炮制品質(zhì)量比較研究

陳育青， 朱善嵐， 黃紅宣， 楊成梓 ， 呂大偉, 王小平

陳皮(Citri Reticulatae Pericarpium)別稱(chēng)橘皮，為蕓香科植物橘Citrus Reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果實(shí)的果皮，最早記載見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、辛，性溫，歸肺、脾經(jīng)，其功效為理氣健脾，燥濕化痰，主治脘腹脹滿，食少吐瀉、咳嗽痰多等癥[1]。陳皮主要含有黃酮和揮發(fā)油兩類(lèi)成分，具有抗炎、保肝、降壓、降血脂、抗氧化等作用。橙皮苷、川橙皮素、橙皮素和柚皮苷等為陳皮黃酮類(lèi)的主成分，其中前3種是陳皮重要的活性成分，含量較高，具有較強(qiáng)的抗氧化和抗癌活性[2-6]。陳皮炮制有炒制、醋炙、焙制、麩制、黑豆制、鹽炙、制炭、巴豆炒、酒浸、米泔水浸、熬法制、米制、米炒、面炒、姜汁炒、童便制、土炒、香附炒制、蜜炙等20種方法[7]?！陡＝ㄊ≈兴幣谥埔?guī)范》(2012年版)收載生品、鹽制、制陳皮。2015年版《中華人民共和國(guó)國(guó)藥典》陳皮僅收載生品入藥。

福建省漳州市作為閩南中藥炮制技術(shù)的代表，有著悠久的歷史。《漳州市常用中藥加工炮制法》中收載四制陳皮，炮制技術(shù)獨(dú)特，具有閩南特色。漳州四制陳皮分別采用甘草水、醋、姜、鹽等四種輔料炮制，其中甘草水制治火痰、姜汁炙治寒痰、鹽炙治燥痰、醋炙治郁痰；經(jīng)四制后可引藥入肝、下焦，且使其溫而不燥，不僅增強(qiáng)其理氣開(kāi)胃、降氣化痰作用，同時(shí)兼具行氣解郁之功[8]。不同炮制品陳皮功效有所側(cè)重，如麩炒陳皮側(cè)重醒脾溫胃，土炒陳皮側(cè)重化痰止嘔。本研究采用多波長(zhǎng)高效液相色譜法測(cè)定四制陳皮、蒸陳皮、生品陳皮等不同炮制方法中橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的含量，對(duì)不同炮制品陳皮黃酮類(lèi)成分含量差異性進(jìn)行比較，闡明漳州四制陳皮的品質(zhì)特色，為后續(xù)炮制工藝及炮制原理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：MUST-18032502)、橙皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：MUST-18040804)和川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：MUST-18042205)均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。HPLC用乙腈為色譜純，其余試劑皆為分析純。

1.1.2儀器 高效液相色譜儀(Agilent1260，美國(guó)安捷倫公司)，電子分析天平(AB265-S型，瑞士梅特勒-托利多公司)，精密型超純水機(jī)(FST-Ⅲ-10，上海富詩(shī)特公司)和超聲波清洗器(KQ5200，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1炮制樣品制備

1.2.1.1四制陳皮的制備 生陳皮購(gòu)自福建漳州市長(zhǎng)泰縣，經(jīng)筆者醫(yī)院中藥教研室鑒定為蕓香科植物橘Citrus Reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。原藥揀去雜質(zhì)洗凈，曬干。按每100 kg陳皮配甘草5 kg、生姜5 kg、食鹽5 kg和醋5 kg，四味煎湯去渣，投入凈陳皮熬至藥湯吸盡為度，撈起曬干即成[8]。

1.2.1.2其他陳皮炮制樣品制備 蒸陳皮：取陳皮，除去雜質(zhì)，濕潤(rùn)后，蒸透，取出，切絲，低溫干燥[9]。炒陳皮：取凈陳皮絲，文火炒至深黃色，取出，放涼[10]。麩炒陳皮：取凈陳皮絲，用麩皮拌炒至內(nèi)表面呈黃色，篩去麩皮晾干[11]。土炒陳皮：將鍋用文火加熱，放入灶心土細(xì)粉，待翻動(dòng)土粉呈較輕松狀態(tài)時(shí)，倒入凈陳皮絲，翻炒至表面掛勻土粉，微帶焦斑時(shí)，及時(shí)取出，篩去土粉，晾干[12]。蜜陳皮：每100 kg 陳皮用煉蜜19 kg[13]，取煉蜜加適量開(kāi)水稀釋?zhuān)尤雰絷惼ぐ鑴?，悶透，置鍋?nèi)，用文火加熱，炒至老黃色不粘手時(shí)，出鍋，晾干。鹽陳皮：凈陳皮100 kg，用食鹽3 kg[14]，將食鹽加適量水化開(kāi)，倒入凈陳皮拌勻，稍悶潤(rùn)，置鍋內(nèi)，用文火加熱炒至色澤變深，出鍋，晾干。醋陳皮：每1 kg陳皮飲片用醋200 g[15]，取陳皮飲片，置容器內(nèi)，加醋拌勻，悶潤(rùn)，吸盡，用文火炒至外表面呈黃褐色至棕褐色，略有焦斑，取出，晾干(性狀特征見(jiàn)表1)。

1.2.2溶液配制

1.2.2.1混合對(duì)照品溶液的配制 以甲醇為溶劑，按每毫升含195 μg橙皮苷、185 μg橙皮素和198 μg川陳皮素配制混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

1.2.2.2供試品溶液的配制 分別取不同炮制品陳皮適量，粉碎后過(guò)60目，稱(chēng)取各粉末0.5 g，加甲醇定容至50 mL，密封，超聲處理30 min(200 W功率和40 kHz頻率)，置冷，混勻后過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.2.3色譜條件 色譜柱：Inertsustain C18柱(5 μm，4.6×150 mm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸水-乙腈溶液，梯度洗脫(0～6 min：23% C→28% C，6～19 min：28% C→35% C，19～30 min：35% C→45% C)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm(0～6 min，橙皮苷)、283 nm(6～19 min，橙皮素)、334 nm(19～30 min，川陳皮素)；柱溫：35 ℃。

表1 陳皮不同炮制品性狀特征及炮制依據(jù)

2 結(jié) 果

2.1測(cè)定 取混合對(duì)照品溶液適當(dāng)稀釋?zhuān)謩e吸取稀釋液與供試品溶液20 μL，注入色譜儀進(jìn)行分析，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1。在該色譜條件下，橙皮苷、橙皮素和川陳皮素的保留時(shí)間分別為5.133，16.758，25.546 min，與相鄰色譜峰均能達(dá)到基線分離，峰形良好，且保留時(shí)間與色譜分析時(shí)間適宜。生陳皮與炮制品陳皮的指紋圖譜區(qū)別明顯，表明其成分發(fā)生改變。四制陳皮在保留時(shí)間7～9 min時(shí)間段，3個(gè)色譜峰消失；陳皮生品在保留時(shí)間12～13 min 時(shí)間段有2個(gè)色譜峰，其余炮制品均未見(jiàn)色譜峰；僅四制陳皮、蒸陳皮、清炒陳皮、土炒陳皮檢出橙皮素色譜峰，但后三者峰信號(hào)極弱。

2.2線性關(guān)系分析 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下各混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇進(jìn)行逐次稀釋?zhuān)玫较盗袧舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)工作溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)分析，以樣品濃度X(mg/g)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：

橙皮苷：Y=143 866X-9 876，r2=0.999 6

橙皮素：Y=562 973X+7 661，r2=0.999 9

川陳皮素：Y=388 335X-22 709，r2=0.999 7

結(jié)果表明，橙皮苷在1.950～78.00 mg/g、橙皮素在0.370～14.80 mg/g、川陳皮素在0.396～15.84 mg/g 范圍內(nèi)樣品濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3精密度試驗(yàn) 量取20 μL相同濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)5次。色譜圖記錄結(jié)果顯示橙皮苷、橙皮素和川陳皮素峰面積的RSD分別為0.61%，0.58%及0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取四制陳皮樣品0.5 g，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫放置0，2，4，8，16 和24 h后分別取樣測(cè)定，結(jié)果顯示橙皮苷、橙皮素和川陳皮素峰面積的RSD分別為0.77%，0.95%和0.82%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取四制陳皮樣品0.5 g 5份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果按干燥品計(jì)算，樣品中橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為77.022 mg/g(RSD=1.87%),0.434 mg/g(RSD=2.63%)和6.684 mg/g(RSD=2.00%)。

2.6加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取已知含量的四制陳皮樣品0.25 g，共 6份，每份分別精密加入每1 mL含橙皮苷、橙皮素和川陳皮素為9.75，185和1.98 mg的混合對(duì)照品溶液1 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果表明，橙皮苷、橙皮素和川陳皮素平均回收率分別為97.82%(RSD=1.94%)，101.59%(RSD=1.87%)和98.83%(RSD=1.81%)。

2.7樣品含量測(cè)定 分別精密稱(chēng)取不同炮制方法陳皮樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，依法測(cè)定。用外標(biāo)法，按干燥品計(jì)算樣品中橙皮苷、橙皮素和川陳皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同陳皮炮制品中橙皮苷、橙皮素、川陳皮素含量測(cè)定

由表2可知，不同炮制品中橙皮苷的含量有差異，依含量高低依次為：四制陳皮>蒸陳皮>麩炒陳皮>炒陳皮>醋陳皮>蜜陳皮>陳皮生品>土炒陳皮>鹽陳皮。其中，四制陳皮橙皮苷含量明顯高于其他炮制品，且只有四制陳皮檢測(cè)到橙皮素的含量。

2.8化學(xué)模式識(shí)別分析

2.8.1系統(tǒng)聚類(lèi)分析 將各樣品化學(xué)物質(zhì)含量相對(duì)于稱(chēng)樣量量化，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析[16]。9個(gè)樣品基本可分為3大類(lèi)(圖2)，S1聚為第1類(lèi)，S2聚為第2類(lèi)，S3～S9聚為第3類(lèi)。

2.8.2樣品主成分分析 分別將9個(gè)樣品色譜峰信息輸入Excel 表格內(nèi)，得到樣品個(gè)數(shù)×各峰面積數(shù)的數(shù)據(jù)矩陣，采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行PCA分析[17-18](圖3)。結(jié)果顯示9個(gè)樣品大致可分3組，與系統(tǒng)聚類(lèi)分析結(jié)果相一致。

2.8.3偏最小二乘法-判別分析 分別將9個(gè)樣品峰面積信息輸入Excel 表格內(nèi)，得到樣品個(gè)數(shù)×各峰面積數(shù)的數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中進(jìn)行PLS-DA模型擬合，使用Ctr換算的數(shù)據(jù)標(biāo)度方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[19-20]。圖4為生成差異性標(biāo)記物的變量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)，其中VIP>1的成分6個(gè)，其影響大小依次為色譜峰P3(橙皮苷)、P21、P22、P20、P23(川陳皮素)、P15(橙皮素)，表明以上成分是不同陳皮炮制品之間成分差異的主要標(biāo)記物，對(duì)陳皮質(zhì)量差異有較大的影響。

3 討 論

本研究采用多波長(zhǎng)HPLC檢測(cè)方法，利用二極管陣列檢測(cè)器的時(shí)間波長(zhǎng)程序的特點(diǎn)，使檢測(cè)波長(zhǎng)隨時(shí)間變化而變化，可實(shí)現(xiàn)在各自最佳波長(zhǎng)條件下多指標(biāo)成分，多波長(zhǎng)單行檢測(cè)，獲得與單一波長(zhǎng)分析相似效果。該方法具有操作簡(jiǎn)便和穩(wěn)定可靠的優(yōu)勢(shì)。

陳皮的成分復(fù)雜，其功效亦多樣。2015年版《中國(guó)藥典》一部主要以含量較高的橙皮苷作為陳皮的檢測(cè)指標(biāo)，不足以體現(xiàn)陳皮的多成分和多功效等特點(diǎn)。僅以測(cè)定單一成分作為質(zhì)控，也難以較好地鑒定陳皮的內(nèi)在質(zhì)量。因此，建立以多成分指標(biāo)的含量測(cè)定為主的陳皮質(zhì)量檢測(cè)方法體系，顯得更為科學(xué)可靠[2]。本研究基于多波長(zhǎng)HPLC檢測(cè)以及化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)分析，建立閩南漳州陳皮生品與炮制品的質(zhì)量檢測(cè)方法體系，明確樣品間的歸類(lèi)屬性，3種化學(xué)模式識(shí)別方法(HCA、PCA和PLS-DA分類(lèi)模型)結(jié)果一致，均可鑒別陳皮生品與炮制品。本研究結(jié)果也表明陳皮生品與炮制品之間存在明顯的差異，而且經(jīng) PLS-DA 篩選到陳皮6個(gè)主要差異性成分，鑒別其中3個(gè)成分(橙皮苷、橙皮素和川陳皮素)，為多角度控制該藥材質(zhì)量提供可靠數(shù)據(jù)。

黃酮類(lèi)成分是陳皮的一大類(lèi)活性成分，具有多樣性藥效，比如抗氧化、抗變態(tài)性反應(yīng)、抗炎癥、降血脂和保護(hù)心血管以及抗腫瘤等功效[21]。2015年版《中國(guó)藥典》陳皮為陳皮生品，以橙皮苷含量作為評(píng)價(jià)陳皮質(zhì)量的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，陳皮經(jīng)炮制后黃酮類(lèi)成分有差異，四制陳皮、蒸陳皮、麩炒陳皮、炒陳皮、醋陳皮炮制后的黃酮類(lèi)成分含量比生品陳皮的高?！帮嬈胨?，生熟異用”是中醫(yī)臨床的用藥特點(diǎn)，不同炮制方法對(duì)中藥藥性和藥效產(chǎn)生著不同的影響。陳皮不同炮制品在中醫(yī)的不同處方中發(fā)揮著不同的藥效。本研究表明，閩南漳州四制陳皮橙皮苷含量明顯高于生陳皮和其他陳皮炮制品，且檢測(cè)出橙皮素成分；生陳皮和其余7種陳皮炮制品未檢出橙皮素成分。橙皮素為一種二氫黃酮，是橙皮苷的苷元。橙皮苷為大分子化合物，其生物利用度較低，轉(zhuǎn)化為苷元橙皮素后，可極大提升其生物利用度，更易于體內(nèi)吸收。近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)，橙皮素具有抗阿爾茨海默病、抗帕金森病、抗纖維化等作用[22]，這與閩南漳州四制陳皮取其降氣、化痰、解郁之功一致。由此說(shuō)明閩南漳州四制陳皮的炮制方法具有很好的品質(zhì)特色，值得傳承與推廣。橙皮素的產(chǎn)生可能與炮制過(guò)程中經(jīng)過(guò)高溫與輔料共同作用所致，后續(xù)還將進(jìn)一步深入研究。

本研究運(yùn)用現(xiàn)代手段分析陳皮不同炮制方法中黃酮類(lèi)成分存在的差異，闡述了閩南漳州四制陳皮在工藝和成分上的品質(zhì)特色，為后續(xù)探討炮制工藝和臨床用藥提供依據(jù)，同時(shí)對(duì)保護(hù)和傳承閩南地區(qū)傳統(tǒng)炮制技術(shù)具有深遠(yuǎn)的意義。