金屬有機(jī)骨架-碳點(diǎn)納米電化學(xué)發(fā)光體用于尿酸的靈敏檢測(cè)

趙莉丹，劉 偉，卓 穎

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

0 前言

尿酸（Uric Acid，UA）具有清除氧自由基、維持機(jī)體免疫功能、對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用，人體血液中UA含量異常會(huì)導(dǎo)致腎結(jié)石、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和心血管疾病[1]。因此，人體中UA的含量監(jiān)測(cè)對(duì)人體的身體健康至關(guān)重要。電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）是指發(fā)光體在電極表面經(jīng)歷電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，生成激發(fā)態(tài)物質(zhì)，其以光輻射的形式回到基態(tài)的一種現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光生物傳感器結(jié)合ECL技術(shù)和生物識(shí)別策略，具有靈敏度高、線性響應(yīng)范圍廣、背景干擾低[2]等特點(diǎn)，在現(xiàn)代化學(xué)分析、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物分析等方面蓬勃發(fā)展。

碳點(diǎn)（Carbon dots，CDs）作為一種新型的納米材料，因其具有的小尺寸、低細(xì)胞毒性、生物相容性好等特點(diǎn)[3]而受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，由于CDs的界面固載效率低，使得構(gòu)建以CDs為發(fā)光體的固態(tài)ECL生物傳感器仍具挑戰(zhàn)[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在CDs溶液中加入1.0%殼聚糖（Chitosan，CS）溶液，形成的CDs-CS復(fù)合膜能有效提高CDs在玻碳電極上的固載效率，增強(qiáng)了CDs的ECL響應(yīng)信號(hào)[5]。沸石咪唑酯骨架結(jié)構(gòu)材料ZIF-8(Zeolitic Imidazole Framework-8)是被研究最多的MOF之一，其由鋅離子和2-甲基咪唑(Hmlm)配體組成，在pH高于7的水相中具有很高的穩(wěn)定性[6]。有研究報(bào)道了利用富含纖維素的玉米芯殘基作為支架，原位錨定制備Ag NPs修飾的ZIF-8納米復(fù)合材料，通過(guò)“茶包”策略制備了具有強(qiáng)的吸附催化性能和抗菌活性的多功能生物吸附劑Ag NPs@ZIF-8[7]?；诖?，該工作以ZIF-8作為CDs的載體，通過(guò)原位生長(zhǎng)包埋法制備了金屬有機(jī)骨架ZIF-8固載的CDs復(fù)合納米材料，并以此作為發(fā)光體構(gòu)建了電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，用于UA的高靈敏檢測(cè)。

首先，采用溶劑熱法，以魯米諾（Luminol）和二硫代二苯甲酸（DTSA）為原料，合成了硫原子摻雜的碳點(diǎn)（CDs）。然后，在含有CDs的溶液中合成金屬有機(jī)骨架ZIF-8，使得大量CDs在ZIF-8生長(zhǎng)成型的過(guò)程中負(fù)載于ZIF-8框架上，合成了具有強(qiáng)ECL信號(hào)的CDs@ZIF-8復(fù)合納米材料?；赨A能夠有效猝滅CDs@ZIF-8/溶解氧ECL體系的響應(yīng)信號(hào)，構(gòu)建了一個(gè)“ON-OFF”型的ECL生物傳感器，并研究了其對(duì)UA檢測(cè)的線性響應(yīng)范圍、選擇性和穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑（表1、表2）

表1 研究使用的實(shí)驗(yàn)儀器Tab.1 The list of apparatus used in this study

表2 研究使用的試劑Tab.2 The list of reagants used in this study

采用標(biāo)準(zhǔn)三電極體系檢測(cè)ECL信號(hào)，用鉑絲電極為對(duì)電極、Ag/AgCl電極（含飽和KCl溶液）為參比電極，玻碳電極（GCE，Φ=4 mm）為工作電極。

1.2 CDs的合成

首先，稱量0.0266 g Luminol和0.0460 g DTSA溶于10 mL冰乙酸中，對(duì)此混合溶液進(jìn)行2 h的超聲處理，直至溶液分散均勻。然后將此混合溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜（聚四氟乙烯）中，并將其置于烘箱中（180℃）反應(yīng)10 h。待溶液冷卻至室溫后，將此溶液進(jìn)行離心處理（11000 r/min，10 min），多次離心直至完全去除棕黃色沉淀物。取離心后的棕色溶液進(jìn)行透析（3500 Da，24 h），透析后的CDs溶液置于4℃冰箱中保存。

1.3 CDs@ZIF-8的合成

根據(jù)已報(bào)道的方法，首先合成ZIF-8[8]，用分析天平稱取0.2000 g的2-甲基咪唑和0.0880 g Zn(NO3)2·6H2O溶于5 mL上述制得的溶液，攪拌12 h（500 r/min），并于室溫下靜置24 h。靜置完成后離心（8000 r/min，10 min）分離，隨后用去離子水多次離心洗滌沉淀（8000 r/min，10 min），最后60℃真空干燥8 h,得到白色的納米復(fù)合材料CDs@ZIF-8共0.0609 g。將此粉末平均分為5份，每份0.0122 g，依次分散在含1至5 mL去離子水中，獲得質(zhì)量濃度依次為12.20 mg/mL、6.10 mg/mL、4.07 mg/mL、3.05 mg/mL、2.44 mg/mL的CDs@ZIF-8溶液，超聲均勻后于4℃冰箱中保存。

1.4 傳感器的制備和檢測(cè)過(guò)程

首先，對(duì)玻碳電極（GCE）進(jìn)行拋光打磨，用蒸餾水、乙醇交替超聲清洗。滴加3μL上述質(zhì)量濃度為4.07 mg/mL的CDs@ZIF-8溶液在打磨干凈的電極上，于37℃烘箱中烘15 min，得到UA生物傳感器（CDs@ZIF-8/GCE）。ECL的檢測(cè)底液為2 mL含有不同UA濃度的PBS（0.1 mol/L，pH7.4），運(yùn)用MPI-E型電化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行ECL信號(hào)的測(cè)定。設(shè)置掃描電壓為-0.6V~0.7V，光電倍增管（PMT）高壓設(shè)置為800 V，放大級(jí)數(shù)為3，靈敏度為1×10-4，掃描速率為0.3 V/s。圖1為UA電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備過(guò)程及響應(yīng)機(jī)制示意圖。

圖1 UA電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備過(guò)程及響應(yīng)機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation and response mechanism of the ECL biosensor

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的TEM表征

通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)CDs和ZIF-8的形貌進(jìn)行表征。如圖2（A）所示，CDs呈現(xiàn)良好的單分散性，且沒(méi)有明顯的聚集。圖2（B）可以觀察到球形CDs的粒徑較為均一，其粒徑平均約為3.75 nm；圖2（B）插圖展示了CDs的晶格條紋間距為0.24 nm。ZIF-8的形貌表征如圖2（C）所示，可以看到ZIF-8呈現(xiàn)良好的十二面體結(jié)構(gòu)，且粒徑大小比較均一，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。

圖2 （A）、（B）CDs和（C）ZIF-8的TEM表征圖Fig.2 TEM images of(A)、(B)CDs and(C)ZIF-8

2.2 材料的光學(xué)性質(zhì)

CDs@ZIF-8的UV-vis吸收光譜如圖3所示，在208 nm、251 nm、297 nm、340 nm處均有吸收峰，其中208 nm的極強(qiáng)吸收峰和251 nm的肩峰來(lái)源于CDs中sp2C=C雙鍵的π-π*躍遷；297 nm和340 nm的吸收峰主要源自于CDs表面態(tài)酰肼基團(tuán)的n-π*躍遷，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。

圖3 CDs@ZIF-8的紫外可見光譜圖Fig.3 The Ultraviolet Visible spectrum of CDs@ZIF-8

復(fù)合材料CDs@ZIF-8的熒光光譜如圖4（A），可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)CDs@ZIF-8在363 nm的激發(fā)下，CDs@ZIF-8的最強(qiáng)熒光發(fā)射峰位于421 nm。通過(guò)圖4（B）可知，CDs@ZIF-8的ECL發(fā)射峰位于424 nm，與熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)基本一致[11]。

圖4 CDs@ZIF-8的(A)熒光光譜圖(B)ECL光譜圖Fig.4 (A)Ultraviolet Visible and(B)Fluorescence spectrum of CDs@ZIF-8

2.3 分析條件的優(yōu)化

為了對(duì)傳感器的最佳分析條件進(jìn)行優(yōu)化，探究了不同的掃描電壓以及不同濃度的CDs@ZIF-8溶液對(duì)ECL信號(hào)的影響。滴加3μL質(zhì)量濃度為4.07 mg/mL的CDs@ZIF-8溶液于電極上，在37℃烘箱中烘15 min后，選擇不同的電壓范圍進(jìn)行ECL信號(hào)的測(cè)定。如圖5（A）所示，可以看出在-0.6 V~0.7 V時(shí)材料具有較強(qiáng)的ECL信號(hào)和較好的峰形，因此，將-0.6 V~0.7 V確定為材料的最佳掃描電壓。

此外，還對(duì)CDs@ZIF-8濃度進(jìn)行了優(yōu)化。如圖5（B）所示，CDs@ZIF-8溶液為質(zhì)量濃度4.07 mg/mL時(shí)的ECL響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)，當(dāng)材料的質(zhì)量濃度為6.10 mg/mL和12.20 mg/mL時(shí)，此時(shí)的CDs@ZIF-8溶液濃度較高，推測(cè)納米復(fù)合材料容易發(fā)生團(tuán)聚，導(dǎo)致此濃度下的材料顆粒尺寸較大，因此ECL信號(hào)顯著下降。當(dāng)濃度低于4.07 mg/mL時(shí)，即質(zhì)量濃度為3.05 mg/mL、2.44 mg/mL時(shí)，ECL信號(hào)隨材料濃度降低而降低，故選擇CDs@ZIF-8質(zhì)量濃度為4.07 mg/mL為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

圖5 CDs@ZIF-8的掃描電壓(A)和濃度(B)的優(yōu)化Fig.5 Optimization of scanning voltage(A)and the centration(B)of CDs@ZIF-8

2.4 傳感器對(duì)UA的ECL響應(yīng)

如圖6（A）所示，實(shí)驗(yàn)表明，隨UA濃度的增加CDs@ZIF-8修飾電極的ECL信號(hào)逐漸降低。并且，如圖6（B），ECL信號(hào)的變化值（△I）與UA濃度的對(duì)數(shù)值在5.0×10-9mol/L至1.0×10-4mol/L濃度內(nèi)呈線性關(guān)系，利用Origin軟件擬合出△I與lg cUA的關(guān)系為：△I=1587.2 lg cUA+4115.2，R=0.9971。根據(jù)3σ規(guī)則[12]，計(jì)算出該傳感器的檢測(cè)限為5.4 nmol/L。

圖6 (A)傳感器對(duì)不同濃度UA的ECL響應(yīng)曲線（底液為0.1 mol/L PBS，pH7.4），從a到f UA的濃度分別為5.0×10-9 mol/L，5.0×10-8 mol/L，5.0×10-7 mol/L，5.0×10-6 mol/L，5.0×10-5 mol/L，1.0×10-4 mol/L.(B)ECL信號(hào)的變化值（△I為ECL信號(hào)與空白信號(hào)的差值）與UA濃度的對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系Fig.6 (A)ECL response curves of the sensor to different concentrations of Uric Acid(base solution is 0.1 mol/L PBS,pH7.4)from(a)to(f):(5.0×10-9 mol/L,5.0×10-8 mol/L,5.0×10-7 mol/L,5.0×10-6 mol/L,5.0×10-5 mol/L,1.0×10-4 mol/L)respectively and(B)The linear relationship between the change value of ECL signal(△I is the difference between ECL signal and blank signal)and the log value of Uric Acid concentration

2.5 ECL生物傳感器的選擇性和穩(wěn)定性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所制備的生物傳感器對(duì)UA的響應(yīng)是否具有特異性，選擇了幾種可能對(duì)UA的檢測(cè)產(chǎn)生干擾的物質(zhì)：尿素（Urea）、葡萄糖（Glu）、精氨酸（Arg）和L-組氨酸（L-His）。如圖7（A）所示，當(dāng)干擾物質(zhì)的濃度為目標(biāo)物UA濃度的10倍時(shí)（干擾物質(zhì)的濃度1000μmol/L，UA濃度100μmol/L），傳感器測(cè)定UA時(shí)的ECL信號(hào)變化值明顯大于測(cè)定干擾物質(zhì)時(shí)的ECL信號(hào)變化值，并且加入干擾物質(zhì)時(shí)的ECL信號(hào)與空白的ECL信號(hào)較為接近，說(shuō)明該傳感器能夠用于對(duì)UA特異性檢測(cè)。另一方面，連續(xù)測(cè)定了傳感器在50 nmol/L UA底液中的ECL信號(hào)，如圖7（B）所示，可見測(cè)定的ECL信號(hào)具有良好的穩(wěn)定性。計(jì)算得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低至0.57%，證明此傳感器穩(wěn)定性良好。

圖7 ECL生物傳感器的(A)選擇性和(B)穩(wěn)定性Fig.7 (A)Selectivity and(B)Stability of the ECL biosensor

表3是該工作和UA的其他檢測(cè)法的對(duì)比，說(shuō)明ECL分析法檢測(cè)UA具有更寬的線性范圍。

表3 該工作與其他相關(guān)工作的對(duì)比Tab.3 The comparsion between this work and others

3 結(jié)論

綜上所述，該工作以魯米諾（Luminol）和二硫

代二苯甲酸（DTSA）為原料，通過(guò)溶劑熱法合成了硫原子摻雜的CDs。然后通過(guò)原位生長(zhǎng)包埋法使得大量CDs在ZIF-8生長(zhǎng)成型的過(guò)程中負(fù)載在ZIF-8的框架上，合成了具有強(qiáng)ECL信號(hào)的CDs@ZIF-8復(fù)合材料。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UA能夠有效猝滅CDs@ZIF-8/溶解氧體系的ECL信號(hào)，相較于傳統(tǒng)的熒光法、比色法、分光法檢測(cè)生物小分子，該實(shí)驗(yàn)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)UA的高靈敏、高特異性檢測(cè)，對(duì)人體UA含量的檢測(cè)具有重要的意義。