基于汞離子檢測(cè)所構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器中不同信號(hào)輸出模式的最新研究進(jìn)展

朱 姝，吳志鵬，臧廣超，王以武，馬廉舉，劉 倩

(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心，重慶401331)

0 引言

20世紀(jì)中期，日本海濱小鎮(zhèn)水俁發(fā)生大規(guī)模甲基汞中毒事件，對(duì)環(huán)境及人類健康造成毀滅性影響。自此，重金屬汞離子的破壞性影響開(kāi)始引起全世界的警惕，聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署（UNEP）為控制和減少汞的排放通過(guò)了“水俁公約”[1-2]。眾所周知，汞離子是最具危害性的重金屬污染物之一，易從環(huán)境轉(zhuǎn)移到食物鏈中，并在人體累積，對(duì)大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腎臟等器官造成嚴(yán)重?fù)p害[3]。因此，開(kāi)發(fā)高靈敏度、高選擇性的汞離子檢測(cè)方法具有重要意義。

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）是電激發(fā)下的一種化學(xué)發(fā)光（CL）現(xiàn)象。通過(guò)將電化學(xué)和光譜學(xué)的巧妙結(jié)合，不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)裝置，阻斷了發(fā)光雜質(zhì)和散射光的背景響應(yīng)，靈敏度高，還具有較好的特異性、選擇性和再現(xiàn)性。因此，ECL技術(shù)已經(jīng)在微量檢測(cè)、食品與環(huán)境檢測(cè)和成像分析等多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[4]?；凇靶叵汆奏?汞離子-胸腺嘧啶”（T-Hg2+-T）的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[5]，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了各種類型的針對(duì)汞離子的生物傳感器[6-9]。汞離子電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器是將生物傳感技術(shù)與電致化學(xué)發(fā)光相結(jié)合，將汞離子濃度轉(zhuǎn)換為電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)的一種新型傳感器。然而，為了實(shí)現(xiàn)汞離子的靈敏檢測(cè)，信號(hào)輸出模式成為構(gòu)建其電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的關(guān)鍵。該文主要以信號(hào)輸出模式的不同，綜述了近幾年來(lái)基于汞離子電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的相關(guān)研究。

1 “signal on”型信號(hào)輸出模式

早期的研究中，單信號(hào)開(kāi)關(guān)模式（以信號(hào)的減少或增加來(lái)響應(yīng)分析物的存在）被廣泛應(yīng)用于傳感器的構(gòu)建，它具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[10-12]?！皊ignal on”型信號(hào)輸出模式的汞離子電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器是一類隨著分析物汞離子濃度的增加，ECL信號(hào)逐漸增強(qiáng)的傳感器類型，是信號(hào)在目標(biāo)物出現(xiàn)前后信號(hào)由弱到強(qiáng)的過(guò)程，也是最常見(jiàn)的信號(hào)輸出方式，其在原理上具有檢測(cè)范圍寬、背景信號(hào)低等特點(diǎn)[13-16]。基于汞離子極易被富含胸腺嘧啶的核酸捕獲的特性，Guangming Nie團(tuán)隊(duì)采用核酸夾心法通過(guò)金屬汞離子直接引入發(fā)光物質(zhì)構(gòu)建了一個(gè)“signal on”型信號(hào)輸出模式的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器（傳感器構(gòu)建原理如圖1所示）[17]。傳感器以高導(dǎo)電性的聚（5-甲醛吲哚）/還原氧化石墨烯（P5FIn/erGO）作為基底修飾電極，通過(guò)醛基與氨基的共價(jià)偶聯(lián)作用接上富含胸腺嘧啶（T）的DNA單鏈（DNA S1）。金納米粒子（AuNP）連接石墨烯量子點(diǎn)（GQDs）-DNA S3和DNA S2作為ECL信號(hào)探針。AuNP的存在不僅可以增加GQDs的負(fù)載量，還能起到信號(hào)放大的作用。通過(guò)T-Hg2+-T的配位反應(yīng)，在目標(biāo)物Hg2+的存在下信號(hào)探針與DNA S1雜交，將其組裝到修飾電極上，從而實(shí)現(xiàn)了一個(gè)“signal on”型信號(hào)輸出模式。該修飾電極的ECL信號(hào)強(qiáng)度與Hg2+的濃度在0.01 nmol/L至100 nmol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性相關(guān)性，檢測(cè)限為2.48 pmol/L，實(shí)現(xiàn)Hg2+的靈敏檢測(cè)。

圖1 基于直接引入ECL信號(hào)探針DNA S3/AuNP/GQDs生物螯合物的“signal on”型電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備原理[17]Fig.1 Schematic diagram of the ECL sensor based on P5FIn/erGO nanocomposite and GQDs[17]Copyright 2019 Elsevier[17]

此外，Tian-Fang Kang團(tuán)隊(duì)利用同時(shí)引入汞離子結(jié)合的電致化學(xué)發(fā)光共反應(yīng)物的方式，成功構(gòu)建了針對(duì)汞離子的“signal on”型信號(hào)輸出模式的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器[18]。如圖2所示，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）和帶負(fù)電荷的CdSe/CdS量子點(diǎn)依次吸附在MoS2的表面形成QD-PDDA-MoS2復(fù)合材料，同時(shí)將其作為基底固定富含胸腺嘧啶的DNA序列（DNA 1），制備修飾電極。金納米粒子（AuNPs)結(jié)合另一種富含胸腺嘧啶的DNA序列（DNA 2）和葡萄糖氧化酶（GOD）形成GOD-AuNPs-DNA2偶聯(lián)物。反應(yīng)池中同時(shí)引入GOD-AuNPs-DNA2偶聯(lián)物和Hg2+，依賴形成T-Hg2+-T絡(luò)合物將生成QDs共反應(yīng)物H2O2的催化劑GOD引入。GOD催化葡萄糖與溶解氧反應(yīng)生成H2O2，再與QDs作用使ECL信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)隨汞離子的增加而增強(qiáng)。該傳感器的ECL信號(hào)強(qiáng)度與Hg2+的濃度在1.0×10-6mol/L至1.0×10-12mol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性相關(guān)性，檢測(cè)限為1.0×10-13mol/L，實(shí)現(xiàn)了Hg2+的靈敏檢測(cè)。

圖2 基于CdSe/CdS量子點(diǎn)和過(guò)氧化氫共反應(yīng)發(fā)光的“signal on”型電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備原理圖[18]Fig.2 Fabrication process and the determination mechanisms of the electrochemiluminescence sensor[18]Copyright 2019 RSC

2 “signal-off”型信號(hào)輸出模式

在構(gòu)建針對(duì)汞離子的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器中，另一種比較常用的信號(hào)輸出模式為“signal-off”型。它是與“signal-on”型相反的信號(hào)輸出模式，即隨著汞離子濃度的不斷增加，電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸降低[19-21]。以目標(biāo)物汞離子作為電致化學(xué)發(fā)光淬滅劑所構(gòu)建的傳感器便順勢(shì)而生[22]。Ruo Yuan團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)汞離子對(duì)于乙基異魯米諾（ABEI）的電致化學(xué)發(fā)光有淬滅作用[23]。受到這一發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)，他們合成了ABEI功能化銀納米顆粒修飾的氧化石墨烯復(fù)合納米材料（GO-AgNPs-ABEI)作為發(fā)光物質(zhì)，并通過(guò)氨基與醛基的共價(jià)偶聯(lián)作用連接了具有較強(qiáng)促發(fā)光性能的二茂鐵標(biāo)記的ssDNA（Fc-S1)。在H2O2存在下，其作為第一重的信號(hào)開(kāi)關(guān)，產(chǎn)生較強(qiáng)的ECL信號(hào)。隨后，在適配體的作用下，通過(guò)雜化鏈反應(yīng)將輔助ssDNA(S2)、富含胸腺嘧啶ssDNA(S3)的金納米顆粒（AuNPs-S2-S3)固定在傳感平臺(tái)上。通過(guò)強(qiáng)而穩(wěn)定的“T-Hg2+-T”配位作用，汞離子被AuNPs-S2-S3捕獲，有效地淬滅了ABEI的ECL信號(hào)，成功構(gòu)建了信號(hào)“signal-off”的狀態(tài)。黏蛋白MUC1作為適配體特異性靶點(diǎn)與適配體結(jié)合，釋放捕獲Hg2+的核酸納米基團(tuán)，重新開(kāi)啟了信號(hào)，達(dá)到“on”狀態(tài)。該生物傳感器策略結(jié)合Hg2+的猝滅效應(yīng)降低背景信號(hào)，利用目標(biāo)信號(hào)的循環(huán)放大，成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+和MUC1的檢測(cè)，且具有較寬的線性響應(yīng)范圍。Hg2+的濃度在10.0 pmol/L至1.0 mmol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性相關(guān)性，檢測(cè)限為3.1 pmol/L[23](圖3)。

圖3 基于汞離子對(duì)ABEI發(fā)光淬滅作用所設(shè)計(jì)的“signal off”型電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器[23]Fig.3 Fabrication of the signal-switchable ECL aptasensor for Hg2+and MUC1[23]Copyright 2016 ACS[23]

Fen Ma團(tuán)隊(duì)則另辟蹊徑，通過(guò)引入目標(biāo)物汞離子，使得發(fā)光物質(zhì)遠(yuǎn)離電極表面而造成信號(hào)下降，從而構(gòu)建了“signal-off”型信號(hào)輸出模式的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器[24]。DNA三向鏈接（DNATWJ)是一種獨(dú)特的分支結(jié)構(gòu)，由三個(gè)連接在接點(diǎn)處的雙螺旋臂組成。靶向反應(yīng)性DNA-TWJ是將反應(yīng)性結(jié)構(gòu)域作為形成連接的三條臂之一進(jìn)行連接，結(jié)合后的構(gòu)象變化會(huì)導(dǎo)致連接臂彼此之間重新定向。傳感器利用將發(fā)光探針釕配合物（Ru）標(biāo)記的Hg2+特異性DNA-TWJ共價(jià)偶聯(lián)到經(jīng)4-氨基苯甲酸共價(jià)修飾的玻碳電極表面，達(dá)到ECL信號(hào)“on”的狀態(tài)。在Hg2+存在下，Hg2+與TW/Ru-J1結(jié)合后，TW/Ru-J1的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致發(fā)光探針Ru遠(yuǎn)離電極表面，從而降低ECL信號(hào)，達(dá)到“off”狀態(tài)。該生物傳感器在0.1 pmol/L至10 pmol/L范圍內(nèi)，隨著Hg2+濃度的增加，信號(hào)下降并呈線性相關(guān)，檢測(cè)限為0.04 pmol/L（圖4）。

圖4 基于靶觸發(fā)DNA三向鏈接所構(gòu)建針對(duì)汞離子的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器[24]Fig.4 Schematic diagram of the fabrication of DNA-TWJbased ECL biosensor for the detection of Hg2+[24]Copyright 2019 Elsevier

3 “signal on-off-on”型信號(hào)輸出模式

汞離子的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器“on-offon”型信號(hào)輸出模式具體來(lái)說(shuō)包含三個(gè)步驟：第一步是初始的“signal on”狀態(tài)的構(gòu)建，需要較強(qiáng)的ECL信號(hào)響應(yīng)；第二步是引入靈敏的信號(hào)淬滅劑達(dá)到“signal-off”狀態(tài)；第三步“on”，即通過(guò)目標(biāo)物汞離子的引入來(lái)消除淬滅劑的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)[25-26]。與單獨(dú)的“signal on”和“siganl off”信號(hào)輸出模式相比，這種信號(hào)輸出策略不僅具有低背景信號(hào)和高靈敏度，而且還增強(qiáng)了分析檢測(cè)的特異性[27-28]。如圖5所示，Nian Hong團(tuán)隊(duì)基于分子識(shí)別技術(shù)，研制了針對(duì)汞離子的“on-off-on”型信號(hào)輸出模式的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器[29-31]。傳感器通過(guò)將發(fā)光探針三聯(lián)吡啶釕（Ru(bpy)32+)、環(huán)糊精金納米粒子（CD-AuNPs)和Nafion復(fù)合材料修飾在玻碳電極（GCE）表面作為ECL基底獲得強(qiáng)的ECL信號(hào)。再依據(jù)分子識(shí)別策略將一端帶有二茂鐵的單發(fā)夾式DNA探針（Fc-Probe-DNA）通過(guò)超分子識(shí)別作用鏈接CD，獲得“off”信號(hào)。實(shí)驗(yàn)證表明，在沒(méi)有Hg2+的情況下，探針保持著單一的發(fā)夾節(jié)后，因Fc作用導(dǎo)致Ru(bpy)32+的ECL淬滅；而在Hg2+存在下，探針更傾向于形成T-Hg2+-T絡(luò)合物，使Ru（bpy）32+的ECL信號(hào)明顯恢復(fù)，為Hg2+檢測(cè)提供了傳感平臺(tái)。

圖5 基于信號(hào)淬滅的“on-off-on”型信開(kāi)關(guān)模式的汞離子電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器制備[29]Fig.5 Schematic diagram of the fabrication process of ECL-biosensor for the determination of Hg(II)[29]Copyright 2017 Elsevier

隨著ECL研究的不斷進(jìn)步，能量共振轉(zhuǎn)移的淬滅信號(hào)作用為ECL生物傳感器設(shè)計(jì)帶來(lái)了新的契機(jī)[29-31]。Jian-Ding Qiu團(tuán)隊(duì)利用g-C3N4和DNA-Ag NCs的能量共振轉(zhuǎn)移設(shè)計(jì)了“on-off”的ECL信號(hào)輸出，借助Hg2+與DNA的T-Hg2+-T作用減弱能量轉(zhuǎn)移使信號(hào)“on”，獲得較靈敏的汞離子ECL生物傳感器[29-31]。Abdollah Salimi團(tuán)隊(duì)則是利用CdTe@CdSQDs與金納米粒子的能量共振轉(zhuǎn)移設(shè)計(jì)了信號(hào)“on-off-on”輸出模式的汞離子電致化學(xué)發(fā)光傳感器，檢測(cè)線低至2 amol/L[29-31]（圖6）。

圖6 基于能量共振轉(zhuǎn)移的“on-off-on”型信開(kāi)關(guān)模式的汞離子電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器制備[31]Fig.6 Schematic representation of the ECL biosensor for Hg2+detection[31]Copyright 2018 Elsevier

4 比率型信號(hào)輸出模式

汞離子的電致化學(xué)發(fā)光傳感器信號(hào)的“開(kāi)關(guān)”輸出模式主要是基于發(fā)光體ECL發(fā)射強(qiáng)度的變化。在檢測(cè)過(guò)程中由于某些環(huán)境變化，如非目標(biāo)誘導(dǎo)試劑降解、共反應(yīng)物濃度、pH值、濃度等影響發(fā)光效率，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性誤差。為了提高傳感器的準(zhǔn)確性，近年來(lái)，研究者們提出了比率型ECL傳感器，其量化結(jié)果取決于兩個(gè)發(fā)光強(qiáng)度的比值變化而不是絕對(duì)值，通過(guò)自校準(zhǔn)從而提供更精確的測(cè)量結(jié)果[32]。發(fā)光體三聯(lián)吡啶釕（Ru（bpy)32+）與含氮納米材料的共發(fā)光的特性為ECL比率型傳感器的發(fā)展提供了契機(jī)[33-34]。Ru-Ping Liang團(tuán)隊(duì)基于Au-g-C3N4NSs和Ru(bpy)32+雙電位電致化學(xué)發(fā)光的特性建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏、選擇性好的比率型ECL傳感器[35]（圖7）。

圖7 汞離子電致化學(xué)發(fā)光比率型傳感體系構(gòu)建原理圖[35]Fig.7 Ratiometric ECL method for Hg2+monitoring just using Ru(bpy)32+as emitter and Au-g-C3N4NSs as onelectrode coreactant[35]Copyright 2020 RSC

5 總結(jié)和展望

電致化學(xué)發(fā)光在理論和實(shí)際應(yīng)用方面的迅速發(fā)展，有力地證明了其是超靈敏測(cè)定重金屬離子的一種重要途徑。而基于Hg2+自身與胸腺嘧啶的配位特性，針對(duì)Hg2+所構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器則順勢(shì)而生。該文根據(jù)不同的開(kāi)關(guān)模式，回顧了ECL檢測(cè)Hg2+的原理、優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用。這些成果擴(kuò)展了電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)Hg2+的檢測(cè)策略，推動(dòng)了針對(duì)Hg2+的高通量和便捷式電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。而隨著電致化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建比率型電致化學(xué)發(fā)光傳感器以及如何結(jié)合化學(xué)研究領(lǐng)域中的新發(fā)現(xiàn)將成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)及方向。

致謝：

本項(xiàng)目得到了重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心創(chuàng)新人才促進(jìn)計(jì)劃（LTMC201903）和重慶醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科學(xué)研究和創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（SRIEP201966）資助。