藏藥奧色折布的質(zhì)量標準研究

陳華林 徐俊 蔡曉洋 陳蓉 康晉梅 李敏

摘 要 目的：建立藏藥奧色折布（習(xí)稱“俄色果”）的質(zhì)量標準，為其質(zhì)量控制和資源的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用性狀觀察、顯微及薄層色譜（TLC）鑒別法對20批不同產(chǎn)地、不同基原的奧色折布藥材進行定性分析;參照2015年版《中國藥典》（四部）通則中相應(yīng)方法，分別進行水分、總灰分、浸出物含量的測定;建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定奧色折布中6種黃酮類成分（綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素）的含量。結(jié)果：該藥材呈倒卵形、類球形或橢圓形，表面呈紅棕色至暗紅色，微皺縮;氣微，味甘、酸、微澀。粉末顯微特征清晰，石細胞單個散在或成群，果肉薄壁細胞中含草酸鈣方晶、簇晶等。TLC結(jié)果顯示，在供試品色譜圖中，與對照品（熊果酸）色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點。其水分、總灰分、浸出物的含量分別為9.02%～11.39%、2.29%～3.35%、37.12%～58.41%。含量測定方法學(xué)考察顯示，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素分別在質(zhì)量濃度為3.12～50、1.25～20、1.25～20、3.12～50、18.7～300、0.5～8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r均不低于0.999 7）;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于3.0%（n=6）;平均加樣回收率分別為97.56%、98.28、106.14%、103.74%、98.37%、98.76%，RSD分別為1.57%、1.62%、1.38%、1.99%、2.15%、2.31%（n=6）。20批奧色折布樣品中上述6個成分含量范圍分別為0.001 5%～0.028 8%、0.005 9%～0.022 0%、0.008 7%～0.030 4%、0.019 4%～0.048 5%、0.068 5%～0.199 8%、0.005 1%～0.081 4%。結(jié)論：本研究建立的方法準確穩(wěn)定，可用于奧色折布的質(zhì)量控制。初步擬定奧色折布水分不得超過12%，總灰分不得超過3.5%，浸出物不得少于40%（按干燥品計），根皮苷含量不得低于0.1%。

關(guān)鍵詞 奧色折布;俄色果;質(zhì)量標準;顯微鑒別;薄層色譜;高效液相色譜法;黃酮類成分

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish the quality standard of the Tibetan medicine Malus Fructus （known as the fruit of Ese）， and to provide scientific reference for quality control and utilization of resource. METHODS： The qualitative analysis of 20 batches of Malus Fructus with different producing areas and different origins was carried out by morphological observation， microscopic and TLC identification. According to the method stated in 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia， water content， total ash content and extract content were determined. HPLC method was used to determine the contents of 6 kinds of flavones （chlorogenic acid， hyperin， isoquercitrin， quercitin， phloridzin， quercetin） in Malus Fructus. RESULTS： The properties of this medicinal material were obovate， spheroidal or oval， its surface was reddish brown to dark red， with slight shrinkage. Its taste was sweet， sour and slightly astringent. The microscopic characteristics of the powder were clear， the stone cells were scattered individually or clustered， and the pulp parenchyma cells contained calcium oxalate cube crystal and cluster crystal. The results of TLC showed that there were fluorescent spots of the same color in the chromatogram of the tested product and the corresponding position of the reference substance （ursolic acid）. The content ranges of moisture， total ash and extracts were 9.02%-11.39%， 2.29%-3.35%， 37.12%-58.41% respectively. The linear ranges of chlorogenic acid， hyperin， isoquercitrin， ， quercetin phlorizin and quercetin were 3.12-50， 1.25-20， 1.25-20， 3.12-50， 18.7-300， 0.5-8 μg/mL（all r were not less than 0.999 7）. RSDs of prescision， stability and reproducibility tests were all lower than 3.0% （n=6）. The average recoveries were 97.56%， 98.28%， 106.14%， 103.74%， 98.37%， 98.76%; RSDs were 1.57%， 1.62%， 1.38%， 1.99%， 2.15%， 2.31%（n=6）. The content ranges of the above ? ? ? ? ?six components in 20 baches of samples were 0.001 5%-0.028 8%， 0.005 9%-0.022 0%， 0.008 7%-0.030 4%， 0.019 4%- ? ?0.048 5%， 0.068 5%-0.199 8% and 0.005 1%-0.081 4%. CONCLUSIONS： Established method is accurate and stable， and can be used for quality control of Malus Fructus. It is preliminarily proposed that moisture and total ash content should not exceed 12% and 3.5%， and extract （by dry product） and phlorizin content should not be less than 40% and 0.1% respectively.

KEYWORDS ? Malus Fructus; Fruit of Ese; Quality standard; Microscopic identification; TLC; HPLC; Flavonoids

藏藥奧色折布（藏文名：）為薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malus toringoides （Rehd.） Hughes.或花葉海棠Malus transitoria （Batal.） Schneid.的干燥成熟果實，在四川省甘孜州習(xí)稱“俄色果”，始載于《如意寶樹》[1]，在《晶珠本草》[2]、《藏藥晶鏡本草》[3]、《新修晶珠本草》[4]、《中華藏本草》[5]等本草著作中也均有記載，其具有養(yǎng)肝明目、清肺祛痰、健胃生津的功效，用于肝病、眼疾目昏、高脂血癥、高血壓、肺病咳痰、消化不良、腹瀉、津傷口渴等的治療[1-5]。奧色折布主產(chǎn)于四川省甘孜州爐霍縣、道孚縣等，在西藏、青海、甘肅等地也有分布，資源蘊藏量大[6]。現(xiàn)代研究表明，奧色折布主要含多種黃酮類成分、有機酸類成分[7]以及多糖、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分[8]，具有良好的保肝、抗氧化等藥理活性[9]。奧色折布作為甘孜州的民間習(xí)用藥材，具有悠久的藥用及食用歷史。與其相同來源、不同藥用部位的“俄色洛瑪” （即“俄色葉”）藥材的質(zhì)量標準已收載于《四川省藏藥材標準》（2014年版）[10]中，然而奧色折布尚無相應(yīng)的法定標準。因此，本研究通過對其性狀、顯微及薄層色譜（TLC）鑒別，以及水分、總灰分、浸出物、黃酮類成分含量等定性、定量項目進行研究，旨在建立一個相對完善的奧色折布質(zhì)量標準，為該藥材的質(zhì)量控制和資源的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000型高效液相色譜（HPLC）儀（包括自動進樣器、在線脫氣機、四元梯度泵、柱溫箱、二級管陣列檢測器等，美國Thermo Fisher Scientific公司）;BP121S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;SHB-ⅢS型循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）; DUG-9070B智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海瑯軒實驗設(shè)備有限公司）;TM004型數(shù)顯卡尺[ 勒塔實業(yè)（上海）有限公司];BX53MRF-S型顯微鏡（包括DP72數(shù)碼成像系統(tǒng)，日本Olympus公司）;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對照品（批號：wkq16052705，純度：≥98%）、金絲桃苷對照品（批號：wkq16050305，純度：≥98%）、異槲皮苷對照品（批號：wkq16050607，純度：≥98%）、槲皮苷對照品（批號：wkq17113002，純度：≥98%）、根皮苷對照品（批號：wkq17122002，純度：≥98%）、槲皮素對照品（批號：wkq17072005，純度：≥98%）、熊果酸對照品（批號：18012906，純度：≥98%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司;TLC硅膠G板（青島海洋化工有限公司，批號：20180710）;乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

奧色折布藥材樣品采集自四川省甘孜州，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標準化教育部重點實驗室李敏教授鑒定為薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠M. toringoide（Rehd.） Hughes.或花葉海棠M. transitoria（Batal.） Schneid.的干燥成熟果實。藥材樣品來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

對奧色折布藥材的形狀、大小、顏色、斷面、氣、味等進行觀察。結(jié)果顯示，不同基原的奧色折布性狀略有不同。變?nèi)~海棠基原的奧色折布呈倒卵形或長橢圓形，長8.5～14.0 mm，直徑5.5～8.0 mm;表面呈紅棕色至暗紅色，微皺縮，可見明顯的果柄痕或花萼殘跡，果柄處稍向外凸起;質(zhì)堅硬，斷面果肉呈淡紅棕色，果核呈黃色，種子5，扁卵形，種皮棕色，種仁白色，有油性;氣微清香，味甘、酸、微澀?；ㄈ~海棠基原的奧色折布呈類球形或橢圓形，長7.0～10.0 mm，直徑6.0～8.0 mm;表面呈黃棕色、紅棕色或暗紅色，微皺縮，果柄處稍向內(nèi)凹陷。奧色折布藥材形狀見圖1。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 取奧色折布藥材粉末在顯微鏡下進行觀察。結(jié)果顯示，奧色折布粉末呈淡黃棕色至紅棕色。果皮表皮細胞表面觀呈類多角形，直徑14～55 μm，壁稍厚，胞腔內(nèi)常含淡紅棕色物。石細胞單個散在或成群，呈淡黃色，表面觀呈類多角形、類圓形、長方形或不規(guī)則形，直徑23～92 μm，長40～123 μm，壁厚，孔溝及層紋明顯，部分胞腔含深棕色物。內(nèi)胚乳細胞表面觀呈多角形或類多角形，直徑17～41 μm，壁較厚，常含脂肪油滴。導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管或梯紋導(dǎo)管，直徑6～16 μm。草酸鈣方晶散在果肉薄壁細胞中，直徑9～16 μm;草酸鈣簇晶的直徑為12～17 μm。果皮纖維呈淡黃色，上下層斜向交錯或平行排列，多成束，壁厚，直徑14～30 μm。奧色折布藥材粉末顯微圖見圖2。

2.2.2 TLC鑒別 取奧色折布藥材粉末1.0 g，加乙醇5 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）處理15 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取熊果酸對照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502“薄層色譜法”[11]進行試驗。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（6 ∶ 0.5 ∶ 1.3 ∶ 0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，于105 ℃下加熱至斑點清晰，置于紫外光燈（波長為365 nm）下檢視。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點。奧色折布的TLC圖見圖3。

2.3 檢查

取奧色折布藥材粉末（過二號篩）約2 g，精密稱定，分別按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0832項下水分測定法（第二法“烘干法”）、通則2302項下“總灰分測定法”測定水分和總灰分[11]。各批次藥材均平行操作3次，取平均值。結(jié)果顯示，20批奧色折布的水分含量為9.02%～11.39%，平均含量為9.78%;總灰分含量為2.29%～3.35%，平均含量為2.85%。奧色折布水分、總灰分含量測定結(jié)果見表2。

2.4 浸出物

取奧色折布藥材粉末（過二號篩）2 g，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（四部）通則2201水溶性浸出物測定法項下的“熱浸法”測定浸出物含量[11]。結(jié)果表明，20批樣品的浸出物含量為37.12%～58.41%，平均含量為49.46%。奧色折布浸出物含量測定結(jié)果見表2。

2.5 含量測定

采用HPLC法測定奧色折布藥材中6種黃酮類成分的含量。

2.5.1 色譜條件 色譜柱：SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，12%A→15%A;5～15 min，15%A→20%A;15～28 min，20%A;28～48 min，20%A→42%A;48～50 min，42%A→50%A;50～55 min，50% A→12%A）;流速：0.7 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：350 nm;進樣量：20 μL。

2.5.2 混合對照品溶液的制備 取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素各對照品適量，精密稱定，分別置于不同25 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并定容，制備各單一對照品母液。分別取一定量的各對照品母液，置于同一10 mL量瓶中，用75%甲醇稀釋制成綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.5、0.2、0.2、0.5、3.0、0.08 mg/mL的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取奧色折布藥材細粉約2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）處理45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，然后用75%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 系統(tǒng)適用性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液（批號：E10、E18）、陰性對照溶液（即75%甲醇溶液），分別按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各待測成分與各自相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按根皮苷峰計不低于4 000，色譜峰對稱因子在0.93～1.08之間，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖4。

2.5.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液 ? ? ? ? 1 000、500、250、125、62.5 μL，置于不同10 mL量瓶中，用75%甲醇分別定容至刻度制備成系列標準溶液，然后按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以色譜峰峰面積為縱坐標（y）、各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（x， ? ? μg/mL）繪制標準曲線并進行線性回歸分析。結(jié)果表明，各待測成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積均呈良好的線性關(guān)系（r均不低于0.999 7）?；貧w方程與線性范圍見表3。

2.5.6 定量限與檢測限考察 精密量取“2.5.2”項下混合對照品溶液適量，以75%甲醇倍比稀釋后，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算6種待測成分的定量限、檢測限。結(jié)果顯示，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素的定量限分別為0.040 7、0.017 6、0.018 1、0.041 4、0.023 9、0.011 9 ? ?μg/mL，檢測限分別為0.011 6、0.005 9、0.006 0、0.011 8、0.008 0、0.004 5 μg/mL。

2.5.7 精密度試驗 取供試品溶液（批號：E10）適量，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，連續(xù)測定6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.11%、0.19%、0.18%、1.06%、1.82%、0.82%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.8 重復(fù)性試驗 稱取奧色折布藥材細粉（批號：E10）2 g，平行6份，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并根據(jù)標準曲線計算各待測成分含量。結(jié)果顯示，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素含量的RSD分別為1.69%、1.26%、1.09%、2.56%、2.32%、2.47%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：E10）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.76%、2.02%、2.60%、1.14%、2.80%、2.65%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的奧色折布藥材細粉（批號：E19）1 g，平行6份，按與已知成分含量比例1 ∶ 1（m/m）精密加入相應(yīng)的對照品，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并根據(jù)標準曲線計算各待測成分含量。結(jié)果顯示，奧色折布中綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素的平均加樣回收率為97.56%～106.14%，RSD為1.38%～2.31%（n=6），表明本方法準確度良好。加樣回收率試驗結(jié)果見表4。

2.5.11 耐用性試驗 取奧色折布藥材細粉（批號：E10）適量，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在固定其他色譜條件不變的情況下，分別考察不同型號色譜柱[Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、 Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]和不同型號高效液相色譜儀[Agilent 1200型、Thermo UltiMate3000型]對6種成分含量測定的影響，記錄色譜圖，并根據(jù)標準曲線計算各成分含量。平行測定3次，取平均值。結(jié)果顯示，采用不同色譜柱測得的綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素含量的RSD分別為1.03%、0.77%、0.68%、1.21%、2.14%、0.92%（n=3），采用不同型號色譜儀測得的上述6種成分含量的RSD分別為2.01%、1.15%、1.29%、2.41%、3.18%、1.46%（n=3），表明本方法的耐用性良好。

2.5.12 樣品含量測定 分別取各批次藥材細粉適量，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，并根據(jù)標準曲線計算6種成分含量。平行測定3次，取平均值。結(jié)果顯示，20批樣品的綠原酸含量在0.001 5%～0.028 8%之間，平均值為0.006 5%;金絲桃苷含量在0.005 9%～0.022 0%之間，平均值為0.013 2%;異槲皮苷含量在0.007 8%～0.030 4%之間，平均值為0.018 4%;槲皮苷含量在 0.019 4%～0.048 5%之間，平均值為0.031 6%;根皮苷含量在0.068 5%～0.199 8%之間，平均值為0.133 5%;槲皮素含量在0.005 1%～0.081 4%之間，平均值為0.031 8%;6種成分的總含量在0.121 9%～0.301 6%之間，平均值為0.234 9%。6種黃酮類成分的含量測定結(jié)果見表5。

3 討論

藏藥基原混亂、質(zhì)量控制水平低甚至缺乏質(zhì)量標準以及藥效成分不明確等問題十分嚴重，因此品種鑒定、質(zhì)量標準提升及質(zhì)量評價等方面是藏藥現(xiàn)代化研究的重要內(nèi)容[12]。奧色折布作為四川省甘孜州的藥食兩用品種，使用歷史悠久，且自然資源充沛，但目前該藥材基礎(chǔ)研究薄弱、缺乏質(zhì)量標準，限制了其合理的開發(fā)利用[13]。本研究建立的奧色折布質(zhì)量標準，不僅可用于其藥材質(zhì)量控制，也對促進該藏藥資源的有效利用及其現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，奧色折布中不僅含有多種黃酮類成分，還含有三萜酸類成分（如熊果酸、齊墩果酸），且在歷版《中國藥典》中，以熊果酸為對照品進行薄層鑒別的薔薇科藥材較多。因此，本研究開展了黃酮類成分和三萜酸類成分的TLC鑒別研究，結(jié)果得到的黃酮類成分TLC斑點不清晰，在加大點樣量后，斑點的分離度又達不到標準;而三萜酸類成分TLC斑點清晰、分離度較好，且樣品在熊果酸對照品相同位置顯相同顏色的熒光斑點。綜上，本研究最終選擇熊果酸作為對照品對奧色折布進行TLC鑒別。

本研究建立的含量測定方法能同時測定奧色折布中綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素等6種黃酮類化學(xué)成分的含量。其中，變?nèi)~海棠與花葉海棠基原藥材中金絲桃苷（分別為0.013 4%、0.013 0%）、異槲皮苷（分別為0.018 7% 、0.017 9%）、槲皮苷（分別為0.032 6%、0.030 6%）的平均含量無明顯差異，而變?nèi)~海棠基原藥材中根皮苷含量較花葉海棠基原藥材高（分別為0.147 8%、0.119 2%），花葉海棠基原藥材中綠原酸（0.008 9%）、槲皮素（0.043 8%）含量顯著高于變?nèi)~海棠基原藥材（0.004 1%、0.019 7%），表明不同基原的奧色折布在不同化學(xué)成分方面有各自的品種優(yōu)勢，可為后續(xù)化學(xué)成分的深入研究提供數(shù)據(jù)支撐。本研究通過含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奧色折布藥材中根皮苷含量最高，占測定的6個成分總含量的60%左右;綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷的含量均較低，僅占6個成分總含量的16%左右。據(jù)文獻報道，根皮苷具有降血脂、抗氧化、保肝、抗腫瘤等多種藥理活性[14]，與奧色折布傳統(tǒng)功效具有一致性，且根皮苷也是蘋果屬植物的代表性成分。因此，選擇奧色折布中的功效性成分，同時也是其中含量較高的根皮苷，作為該藥材含量限定的指標成分。

本研究收集的樣品均來自于奧色折布藥材的主產(chǎn)區(qū)，包括不同采集地點和不同采集時間的樣品，具有代表性。根據(jù)檢測結(jié)果，上/下限標準按平均量上浮/下浮20%制訂，初步擬定奧色折布水分不得超過12%，總灰分不得超過3.5%，浸出物不得少于40%（按干燥品計），根皮苷含量不得低于0.1%。本研究對奧色折布的質(zhì)量標準進行了科學(xué)、系統(tǒng)的研究，建立的方法準確、穩(wěn)定，可用于該藥材的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標準的制定奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-08-03 修回日期：2020-09-17）

（編輯：林 靜）