3種不同染色方法對(duì)肺組織彈力纖維染色效果的影響

王鵬程， 陳林鶯， 翁丹楓， 張 聲， 李國(guó)平

彈力纖維是結(jié)締組織中重要的纖維之一，其主要的化學(xué)組成為彈性蛋白，彈性蛋白提供了彈力纖維的彈性。彈力纖維廣泛分布于身體的各器官及組織，主要存在于肺、心臟、血管、皮膚等部位中，富有彈性，極難溶解，新鮮時(shí)呈黃色，折光性強(qiáng)，常規(guī)H-E染色下呈現(xiàn)不同程度的紅色，不易與膠原纖維等組織區(qū)分，只有用特殊染色方法才能清楚顯示[1-2]。彈力纖維的染色方法較多，操作繁簡(jiǎn)不一，染色結(jié)果參差不齊，筆者所在科室經(jīng)過(guò)多年實(shí)踐，積累了一些染色經(jīng)驗(yàn)。現(xiàn)將Gomori醛復(fù)紅法進(jìn)行改良，并與Verhoeff鐵蘇木精法和Weigert間苯二酚復(fù)紅法進(jìn)行比較[3]，旨有探討改良Gomori醛復(fù)紅法在肺組織彈力纖維染色的應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1材料 收集送檢的住院手術(shù)患者的肺組織30例，均用體積分?jǐn)?shù)為4%中性緩沖甲醛液固定(pH=7.2)，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片。

1.2主要試劑

1.2.1Verhoeff鐵蘇木精液 (1)蘇木精5 g充分溶于100 mL無(wú)水乙醇；(2)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化鐵：氯化鐵10 g充分溶于100 mL蒸餾水；(3)Lugol碘液；碘1 g和碘酸鉀2 g充分溶于100 mL蒸餾水。取上述3種溶液各20，8，8 mL混勻得到Verhoeff工作液。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的三氯化鐵：三氯化鐵2 g充分溶于100 mL蒸餾水。

1.2.2Weigert間苯二酚復(fù)紅液 在100 mL蒸餾水中分別加入堿性品紅1 g、間苯二酚2 g，加熱煮沸，再緩慢加入12.5 mL 30%三氯化鐵，繼續(xù)加熱煮沸5 min，冷卻后過(guò)濾，將沉淀物溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，最后加入2 mL濃鹽酸。

1.3方法

1.3.1Verhoeff鐵蘇木精法 石蠟切片脫蠟至水；Verhoeff工作液染30 min，蒸餾水快速?zèng)_洗；2%氯化鐵分化至彈力纖維呈黑色，背景呈灰色，蒸餾水快速?zèng)_洗；95%乙醇快速?zèng)_洗，用Van Gieson液復(fù)染30 s，濾紙吸干多余的染液；梯度乙醇快速脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。

1.3.2Weigert間苯二酚復(fù)紅法 石蠟切片脫蠟至水；95%乙醇2 min；Weigert間苯二酚復(fù)紅液1～2 h；直接用95%乙醇洗去多余的染液至無(wú)余色脫下，蒸餾水沖洗；用Van Gieson液復(fù)染30 s，用濾紙吸干多余的染液；梯度乙醇快速脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。

1.3.3改良Gomori醛復(fù)紅法 石蠟切片脫蠟至水；用酸性高錳酸鉀氧化5 min，蒸餾水稍洗；2%草酸漂白1 min，流水沖洗5 min；70%乙醇稍洗；用Gomori醛復(fù)紅液染色15～20 min，用70%乙醇浸洗2次，至切片不再脫色為止，蒸餾水稍洗；用1%亮綠復(fù)染1 min，蒸餾水稍洗；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。

1.4結(jié)果判讀 組織學(xué)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)采取單盲法，由3位高年資病理醫(yī)師審核具體評(píng)分(表1)。

表1 組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件分析數(shù)據(jù)。兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

Verhoeff鐵蘇木精法彈力纖維呈黑色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細(xì)胞呈黃色；Weigert間苯二酚復(fù)紅法彈力纖維呈棕色，膠原纖維呈紅色，肌纖維和紅細(xì)胞呈黃色；改良Gomori醛復(fù)紅法彈力纖維呈深紫色，背景呈綠色。將3種彈力纖維染色結(jié)果兩兩比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。改良Gomori醛復(fù)紅法較其他兩種方法操作簡(jiǎn)單，定位準(zhǔn)確，背景清晰，對(duì)比更明顯(圖1，2)。

本研究中3種方法的染色積分情況分別為(9.87±2.63)，(5.35±1.26)和(6.28±2.13)，進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示改良Gomori醛復(fù)紅法的得分明顯高于其他兩組(P=0.009, 0.012)。

3 討 論

病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)在病理診斷中具有舉足輕重的作用，已然成為診療疾病和判斷預(yù)后不可或缺的檢查手段之一。彈力纖維主要存在于皮膚、氣管、支氣管、肺泡、心血管、韌帶等處，彈力纖維染色可用于判斷組織中彈力纖維是否存在增生或者斷裂，具有重要的病理診斷以及鑒別診斷意義[4]。彈力纖維對(duì)肺組織中的細(xì)支氣管和肺泡壁具有支撐作用，為此，彈力纖維染色常用于一些呼吸系統(tǒng)疾病的鑒別診斷，比如支氣管擴(kuò)張、肺氣腫、肺纖維化中彈力纖維蛋白的差異具有不同表現(xiàn)。此外，彈力纖維染色還有助于判斷是否侵犯臟層胸膜，用于區(qū)分原位癌與浸潤(rùn)癌。由于常規(guī)的H-E染色中細(xì)胞間質(zhì)均呈不同程度的粉紅色至紅色，不易與其他纖維組織區(qū)分開(kāi)來(lái)，往往需要采用特殊的染色方法才能更好地確定彈力纖維變化情況[5]。

彈力纖維的染色方法眾多，有醛復(fù)紅法、間苯二酚堿性品紅法、地衣紅法、稀釋間苯二酚堿性品紅法、維多利亞藍(lán)法、鐵碘蘇木精法等，部分方法染色需要較長(zhǎng)時(shí)間，有的甚至需要過(guò)夜，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，不宜在臨床工作中應(yīng)用，常規(guī)的病理檢驗(yàn)常采用醛復(fù)紅染色方法[6-8]。筆者所在科室經(jīng)過(guò)多年實(shí)踐積累，對(duì)肺組織彈力纖維染色有了一定的認(rèn)識(shí)和體會(huì)，對(duì)Gomori醛復(fù)紅染色方法進(jìn)行了改良，并與Verhoeff鐵蘇木精法和Weigert間苯二酚復(fù)紅法進(jìn)行比較。改良Gomori醛復(fù)紅法中醛復(fù)紅對(duì)特殊的蛋白及含硫酸根的黏多糖有很強(qiáng)的親和力，與彈性蛋白結(jié)合牢固，同時(shí)改用酸性高錳酸鉀氧化后，其氧化能力明顯增強(qiáng)，比傳統(tǒng)醛復(fù)紅法中的Lugol碘液更強(qiáng)，可明顯提高耐酸纖維及前彈力纖維的染色效果[9-11]。高錳酸鉀見(jiàn)光易分解變質(zhì)，宜用棕色試劑瓶保存。醛復(fù)紅液的配制相對(duì)簡(jiǎn)單，1～2 d即可成熟，成熟后過(guò)濾至試劑瓶中放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用時(shí)恢復(fù)至室溫染15～20 min(冬季可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間)。Verhoeff鐵蘇木精法是彈力纖維經(jīng)典的染色方法之一，雖該法操作簡(jiǎn)單、染色時(shí)間相對(duì)較短、不易褪色、粗纖維著色較深，但是較細(xì)的兩種纖維染色相對(duì)差，鐵碘蘇木精配制較繁瑣，染色沒(méi)有選擇性，細(xì)胞核和膠原纖維也可以有不同程度的著色，且分化程度不易掌握和判斷，需在顯微鏡下進(jìn)行控制[12-13]。Weigert間苯二酚復(fù)紅法對(duì)于較細(xì)的彈力纖維染色不明顯，對(duì)比不清晰，而且Weigert間苯二酚復(fù)紅法中間苯二酚堿性品紅液配制相對(duì)復(fù)雜，需要加熱，所需試劑種類較多，相較其他兩種方法染色時(shí)間更長(zhǎng)，需1～2 h，初學(xué)者不易掌握。改良Gomori醛復(fù)紅染色液是堿性品紅加入三聚乙醛和鹽酸配制而成的，鹽酸是酸性催化劑，可使三聚乙醛解聚產(chǎn)生乙醛，具有更高活性的乙醛與堿性品紅染料的氨基發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生偶氮甲堿，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭仙?，說(shuō)明染液已成熟。成熟的染液對(duì)特定的蛋白及含硫酸根的黏多糖具有很強(qiáng)的親和力，可與彈力纖維緊密結(jié)合。3種方法雖然均能染出肺組織彈力纖維，但從染色方法及效果可以看出，改良Gomori醛復(fù)紅染色法能夠較好地染出肺組織彈力纖維的形態(tài)變化，而且操作簡(jiǎn)單，背景干凈，對(duì)比明顯，易于觀察，是目前肺組織彈力纖維最佳的染色方法。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，改良Gomori醛復(fù)紅法應(yīng)注意醛復(fù)紅液為70%乙醇配制，在實(shí)際的染色操作中需注意防止干片，最好采用油性筆畫(huà)線、放入濕的孵育盒或者浸染，70%乙醇分化至肉眼下無(wú)色為止，不可過(guò)度分化，防止彈力纖維褪色，必要時(shí)在顯微鏡下控制分化效果。由于Weigert間苯二酚復(fù)紅法用Van Gieson液復(fù)染時(shí)間比較短，不易掌握，很容易過(guò)染而覆蓋彈力纖維的顏色，黃色和棕色對(duì)比不明顯，且Van Gieson液復(fù)染后易褪色，不利于切片的保存，給回顧性研究造成困難。改良Gomori醛復(fù)紅法改用亮綠復(fù)染，時(shí)間稍長(zhǎng)，比較容易控制，綠色和紫色對(duì)比更明顯，且亮綠不易褪色，保存時(shí)間久，但亮綠也要淡染，不可因染色過(guò)度而覆蓋彈力纖維染色，從而影響觀察及對(duì)比[14-16]。操作過(guò)程中也不能忽視常規(guī)H-E染色或者其他檢查的重要性，只有在觀察H-E染色后懷疑彈力纖維病變或者某些診斷需要輔助診斷時(shí)才做該染色加以證明。

筆者認(rèn)為，改良后的Gomori醛復(fù)紅方法操作簡(jiǎn)單，背景清晰，對(duì)比明顯，結(jié)果可靠，是目前肺組織彈力纖維染色最佳的染色方法，值得在臨床病理工作中推廣應(yīng)用。