金匱腎氣丸對伊馬替尼所致小鼠生殖毒性及其在血、睪中含量影響研究

朱思晗 王玲玲 陳曉霞 常曉慧

【摘 要】 目的：觀察金匱腎氣丸（JIN）對伊馬替尼（imatinib）所致雄性小鼠生殖毒性的拮抗作用，采用液質聯(lián)用技術測定其對伊馬替尼在小鼠血液及睪丸中含量影響，研究其存效減毒可能作用機制。方法：將70只健康雄性昆明小鼠隨機分為對照組（Cont），伊馬替尼低、中、高劑量染毒組，金匱腎氣丸低、中、高劑量拮抗組;染毒組和拮抗組小鼠分別給予66.70、100.00、133.33mg/（kg·d）的伊馬替尼溶液，1次/d，每周6d，連續(xù)8周;拮抗組小鼠給予伊馬替尼的同時，分別給予660.00、1330.00、2670.00 mg/（kg·d）金匱腎氣丸水溶液，1次/d，每周6d，8周后頸脫位法處死小鼠，計算小鼠睪丸臟器系數(shù)及精子數(shù)量，采用液質聯(lián)用技術測定小鼠血液及睪丸組織中伊馬替尼濃度。結果：H-IM組睪丸系數(shù)下降趨勢明顯，提示伊馬替尼高劑量組毒性較強，使睪丸相對重量下降，而經(jīng)金匱腎氣丸治療后，睪丸系數(shù)均有上升趨勢，差異無統(tǒng)計學意義P>0.05）;與Cont組比較，染毒低、中、高組小鼠精子數(shù)量均有減少，同劑量金匱腎氣丸與伊馬替尼聯(lián)合用藥組與伊馬替尼組相比，均能顯著性增加精子數(shù)量，差異有統(tǒng)計學意義P<0.01）;各給藥組中M-IM組小鼠血液中伊馬替尼含量最高，聯(lián)合金匱腎氣丸用藥后，各組小鼠血液中伊馬替尼濃度均有所增加，僅見M-IM組與M-IM+JIN組血液中伊馬替尼含量有顯著性差異P<0.05）;各給藥組精液中均能檢測到伊馬替尼，其中M-IM組與M-IM+JIN組藥物含量有統(tǒng)計學差異P<0.01），且聯(lián)合用藥后，中劑量組小鼠精液中伊馬替尼濃度有所降低。結論：伊馬替尼染毒對小鼠有生殖毒性作用，金匱腎氣丸可通過降低小鼠睪丸中伊馬替尼含量，拮抗其所致生殖毒性，其作用機制有待進一步研究。

【關鍵詞】 伊馬替尼;金匱腎氣丸;生殖毒性;拮抗作用

【中圖分類號】R284?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）20-0010-06

Effect of Jinkui Shenqi Pill on Reproductive Toxicity of Imatinib-induced Mice and Its Content in Blood and Bletilla Striata

ZHU Sihan WANG Lingling CHEN Xiaoxia CHANG Xiaohui

1.Liaoning University of TCM，Dalian 116600，China;

2.Liberation Army Joint Support Unit 967，Dalian 110000，China

Abstract：Objective To observe the antagonistic effect of Jinkui Shenqi Pill on reproductive toxicity of imatinib induced male mice，the effect of imatinib in blood and testis content in mice was determined by liquid-mass spectrometry.Methods 70 healthy male Kunming mice were divided randomly into low、medium and high dose imatinib groups;low、medium and high antagonistic groups of Jinkui Shenqi Pill and control group.Imatinib groups of mice were given? imatinib solution by gavage with the concentration of 66.70、100.00、133.33 mg/ （kg·d）once a day for 6 days a week continuously;The antagonistic groups mice were given with Jinkui Shenqi Pill solution by gavage with the concentration of 660.00、1330.00、2670.00 mg/ （kg·d）once a day for 6 days a week continuously.After medication with 8 weeks，mice were put to death and calculating mice testicular viscera and counting the number of sperm，determination of imatinib in mouse blood and left testicular tissue by liquid-mass spectrometry.Results Testicular viscera?? decreased in H-IM group indicated that toxicity of imatinib was stronger in high dose group，drop the relative weight of the testicles，after treatment of Jinkui Shenqi Pill，the testicular viscera all increased，there were no significant differencesP>0.05）;Compared with the control group，the sperm count of mice with low，medium and high toxicity was decreased;Compared with imatinib group in the same dose of Jinkui Shenqi pills and imatinib combination，all significantly increased sperm count，there were significant differencesP<0.01）;Imatinib levels were highest in the blood of M-IM groups in each group，there was only significant difference in imatinib in blood between M-IM and M-IM JIN groupsP<0.05）;Imatinib was detected in semen of each administration group，M-IM group and M-IM JIN group were significant differencesP<0.01）.The concentration of imatinib in semen of mice in medium dose group was decreased after administration by Jingkui Shenqi pills.Conclusion Imatinib has reproductive toxicity in mice，and Jinkui Shenqi Pill can antagonize the reproductive toxicity induced by imatinib.

Keywords：Imatinib;Jinkui Shenqi Pills;Reproductive Toxicity;Antagonism

慢性粒細胞白血?。–hronic Myelogenous Leukemia，CML）是一種較為常見的，由于骨髓造血干細胞異常克隆所產(chǎn)生的血液性疾病。由于t（9;22）（q32;q21）易位（Ph′染色體），形成 Bcr-Abl 融合基因，繼而編碼融合蛋白p210 Bcr-Abl，其酪氨酸激酶活性被異常激活，產(chǎn)生持續(xù)的細胞增殖信號致白血病發(fā)生[1-2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，各種新型的治療藥物相繼產(chǎn)生，對于治療慢性粒細胞白血病起著重要作用[3]。其中，伊馬替尼可以和Abl酪氨酸激酶ATP的結合位點特異性結合，進而隔絕ATP與Abl結合，避免Abl誘導細胞增生所需能量[4]，成為了臨床治療慢粒的主要藥物之一。而隨著CML的發(fā)病年齡要比以往流行病學調查的平均發(fā)病年齡略低趨勢，患有CML的年輕人數(shù)量正逐漸增多。有大宗病例報道顯示，女性患者服用酪氨酸激酶抑制劑（TKI）期間意外妊娠者絕大部分在發(fā)現(xiàn)懷孕后停藥后，有近10%的畸胎率[5]。因此，伊馬替尼對CML患者生育和生殖的影響，成為臨床醫(yī)生及CML患者共同關注的問題。課題組前期研究表明，伊馬替尼可對男性產(chǎn)生生殖毒性，本課題組在前期研究基礎上[6]，對伊馬替尼所致的男性生殖毒性進行分析，發(fā)現(xiàn)臨床有些病例出現(xiàn)了水鈉潴留、陽虛畏冷癥狀，故在中醫(yī)藏象學說“腎主生殖 ”理論指導下，選擇了經(jīng)典方劑中具有補腎陽，化氣行水的金匱腎氣丸，與伊馬替尼共同口服給予小鼠，來研究其對伊馬替尼引起雄性小鼠生殖毒性拮抗作用，為臨床上符合陽虛癥狀服用伊馬替尼的慢粒男性患者采用中成藥金匱腎氣丸降低副作用，提高患者生活及生育質量提供理論支持。

金匱腎氣丸出自《金匱要略》，該方配伍嚴謹，療效顯著，被稱為“補腎諸方之祖”，深受歷代醫(yī)家推崇，至今仍在臨床上廣泛應用[7]。此方由附子、肉桂、熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、茯苓、澤瀉等組成，臨床觀察報道，金匱腎氣丸治療腎陽虛不育有效，并且能顯著改善氧化應激損傷，提高精液量、精子活動率及精子濃度等指標[8]。本研究通過實驗，觀察金匱腎氣丸拮抗伊馬替尼引起雄性小鼠生殖毒性的療效，報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 甲磺酸伊馬替尼（Novartis Pharma Schweiz AG，Switzerland H20100263）、金匱腎氣丸（北京同仁堂Z11021115）、伊馬替尼對照品（純度為 99.7%，中國食品藥品檢定研究院，批號分別為20140213）;乙腈（TEDIA，色譜純大連銘揚實驗試劑有限公司）、去離子水（娃哈哈有限公司）、其他試劑均為分析純;電子精密天平（上海貴虎實業(yè)發(fā)展有限公司）、光學顯微鏡（上海光學儀器廠）、細胞計數(shù)板（海德生物有限公司）、低溫離心機（鹽城市凱特實驗儀器有限公司）、島津UFLC液相色譜儀（日本島津公司）、ABSCIEXQTRAP 4500質譜檢測器（美國AB公司）。

1.2 方法

1.2.1 染毒方法 由遼寧長生生物制劑有限公司提供6～8周齡健康雄性昆明小鼠70只，合格證號：SCXK（遼）2010-001，體量（20±2）g，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（Cont），伊馬替尼低（L-IM）、中（M-IM）、高（H-IM）劑量染毒組，金匱腎氣丸低（L-IM+JIN）、中（M-IM+JIN）、高（H-IM+JIN）劑量拮抗組，每組10只;染毒組和拮抗組小鼠分別給予66.70、100.00、133.33 mg/（kg·d）0.3%CMC-Na伊馬替尼溶液，1次/d，每周6 d，連續(xù)8周;拮抗組小鼠給予0.3%CMC-Na伊馬替尼的同時，分別給予660.00、1330.00、2670.00 mg/（kg·d）金匱腎氣丸水溶液，1次/d，每周6 d，連續(xù)8周，給藥期間所有小鼠均自由飲食飲水。

1.2.2 樣品采集及臟器系數(shù) 小鼠末次給藥結束后1h，摘眼球取血，斷頸法處死，迅速摘取雙側睪丸，兩側睪丸稱重，計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=睪丸重量（g）/小鼠體質量（g）×100%，左側睪丸迅速凍存于-20 ℃冰箱，用于含量測定，右側睪丸用于精子數(shù)量測定。

1.2.3 精子數(shù)量 取右側睪丸少許，加1 mL 0.9%生理鹽水稀釋，精密吸取0.1 mL，放入血細胞計數(shù)板中，使精液自然流入計數(shù)板，計數(shù)中間5個方格的精子數(shù)，計數(shù)時每份精子用3個計數(shù)板重復計數(shù)3次，取3次均值。

1.2.4 各組小鼠血液及睪丸中伊馬替尼濃度檢測

1.2.4.1 質譜條件 為了提高方法的最佳靈敏度，優(yōu)化離子源為ESI源;源噴射電壓為3.5kV;加熱毛細管溫度為250℃;鞘氣（N2）壓力為80psi;輔助氣（N2）壓力為100psi;碰撞氣（Ar）壓力為20psi;正離子方式檢測;碰撞誘導解離（CID）電壓均為25eV;掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM）;用于定量分析的離子反應分別為m/z494.1→393.9（伊馬替尼）和m/z447.2→397.0（內標，氘4伊馬替尼）。

1.2.4.2 色譜條件 色譜柱為CAPCELLPAK- C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流動相由含有2 mM乙酸銨和0.05 %三氟乙酸（ TFA ）的去離子水（溶劑A ）和0.05 % TFA的MeOH /乙腈（ 1∶1，V / V ） （溶劑B ）組成，流速為0.1 mL/min;柱溫為45 ℃;進樣量：5 μL。

1.2.4.3 儲備液及工作溶液配制 精確稱取伊馬替尼對照品適量（相當于伊馬替尼20.0 mg），置于20 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得1.0 mg/mL的伊馬替尼儲備液，儲存于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｈ缓缶芰咳?.0 mg/mL的伊馬替尼儲備液50 μL，加入950 μL流動相，配成質量濃度為50 μg/mL的工作液。另配制質量濃度為1 μg/mL的內標甲醇溶液，備用。

1.2.4.4 血漿樣品的處理 取血漿50 μL置事先預備的加肝素抗凝EP管中，后加10 μL內標溶液（1 μg·mL-1）及200 μL甲醇溶液，漩渦振蕩2 min充分混合，4 ℃，12000 r/min條件下離心10 min，然后取上清液5 μL用于LC-MS/MS分析。

1.2.4.5 精液樣品的處理 取小鼠的一側睪丸用于伊馬替尼濃度測定，分離睪丸中的睪丸液，37°水浴30 min液化，3000 rpm離心15 min，取上清。后加10 μL內標溶液（1 μg·mL-1）及200 μL甲醇溶液，漩渦振蕩2 min充分混合，4 ℃，12000 r/min條件下離心10 min，然后取上清液5 μL用于LC-MS/MS分析。

1.2.4.6 標準曲線 取正常組血樣、睪丸液若干份，分別加入不同濃度的伊馬替尼標準溶液和內標溶液，制得濃度分別為1、12.5、25、50、100、250、500、1000 ng/mL的標準溶液。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 專屬性 按“1.2.4”項下試驗條件，分別測定6只不同小鼠空白血樣、空白血樣+伊馬替尼/內標物和給藥干預組小鼠血樣，結果表明，小鼠血樣組織中的內源性物質不干擾伊馬替尼和氘代伊馬替尼的測定，小鼠血樣中伊馬替尼和氘代伊馬替尼的保留時間分別為6.90 min和6.94 min，睪丸組織中伊馬替尼和氘代伊馬替尼的保留時間分別為6.63 min和6.61 min，方法具有較高的特異性。

1.2.5.2 線性關系考察 按“1.2.4”項處理后作LC-MS/MS分析，以空白血清或睪丸中伊馬替尼與內標物峰面積之比（Y）對藥物濃度（C，ng/mL）線性回歸（加權系數(shù)為1/C2），擬合得標準曲線。得血清中測定曲線回歸方程為：Y=0.0059X+0.0879， r=0.9969。 睪丸液中曲線回歸方程為：Y=0.0016X+0.0294，r=0.9936。線性范圍為1.0～2000.0 ng·mL-1，定量限（LLOQ）為1.0 ng·mL-1。

1.2.5.3 回收率 按“1.2.4”項下試驗條件制備伊馬替尼低、中、高3種質量濃度（5.0、25.0和250.0 ng·mL-1）的血樣和睪丸組織質量控本（每種濃度6個重復），以每一種濃度常規(guī)質控樣本中伊馬替尼峰面積平均值除以同濃度參比樣本中伊馬替尼峰面積平均值來計算提取回收率。在本文條件下，血樣質量控本中伊馬替尼低、中、高3種質量濃度回收率分別為（83.4±3.2）%、（87.0± 1.5）%、（85.2±1.1）%，RSD 分別為 3.0%、2.7%、1.3%;內標氘代伊馬替尼分別為（94.9±1.8）%、（91.0±2.8）%、（94.1±2.7）%，RSD分別為1.4%、3.2%、1.7%。睪丸組織質量控本中伊馬替尼低、中、高3種質量濃度回收率分別為（93.4±2.2）%、（84.2± 1.7）%、（80.9±2.1）%，RSD 分別為1.0%、1.9%、2.3%;內標氘代伊馬替尼分別為（92.1±2.8）%、（89.0±2.7）%、（84.9±1.7）%，RSD 分別為 2.4%、1.8%、2.4%。

1.2.5.4 精密度與準確度 按“1.2.4”項下試驗條件制備25.0、50.0、100.0 ng·mL-1 3個濃度的標準血樣與睪丸組織樣品作為質控樣品，每一濃度各15份，每天分別取3個濃度各5份，連續(xù)測定3 d，伊馬替尼血樣與睪丸組織樣品的精密度與準確度RSD均小于15%，符合生物樣品測定要求。

1.2.5.5穩(wěn)定性?? 按“1.2.4”項下試驗條件制備5.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0 ng·mL-1 6個濃度的空白血樣與睪丸組織質控樣品，每一濃度數(shù)份，分別考察于室溫放置2 h，樣品處理后4 ℃放置24 h，-70 ℃凍存30 d和-70 ℃凍融循環(huán)3次的穩(wěn)定性，上述條件下RSD均小于10%，空白血樣與睪丸組織質控樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，符合生物樣品測定要求。

1.3 統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0進行分析，計量資料以均數(shù)標準差表示x±s），組間顯著性檢驗，采用單因素方差分析（ one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體重及外觀 分別稱量各組小鼠第1周、第4周、第8周的體重，僅第四周時，L-IM+JIN組與Cont組差異有統(tǒng)計學意義P<0.05）。另外8周時間中，Cont組體重持續(xù)平穩(wěn)，染毒組隨著伊馬替尼給藥劑量增加、給藥時間延長，小鼠體重逐漸增加。拮抗組經(jīng)金匱腎氣丸給藥后，小鼠體重有不同程度減輕。如圖1所示。

2.2 臟器系數(shù) 與Cont組比較，各組小鼠睪丸系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義P>0.05），H-IM組睪丸系數(shù)有下降趨勢，而經(jīng)金匱腎氣丸治療后，拮抗組睪丸指數(shù)均有上升趨勢。如圖2所示。

2.3 精子數(shù)量 H-IM+JIN組與Cont組比較差異有統(tǒng)計學意義P<0.01），染毒低、中、高組小鼠精子數(shù)量均有下降趨勢，同劑量金匱腎氣丸與伊馬替尼聯(lián)合用藥組與伊馬替尼組相比，均能顯著性增加精子數(shù)量，差異有統(tǒng)計學意義P<0.01）。如圖3所示。

2.4 血漿及睪丸組織中伊馬替尼藥物濃度的檢測 采用LC-MS/MS檢測各組血液及精液中伊馬替尼藥物濃度。血液中，M-IM組與M-IM+JIN組比較有統(tǒng)計學意義P<0.05），小鼠血液中藥物含量最高，在經(jīng)金匱腎氣丸給藥后，各組小鼠血液中伊馬替尼濃度均有所增加。精液中，M-IM組與M-IM+JIN組比較有統(tǒng)計學意義P<0.01），在經(jīng)金匱腎氣丸給藥后，中劑量組小鼠精液中伊馬替尼濃度有所降低。如圖4、5、6所示。

A.血樣對照品;B.血樣樣品;C.睪丸組織對照品;D.睪丸組織樣品

4 討論

伊馬替尼是治療慢性粒細胞性白血病和惡性胃腸道間質腫瘤的一線藥物，其生殖毒性也是公認的，長時間服用可導致不可逆的少弱精子癥，少弱精子癥屬于中醫(yī)“精冷”“精少”范疇，人體生殖器官的發(fā)育、生殖功能的成熟與維持均與腎藏精和腎氣溫煦的功能相關。腎精化腎氣，腎精充足和腎氣旺盛，則生殖功能正常，反之則弱。因此，在少弱精子癥的治療上，始終離不開補腎法[9]。

金匱腎氣丸為傳統(tǒng)補腎名方，具有滋補腎陰、填補腎精、溫補腎氣的功效。大量臨床及試驗研究顯示，補腎中藥具有修復生殖損傷的作用。王秋萍、肖惠英等[10-11]指出腎氣丸能明顯改善少弱精子癥動物精子活力，改善精子密度，提高精子質量。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學認為： 精子質量低下，表明腎陽虧虛。所以，中醫(yī)治療弱精子癥，多采用溫補腎陽為治療大法。目前市面上售金匱腎氣丸實為《濟生方》中濟生圣氣丸，較《金匱要略》組中金匱腎氣丸多了兩味牛膝、車前，這兩味藥的加入增加了化氣利水消腫的作用，對于腎陽不足、水濕內停所致的腎虛水腫、小便不利更為適宜[12-13]。

本研究中結果顯示，伊馬替尼染毒組子數(shù)量有所下降，說明伊馬尼染毒雄性小鼠的生殖損傷模型建立成功?，F(xiàn)有文獻報道診斷腎陽虛證動物模型的客觀指標[14-15]主要有反映下丘腦-垂體-靶腺軸功能低下、睪丸出現(xiàn)組織學改變等，據(jù)200余篇有關腎陽虛動物模型文獻中癥狀體征描述顯示：其表現(xiàn)主要有體重下降， 體溫下降， 畏寒蜷縮， 反應遲鈍， 精神委靡， 體毛枯疏， 失去光澤， 飲水攝食減少， 尿量增多等， 個別有性功能低下。伊馬替尼染毒的小鼠符合腎陽虛證的動物模型，可用于金匱腎氣丸治療腎陽虛證的藥理評價[16]。在雄性生殖系統(tǒng)中[17]，睪丸具有精子的發(fā)生和雄性激素合成兩大功能，染毒組小鼠精子數(shù)量下降趨勢明顯，伊馬替尼可能在形成精子過程中產(chǎn)生毒性作用而導致精子數(shù)量減少[18]。此外，染毒組血漿與睪丸組織藥物濃度，M-IM組藥物濃度達到最高，可能原因是，伊馬替尼致雄性小鼠生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用有最高劑量，而經(jīng)金匱腎氣丸拮抗后，伊馬替尼在血液中的濃度有所增加，在睪丸組織中，M-IM組藥物濃度有所下降，這一結果說明，金匱腎氣丸能夠增加伊馬替尼在血液中的濃度，提高伊馬替尼治療CML的靶向性作用，減少伊馬替尼在睪丸組織中的濃度，降低伊馬替尼對雄性小鼠的生殖毒性。

雖然目前此類研究尚少見報告，但課題組正在研究應用補腎中醫(yī)干預接受伊馬替尼治療的慢性粒細胞性白血病白血病患者，動物實驗表明能夠較好改善應藥物導致的精子數(shù)目減少、活動力減低，改善精液治療，保護生殖力。

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（收稿日期：2020-05-21 編輯：程鵬飛）

作者簡介：朱思晗（1995-），女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為中藥分析。E-mail：2843055582@qq.com

通信作者：陳曉霞（1980-），女，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥炮制及藥物分析。E-mail：whitesnowbin@163.com