碳納米管/金用于孔雀石綠快速拉曼檢測

侯 婷，蔣雨寧，楊海峰

（資源化學(xué)教育部重點實驗室，上海師范大學(xué)化學(xué)系，上海200234）

0 引言

孔雀石綠（MG）是一種人工合成的三苯甲烷類化合物，有較強(qiáng)的的抗菌效力，被廣泛用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖，預(yù)防與治療魚類細(xì)菌、真菌和寄生蟲感染，是治療水霉病的特效藥[1-3]。另一方面，MG在水源中殘留性強(qiáng)，極易通過食物鏈被人體攝入，對生物體有潛在的致畸、致癌、致突變等毒副作用。2002年，我國將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》，并在2005年制定了使用標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定水產(chǎn)品中MG及其代謝物無色孔雀石綠（LMG）的殘留總限量不得超過1 μg/kg[4]。但是，由于其成本低，抗菌效果好，加之市場上暫無特效替代藥品等因素，養(yǎng)殖戶違規(guī)使用MG的情況屢禁不止，導(dǎo)致水產(chǎn)品以及環(huán)境水系受污染，威脅到人類健康。

通常，檢測孔雀石綠的方法有高效液相色譜（HPLC）[5]，液 相 色 譜 質(zhì) 譜/質(zhì) 譜 聯(lián) 用（LC-MS/MS）[6]，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[7]等。但上述方法均需要復(fù)雜的前處理過程，所使用的儀器昂貴也不便攜，對專業(yè)技術(shù)人員的操作要求高，無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)有非破壞性、高靈敏度、高選擇性、振動信息指紋識別能力和快速檢測等特點，已在生物樣品檢測、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用[8-9]。公認(rèn)的SERS增強(qiáng)機(jī)制有化學(xué)增強(qiáng)（CM）和電磁場增強(qiáng)（EM）機(jī)制。局部表面等離子體共振（LSPR）產(chǎn)生主導(dǎo)EM機(jī)制，其增強(qiáng)因子可達(dá)到4到11個數(shù)量級[10]。SERS基質(zhì)的尺寸，形狀和組成會影響其表面電磁場分布，所以基底材料的優(yōu)化制備是建立穩(wěn)健的SERS分析方法至關(guān)重要的因素。

碳納米管（CNT）有較大比表面積，可負(fù)載貴金屬納米粒子并防止其團(tuán)聚，使得SERS熱點均勻分布，是一種理想SERS基底載體[11]。目前，金屬納米粒子-碳納米管復(fù)合材料的制備和在SERS檢測中應(yīng)用已被廣泛研究[12-14]。該文通過優(yōu)化氨基修飾碳納米管（CNT-NH2）與金納米粒子（Au NPs）的體積比，制備了碳納米管/金（CNTAu）復(fù)合材料，以期獲得最佳的SERS增強(qiáng)效果?；贑NT-Au對MG的富集作用，有利于MG分子進(jìn)入SERS熱點區(qū)域，可大大提高檢測靈敏度。結(jié)合便攜式小型拉曼儀器，可實現(xiàn)對痕量MG殘留的現(xiàn)場快速靈敏檢測，有很強(qiáng)的應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1.1 化學(xué)試劑

多壁碳納米管（CNT），濃硝酸，濃硫酸，二氯亞砜（SOCl2），乙二胺，甲苯，氯金酸，檸檬酸鈉，結(jié)晶紫（CV），孔雀石綠（MG）購于國藥試劑有限公司。所有試劑為分析純，未經(jīng)任何純化。所有實驗操作均使用去離子水。所用玻璃器皿先在王水中浸泡，再用去離子水徹底清洗。

1.2 實驗儀器

利用掃描電子顯微鏡圖（SEM）（型號：Hitachi S-4800）透射電子顯微鏡（TEM）（型號：JEOL JEM-2000 FX）對CNT-Au基底形貌進(jìn)行觀察。采用X射線光電子能譜（XPS；Axis 165,Kratos）分析復(fù)合納米材料的化學(xué)元素組成。UV-7504 UVVis分光光度計(上海欣茂有限公司)收集所制備材料的紫外可見光譜。拉曼（Raman）譜圖的測定是用Enwave公司便攜式拉曼儀器測定，其激發(fā)光源是波長為785 nm的二極管激光器。

1.3 氨基修飾碳納米管的合成

碳納米管的氨基修飾參照文獻(xiàn)的方法[15]。具體步驟為：將碳納米管在濃硫酸與濃硝酸混合酸中超聲30 min混合均勻，70℃加熱回流3 h對碳納米管進(jìn)行酸化。將羧酸官能化后的碳納米管冷卻到室溫，離心并用去離子水洗三次后置于80℃真空干燥箱內(nèi)干燥24 h。再將200 mg酸化后的碳納米管與50 mL SOCl2混合，并在70℃下加熱回流12 h對其進(jìn)行氯化處理后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30℃的條件下除去殘留的SOCl2。最后將所得固體分散到10 mL甲苯中，在氮氣保護(hù)下，逐滴滴加到10 mL濃度為5 mg/mL乙二胺的甲苯溶液中于70℃反應(yīng)回流24 h。最后將產(chǎn)物離心并用乙醇洗三次置于50℃真空干燥箱內(nèi)干燥24 h后，得到黑色的CNT-NH2固體粉末。

1.4 金納米粒子的合成

金納米粒子的合成參照了Frens方法[16]，量取0.25 mL 1%氯金酸加入到100 mL超純水中，加熱至沸騰，待沸騰15 min后，快速加入1.5 mL 1%檸檬酸鈉溶液，待溶液變?yōu)榫萍t色后開始計時，保持沸騰狀態(tài)30 min。最后將合成好的金納米溶膠冷卻到室溫，密封避光4℃保存。

1.5 碳納米管/金納米粒子復(fù)合材料（CNT-Au）的合成

配置1 mg/mL的CNT-NH2溶液，并將其與金納米溶膠混合，兩者體積比例分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶10。將混合液攪拌5 min，使CNTNH2與金溶膠充分混合。靜置20 min后，用離心機(jī)以2000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速將混合液離心，去除未與氨基修飾碳納米管結(jié)合的金納米粒子。

1.6 孔雀石綠的SERS檢測

將5μL不同濃度的孔雀石綠溶液與5μL SERS基底CNT-Au（2 mg/mL）均勻混合，在8.0×8.0 cm2的鋁箔紙上滴樣。用手提便攜式拉曼檢測，每個拉曼譜圖累積次數(shù)為3次，掃描時間為3 s。

圖1為CNT-Au材料的合成過程。

圖1 CNT-Au材料的合成過程Fig.1 Schematic illustration for the preparation of CNT-Au

2 結(jié)果與討論

2.1 CNT-Au復(fù)合材料的表征

圖2 A和2B為CNT-Au的透射電子顯微鏡（TEM）圖，從圖中可以看到修飾在碳納米管上Au NPs的粒徑約為10~30 nm。圖2 C和2D為CNT-Au掃描電子顯微鏡（SEM）圖。如圖所示，基于氨基與Au NPs的相互作用，合成的材料中含有較多且密集的金納米粒子，形成了更多的“熱點”使該基底具有更好的SERS增強(qiáng)效果。

圖2 (A,B)CNT-Au TEM圖，(C,D)CNT-Au SEM圖Fig.2 TEM(A,B)and SEM(C,D)images of CNT-Au

為進(jìn)一步確定CNT-Au的組成成分，對XPS結(jié)果進(jìn)行分析以確定納米材料的元素組成。如圖3所示，291.2 eV和284.7 eV對應(yīng)于C 1s軌道結(jié)合能[17]，81.9 eV和87.8 eV對應(yīng)于Au 4f軌道結(jié)合能[18]，399.8 eV對應(yīng)于N 1s軌道結(jié)合能[19]，表明C、Au、N三種元素的存在，進(jìn)一步驗證了CNT-Au納米材料的成功合成。

圖3 CNT-Au納米材料XPS表征Fig.3 XPS survey spectrum of CNT-Au

2.2 CNT-Au復(fù)合材料合成優(yōu)化

以10-6mol/L CV為拉曼探針，研究了不同CNT和金體積比制備的CNT-Au基底的SERS增強(qiáng)效果。由圖4可知，拉曼強(qiáng)度隨著金用量的增加而增加，當(dāng)體積比為1∶3時，在1169 cm-1處的CV特征峰強(qiáng)度達(dá)到最大值。繼續(xù)加入金溶膠，發(fā)生了一定程度的團(tuán)聚反而導(dǎo)致“熱點”消失，拉曼強(qiáng)度出現(xiàn)明顯下降。用紫外-可見光譜分析探究不同比例制備的CNT-Au基底SERS增強(qiáng)效果不同的原因。如圖4B所示，隨著Au NPs數(shù)量的增加，CNT-Au的吸收峰出現(xiàn)紅移，峰變寬，當(dāng)CNT-NH2與Au NPs的量的比值為1∶3時，在530 nm出現(xiàn)了一個較為明顯的吸收峰，其吸收值遠(yuǎn)大于體積比為1∶5和1∶10時所制備的CNT-Au，這可能是Au NPs發(fā)生團(tuán)聚沉淀引起的。拉曼實驗中，體積比1:3時制得的CNT-Au能產(chǎn)生最佳的拉曼增強(qiáng)信號，可用于后續(xù)孔雀石綠檢測。

圖4 (A)以不同體積比CNT：Au制備的CNT-Au為基底檢測10-6 mol/L CV的SERS譜圖；(B)Au NPs(a)以及不同體積比CNT：Au(b)1∶3,(c)1∶5,(d)1∶10制備CNT-Au的紫外-可見吸收光譜Fig.4 (A)SERS spectra of CNT-Au substrates prepared with different volume ratio in the presence of 10-6 mol/L CV;(B)UV–vis absorption spectra of AuNPs(a)and CNT-Au prepared with different volume ratio(b)1∶3,(c)1∶5,(d)1∶10

2.3 CNT-Au復(fù)合材料作為SERS基底檢測孔雀石綠

以檸檬酸鈉為還原劑合成的Au NPs帶負(fù)電性，而MG是一種帶正電性的分子，所以用檸檬酸鈉合成的Au NPs對孔雀石綠有靜電吸引力作用，可達(dá)到富集的目的[20]。同時，碳納米管作為一種卷曲狀態(tài)的石墨烯材料，與MG之間存在π-π共軛作用力，進(jìn)一步增強(qiáng)了該基底對MG的富集作用。此外，通過調(diào)節(jié)不同比例的CNT-NH2與Au NPs的量，控制了Au NPs之間的“熱點”距離，將Au NPs之間的距離調(diào)節(jié)到最佳值，使CNT-Au的SERS增強(qiáng)效果達(dá)到最優(yōu)值?；瘜W(xué)增強(qiáng)與SPR增強(qiáng)相互協(xié)同作用，使該基底可實現(xiàn)對痕量MG的快速、靈敏檢測。圖5顯示了在最佳條件下以CNT-Au為SERS基底檢測不同濃度MG的拉曼光譜圖。如圖5A所示，1165 cm-1處的SERS峰強(qiáng)隨著MG濃度的升高而增強(qiáng)，圖5B顯示了1165 cm-1峰的強(qiáng)度變化與MG濃度在1 ppm到0.1 ppb范圍內(nèi)之間的良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9952。以CNT-Au作為SERS基底對MG的檢測最低限為0.01 ppb（如圖5A內(nèi)插圖所示）。

圖5 (A)CNT-Au檢測不同濃度MG的SERS譜圖（內(nèi)插圖為10-7 g/L MG的SERS放大圖）(B)MG在1165 cm-1處特征峰SERS強(qiáng)度與MG濃度之間的線性關(guān)系Fig.5 (A)CNT-Au-based SERS spectra of MG with different concentrations(inset is the amplified SERS spectrum of 10-7 g/L MG);(B)The calibration curve based on Raman intensity at 1165 cm-1

2.4 實際水樣中MG的回收率測定

將MG加入到河水中配置成濃度為10μg/L的實際樣品，經(jīng)膜過濾簡單處理后，用CNT-Au材料對處理后的實際樣品進(jìn)行SERS檢測，以驗證該基底在實際檢測中的實用性。從表1可以看出，不同水樣中MG的回收率范圍介于96%至112%之間，表明該SERS傳感器的準(zhǔn)確與可靠性。以上結(jié)果表明，基于CNT-Au體系的SERS方法可實現(xiàn)對MG的靈敏快速檢測，是一種簡單可靠的監(jiān)測水樣中MG含量的分析方案。

表1 實際水樣中MG的測定結(jié)果Tab.1 Determination results of MG in actual water samples

3 結(jié)論

將碳納米管氨基功化后，組裝金溶膠，成功制得有強(qiáng)SERS效應(yīng)的碳納米管/金復(fù)合材料。通過TEM、SEM、UV等表征手段，發(fā)現(xiàn)Au NPs在碳納米管壁上分布均勻，形成很多SERS熱點?；贛G與碳納米管以及Au NPs之間的相互作用，使MG分子富集并固定在CNT-Au表面熱點區(qū)域，大大提高了對MG的檢測靈敏度，最低檢出限可達(dá)0.01 ppb。采用便攜式小型拉曼儀器，有望實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測MG在河水中的殘留。