基于共反應(yīng)促進劑提高電致化學發(fā)光分析靈敏度的最新研究進展

孫曼菲，柴雅琴，袁 若

（西南大學化學化工學院，重慶400715）

0 前言

電致化學發(fā)光（ECL）是一種由電化學反應(yīng)和化學發(fā)光反應(yīng)聯(lián)合同時發(fā)生在電極表面或附近的發(fā)光過程[1-2]。基于電化學和光譜學的巧妙組合，ECL顯示出了與其他光學方法相比更大的潛能。因此，ECL技術(shù)不僅具有傳統(tǒng)化學發(fā)光靈敏度高和動態(tài)范圍廣的優(yōu)勢，同時還具備了電化學方法穩(wěn)定、簡易、可控等優(yōu)點。與熒光相比，ECL不需要外部光源，不僅儀器設(shè)備簡單，而且避免了發(fā)光雜質(zhì)和散射光產(chǎn)生的背景響應(yīng)，所以具有高靈敏度。并且，由于ECL發(fā)光材料靠近電極表面，因此ECL對發(fā)光的位置有較好的控制。最后，ECL能在操作中更精確地控制時間，進一步提高了它們的簡易性和重現(xiàn)性[3]。因此，ECL作為一種優(yōu)秀的分析技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用于與分析化學相關(guān)的領(lǐng)域，例如醫(yī)學診斷、食品和水中的危險化學品檢測和生物試劑檢測等[4]。

對ECL的研究可以追溯到20世紀60年代，當時Hercules和Bard首次提出了ECL技術(shù)理論和具體研究[5-6]，并報告了他們的開創(chuàng)性研究工作。此后，在揭示ECL機理和設(shè)計ECL傳感器方面進行了大量的探索。到目前為止，ECL過程中已經(jīng)證實了兩種主要的發(fā)光途徑：湮滅途徑和共反應(yīng)物途徑[7]。對于共反應(yīng)物途徑，ECL過程是在系統(tǒng)中有ECL發(fā)射器和共反應(yīng)物存在的情況下，通過單一方向的電位掃描來完成的。通過電化學氧化或還原，共反應(yīng)物被分解成活性中間體與ECL發(fā)光團發(fā)生反應(yīng)，在此過程中，發(fā)光團轉(zhuǎn)化為發(fā)光體。與湮沒途徑相比，共反應(yīng)物途徑具有更好的自由基離子穩(wěn)定性和更強的ECL發(fā)射能力，在構(gòu)建靈敏可靠的ECL生物傳感器方面具有更大的應(yīng)用前景[8]。

為了進一步提高共反應(yīng)物和ECL發(fā)光體的反應(yīng)效率，課題組基于共反應(yīng)物途徑引入了共反應(yīng)物促進劑，進一步推動了ECL發(fā)光機理的深入研究[9]。共反應(yīng)促進劑是通過催化共反應(yīng)物分解成活性自由基，進而增強ECL發(fā)光體的發(fā)射。值得注意的是，共反應(yīng)促進劑的發(fā)展主要集中在納米材料的研究上。然而，納米材料基共反應(yīng)促進劑的ECL性能受到其不同尺寸、形狀和化學成分的顯著影響，這使得ECL共反應(yīng)促進劑的結(jié)構(gòu)-性能相關(guān)性難以揭示。因此，設(shè)計具有明確活性中心的共反應(yīng)促進劑，簡化模型結(jié)構(gòu)的建立和相應(yīng)的理論計算，從而深入了解其基本機理是非常需要的。

雖然前人已經(jīng)報道了幾篇關(guān)于ECL傳感器研究的綜述，但它們主要集中在新型發(fā)光材料和ECL傳感策略上[10-11]。很少有人從新型共反應(yīng)促進劑的設(shè)計和應(yīng)用的角度對ECL傳感器的發(fā)展進行評述。該文主要基于共反應(yīng)促進劑綜述了近年來用于靈敏ECL傳感的共反應(yīng)加速器的研究進展。此外，簡要討論了基本機制和常見的傳感策略，以促進理解催化的本質(zhì)。最后，總結(jié)了高性能ECL傳感器共反應(yīng)加速器的發(fā)展前景和面臨的挑戰(zhàn)。

1 電致化學發(fā)光機制

1.1 湮滅途徑

離子湮滅反應(yīng)是通過施加一定電壓后，ECL發(fā)光體經(jīng)過電化學氧化或還原產(chǎn)生自由基陽/陰離子，然后產(chǎn)生的自由基離子相互反應(yīng)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)物質(zhì)弛豫發(fā)射光的過程[12]。其中，湮滅過程中產(chǎn)生的自由基陽離子和自由基陰離子可以來自相同分子也可以來自不同分子。離子湮滅過程一般在有機溶劑中進行，因為需要陽離子和陰離子保持相對穩(wěn)定性。湮滅過程的優(yōu)勢是它僅需ECL發(fā)光體、溶劑和支持電解質(zhì)就能產(chǎn)生光。但是，由于生物分析運用主要在水溶液中進行，有機溶劑中的ECL無法應(yīng)用于生物傳感。其中，離子湮滅反應(yīng)中的一個典型的例子是9,10-二苯蒽（9,10-diphenylanthracene,DPA），它的ECL發(fā)光機理如下[6]：

1.2 共反應(yīng)物途徑

在ECL共反應(yīng)物途徑中，主要通過在含有ECL發(fā)光體和共反應(yīng)物溶液中的電極上進行循環(huán)電位掃描來產(chǎn)生ECL現(xiàn)象[13]。首先，發(fā)光體和共反應(yīng)物同時被電化學氧化/還原，之后被氧化/還原的共反應(yīng)物產(chǎn)生中間體通過分解生成強還原/氧化物質(zhì)與被氧化/還原的發(fā)光體發(fā)生化學反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)，通過輻射躍遷發(fā)光。在ECL生物傳感的共反應(yīng)物途徑中，發(fā)光體主要包括無機絡(luò)合物、有機化合物和納米材料等，而共反應(yīng)物主要有陰極共反應(yīng)物過硫酸根（S2O82-）和陽極共反應(yīng)物三丙胺（TPA），三乙醇胺（TEA），過氧化氫（H2O2）等[14]。因此，使用共反應(yīng)物方法的主要優(yōu)點是克服了湮滅方式不能在水溶液中反應(yīng)的缺陷，開辟了廣泛的生物分析方法，同時加入共反應(yīng)物可以實現(xiàn)更高的ECL發(fā)射。以g-C3N4/TPA為例，簡要描述了共反應(yīng)物型的ECL過程如下[15]：

1.3 共反應(yīng)物促進途徑

為了進一步提高ECL的強度，袁若小組報道了共反應(yīng)促進劑，它能與共反應(yīng)試劑相互作用，顯著提高發(fā)光體和共反應(yīng)物的ECL反應(yīng)速率。在共反應(yīng)促進劑的催化下，共反應(yīng)物更容易分解成活性自由基，放大發(fā)光體的ECL發(fā)射，從而提高了ECL傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性[16]。自從馬等人首次提出以氨基脲作為共反應(yīng)物來促進CdTe QDs/S2O82-體系的ECL反應(yīng)速率，增強了ECL信號。近年來，已逐漸開發(fā)出各種不同種類的共反應(yīng)促進劑（比如納米材料，單原子材料，有機小分子等）用于不同的ECL共反應(yīng)物體系（比如S2O82-，溶解氧，H2O2）[17]。 其中，以氨基脲（Sem）作為共反應(yīng)促進劑在CdTe QDs/S2O82-體系中的ECL促進機理如下圖1所示：

圖1 氨基脲為共反應(yīng)促進劑的ECL機理示意圖[9]Fig.1 Schematic diagram of ECL mechanism of semicarbazide as co-reaction accelerator[9]

2 共反應(yīng)促進劑在ECL傳感器中的應(yīng)用

2.1 過硫酸根為共反應(yīng)試劑的ECL體系

過硫酸根（S2O82-）是釕配合物、量子點和金屬納米簇等多種發(fā)光體應(yīng)用最廣泛的陰極ECL共反應(yīng)物。據(jù)報道，以S2O82-作為共反應(yīng)物可能的ECL機制如下：S2O82-最初通過電化學反應(yīng)生產(chǎn)SO4·-氧化中間體，它可以與ECL發(fā)光體（Emitters，E）反應(yīng)注入電子占據(jù)分子軌道生成激發(fā)態(tài)的發(fā)光體（Emitters*，E*）。當激發(fā)態(tài)的發(fā)光體（E*）衰減回基態(tài)時產(chǎn)生ECL發(fā)射[18]：

因此，ECL的強度與氧化中間體的數(shù)量密切相關(guān)。發(fā)光過程中產(chǎn)生的SO4·-量越多，ECL響應(yīng)就越強。通過研究，提高SO4·-產(chǎn)量的可行途徑有兩種：一種是提高S2O82-濃度，另一種是利用共反應(yīng)促進劑加速S2O82-的電化學還原。然而，由于S2O82-的溶解度有限，并且S2O82-的濃度與SO4·-的量呈非絕對線性關(guān)系，僅僅提高S2O82-的濃度對ECL強度的增強作用有限[19]。因此，在ECL體系中引入共反應(yīng)促進劑可以通過加速S2O82-的還原來促進SO4·-氧化中間體的生成，從而增加發(fā)光體的激發(fā)態(tài)，以此來放大ECL信號。自從馬等人[9]首次報道了以氨基脲為共反應(yīng)促進劑的ECL/S2O82-陰極體系以來，人們陸續(xù)開發(fā)出各種納米材料包括金屬納米簇（如金簇，銀簇等）[20-21]，金屬氧化物（Cu2O，TiO2和Fe3O4-CeO2）[22-24]以及有機納 米 材 料（Ru@MOF，IRMOF-3，Ag+@UIO-66-NH2）[25-27]等材料作為高效共反應(yīng)促進劑來促進ECL發(fā)射進而增強S2O82-的ECL體系的發(fā)光效率。

袁若課題組廖等人[28]運用TiO2作為共反應(yīng)促進劑構(gòu)建了超靈敏的ECL生物傳感器，并通過電化學反應(yīng)原位生成的銅納米團簇（Cu NCs）作為ECL發(fā)光體用于檢測microRNA（如圖2所示）。在該傳感界面中引入的TiO2納米材料，不僅可以作為ECL共反應(yīng)試劑促進了共反應(yīng)物S2O82-的還原，并顯著提高了Cu NCs的ECL效率，同時還可以作為穩(wěn)定Cu NCs的固定基質(zhì)。由此可見，共反應(yīng)促進劑的開發(fā)和應(yīng)用不斷拓寬了ECL分析領(lǐng)域的發(fā)展。

圖2 基于TiO2為共反應(yīng)促進劑構(gòu)建ECL生物傳感器[28]Fig.2 Schematic diagrams shown the establishment process of biosensor for the ultrasensitive determination of miRNA-21[28]

近年來，周瑩等[24]還發(fā)現(xiàn)Fe3O4-CeO2納米復合材料其具有氧化還原對Ce3+/Ce4+的可逆和快速切換，對S2O82-的還原具有增強的催化活性（如圖3所示）。他們將其作為共反應(yīng)促進劑，可以顯著促進Ag NCs/S2O82-體系的ECL發(fā)射。因此，進一步不斷開發(fā)新型納米材料用于促進陰極S2O82-/ECL體系十分的重要。

圖3 ECL生物傳感器制造原理圖[24]Fig.3 Schematic diagrams showing fabrication of the ECL biosensor[24]

2.2 過氧化氫為共反應(yīng)試劑的ECL體系

以S2O82-為共反應(yīng)物的ECL體系通常需要電化學檢測電位大于-1.5 V才能獲得足夠強的ECL強度，這可能會引入更多的干擾或使電極損壞。相比之下，以H2O2為共反應(yīng)物的ECL僅需要較低的激發(fā)電位就能獲得較高的ECL效率。H2O2可以產(chǎn)生OH·和O2·-等氧相關(guān)的自由基，并作為共反應(yīng)物用于魯米諾及其衍生物等發(fā)光體增強ECL發(fā)射。辣根過氧化物酶（HRP）因其對H2O2分解具有優(yōu)異的催化作用而被廣泛用于提高魯米諾/H2O2體系的ECL反應(yīng)[29]。但HRP仍具有成本高、穩(wěn)定性差、易變性等缺點[30]。目前因納米材料具有優(yōu)良的催化性能，克服了HRP的缺點，是H2O2共反應(yīng)物ECL的良好替代共反應(yīng)促進劑[31]。以咪唑基沸石骨架（ZIF-67）[32]、MIL-53(Fe)-NH2[33]、Co-MOFs[34]、鐵蛋白（Ft）[35]、MoS2NF[36]、CuS多孔納米球（CuS PNSs）[29]、CoFe2O4[37]、V2O5納米球[38]等一系列具有加速H2O2分解作用的MOFs作為H2O2/ECL體系的共反應(yīng)促進劑。

MOFs因其具有良好的催化性能和較大的比表面積，是H2O2共反應(yīng)物ECL的有效共反應(yīng)促進劑。Wang等[32]開發(fā)了一種提高魯米諾/H2O2體系ECL效率的有效策略，即將Co2+基MOF、ZIF-67和魯米諾包封的Ag NPs（魯米諾-Ag NPs）組裝在一起（如圖4所示）。ZIF-67由于其有序的晶體結(jié)構(gòu)、孔隙率和原子分散的Co2+，有利于H2O2的還原，產(chǎn)生更多的氧自由基（O2·-），導致ECL明顯增強。ZIF-67具有較高的比表面積，為魯米諾-Ag NPs的體系提供了良好的平臺，避免了Ag NPs的團聚。ZIF-67和Ag NPs的聯(lián)合使用使魯米諾ECL顯著增強（約115倍）。以魯米諾-Ag NPs@ZIF-67為傳感平臺，采用穩(wěn)定的無標記ECL免疫傳感器實現(xiàn)了對急性心肌梗死標志物心肌肌鈣蛋白I的超靈敏檢測。

圖4 基于Co-based MOF和AgNPs復合納米材料的魯米諾ECL增強示意圖[32]Fig.4 Schematic illustration of the integration of Co-based MOF and AgNPs for the enhancement of luminol ECL[32]

2.3 溶解氧為共反應(yīng)試劑的ECL體系

與H2O2在溶液中不穩(wěn)定、對生物分子有害的缺陷相比，溶解氧在產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）與發(fā)光團反應(yīng)時具有相同的特性，且無毒，是ECL生物傳感的理想替代共反應(yīng)物[39]。此外，與強氧化共反應(yīng)物S2O82-相比，溶解氧O2作為內(nèi)源性共反應(yīng)物具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單等優(yōu)點，可用于CdTe、CdS、魯米諾及其衍生物的ECL發(fā)射[40]。然而，溶解O2轉(zhuǎn)化為ROS的效率有限，導致發(fā)光體/溶解O2體系的ECL發(fā)射微弱。因此，提高溶解氧的還原效率，產(chǎn)生更多ROS，顯著提高O2參與系統(tǒng)ECL排放至關(guān)重要。目前各種納米材料包括Au NFs、Pt NPs、Pt NFs以及Au-Ag-Pt、CeO2/SnS2等雜單結(jié)構(gòu)被用于促進溶解O2生成更多的ROS中間體，從而大大提高ECL發(fā)射[41-43]。

一般來說，納米材料可以作為ECL溶解O2體系的共反應(yīng)促進劑，通常通過催化溶解O2生成H2O2進一步生成ROS來促進ECL發(fā)射。胡等人[44]報道，Au NFs材料具有獨特的幾何和空間效應(yīng)，可以作為魯米諾/O2系統(tǒng)ECL的有效共反應(yīng)促進劑（如圖5所示）。該體系以三（羥甲基）氨基甲烷為電子供體，在Au-NFs/ITO電極上高效催化H2O2還原。原位生成的H2O2可以更有效地產(chǎn)生各種ROS作為中間體，顯著增強了魯米諾的ECL信號。劉等人[42]用兩種Pt NMs作為紅熒烯微棒（RubMRs）/O2ECL體系的共反應(yīng)促進劑：一種是在RubMRs上原位還原Pt NFs;另一種是標記在輸出DNA上的Pt NPs（如圖6所示）。在microRNA存在的情況下，目標物誘導的循環(huán)酶擴增產(chǎn)生大量S1/Pt NPs，取代了猝滅劑Fc-DNA，從而恢復了ECL信號。Pt NFs和Pt NPs均能促進溶解氧的還原，產(chǎn)生更多ROS（O2·-、OH·）與Rub·+相互作用?；陔p共反應(yīng)促進劑，一個超級信號的狀態(tài)與一個更強的ECL信號，從而實現(xiàn)了顯著提高靈敏度。

圖5 （A）牛血清白蛋白/抗甲胎蛋白/AuNFs/ITO免疫傳感器制備工藝示意圖；（B）魯米諾-O2系統(tǒng)可能的ECL機制[44]Fig.5 Schematic illustration of(A)fabrication process of BSA/anti-AFP/AuNFs/ITO immunosensor;(B)possible ECL mechanism of the luminol-O2 system[44]

圖6 （A）PtNFs@RubMRs的制備流程（B）生物傳感器的制備（C）RubMRs可能的反應(yīng)機理示意圖[42]Fig.6 Schematic illustration of(A)the synthesis of the PtNFs@RubMRs(B)fabrication of the biosensor,and(C)possible reaction mechanism of the RubMRs[42]

2.4 胺類物質(zhì)為共反應(yīng)試劑的ECL體系

胺類共反應(yīng)物如TPA和三乙胺（TEA）的共反應(yīng)促進劑的研究仍處于起步階段。目前，只有少量的Cu2S納米花[45]、Pd@CuO[46]、TiO2納米針[47]等納米材料可作為以胺類共反應(yīng)物的ECL共反應(yīng)促進劑。Cu2S納米花可以顯著提高Au NCs/TEA體系的ECL強度，其主要作用有兩個：一是作為連接免疫分子的底物，二是作為共反應(yīng)促進劑促進了陽離子自由基TEA·+的產(chǎn)生，從而可以氧化Au NCs，得到Au NCs·+的自由基陽離子。此外，TEA·+通過脫質(zhì)子生成的TEA·可以使Au NCs還原成Au NCs－，Au NCs與Au NCs·+反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)Au NCs*。當Au NCs*衰變到基態(tài)時發(fā)生ECL發(fā)射。因此TEA·+的加入量決定了整個過程的ECL效率，而Cu2S可以促進更多中間TEA·+的生成，加速后續(xù)電極反應(yīng)。Jian等[48]報道了AuPd NPs可以作為共反應(yīng)促進劑（如圖7所示），通過催化H2O2分解形成OH，進而與TPA反應(yīng)產(chǎn)生更多的TPA，從而增強Ru@SiO2-Au/TPA的ECL，從而產(chǎn)生強ECL信號。

圖7 （A）ECL檢測區(qū)制造流程示意圖及相應(yīng)檢測機制;(B)ECL體系的可能機制[48]Fig.7 Schematic diagram of the manufacture procedures for the ECL detection area and the corresponding detection mechanism;(B)The possible mechanism of ECL system[48]

3 研究前景和展望

共反應(yīng)促進劑是通過促進生成更多的共反應(yīng)物中間體來增強ECL的強度。由于其通用性、簡易性和高靈敏度等優(yōu)勢，基于共反應(yīng)試劑的ECL增強技術(shù)得到了人們的廣泛關(guān)注。將共反應(yīng)促進劑與ECL的固有優(yōu)勢相結(jié)合不僅有趣，而且由于提高了靈敏度，有可能進一步擴大ECL的應(yīng)用范圍。其中可應(yīng)用于各種分析物，包括蛋白質(zhì)生物標記物、microRNA、腫瘤細胞和重金屬離子，都可以以超低的檢測限進行檢測，這在早期臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品安全方面很有前景。此外，基于納米材料的共反應(yīng)促進劑不僅可以作為促進ECL反應(yīng)的共反應(yīng)促進劑，而且還可以作為固載大量熒光團或抗體、適配體等生物分子的優(yōu)良底物。

盡管共反應(yīng)促進劑的研發(fā)和應(yīng)用發(fā)展勢頭迅猛，但目前仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。第一，由于目前的機理主要是由以前的理論推導出來的需要深入探索基于共反應(yīng)促進劑的ECL增強機制。未來還需要更多的實驗探究來證明ECL機制與共反應(yīng)促進劑類型之間的關(guān)系，以及通過ECL光譜等來驗證所提機制的有效性。了解基于共反應(yīng)促進劑增強ECL的機理有助于制備具有高ECL效率和低電勢的新型共反應(yīng)促進劑。第二，納米材料共反應(yīng)促進劑的制備技術(shù)應(yīng)得到發(fā)展，使其尺寸和形狀得到精確控制，從而在更廣泛的生物分析領(lǐng)域得到應(yīng)用。第三，目前基于共反應(yīng)促進劑的ECL體系在細胞ECL成像中的應(yīng)用仍處于起步階段?；诠卜磻?yīng)促進劑增強ECL具有顯著的信號放大和準確的特異性識別，可以滿足細胞ECL成像的需要。因此，未來的研究將集中于開發(fā)基于共反應(yīng)促進劑的ECL成像，以滿足研究和臨床診斷的需求。綜上所述，尋求具有理想結(jié)構(gòu)和高效率的共反應(yīng)促進劑的制備將是一個新的研究方向，基于共反應(yīng)促進劑的ECL將在更多的現(xiàn)場和實時分析應(yīng)用中得到應(yīng)用。