肺移植缺血-再灌注損傷動物模型研究進展

李玥寧 ， 程霽婷 ， 周思恒 ， 李紅鵬 ， 李慶云

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 上海交通大學醫(yī)學院呼吸病研究所，上海 200025；2.上海交通大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，上海 200025）

肺移植后缺血-再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷及相關(guān)并發(fā)癥影響肺移植成功率和遠期療效。 建立恰當?shù)姆我浦睮R 動物模型可為探究減輕移植肺損傷的機制和策略奠定基礎(chǔ)。

動物選擇

迄今，用于建立肺移植模型的動物有小鼠、大鼠、兔、犬和豬等。1997 至2006 年報道的動物實驗中，2/3 選用嚙齒動物，其體積較小，飼養(yǎng)成本低和用藥劑量少，實驗成本較低；且小鼠的生物試劑類型較多，無需另外制備。 不過，由于動物體積較小，因此手術(shù)過程中易損傷其他器官，操作困難。家兔手術(shù)操作較簡單，但術(shù)中易猝死。 犬和豬等大型動物手術(shù)過程簡單，可用于監(jiān)測呼吸、血流動力學的實驗和某些臨床應用前的驗證性試驗，然而成本較高[1-2]。 另有少數(shù)研究采用長尾獼猴、羊及牛等[3]。

模型分類及應用

肺移植模型包括原位肺移植模型和IR 損傷替代模型。原位肺移植模型能模擬肺移植的全過程，但操作復雜，目前常采用改良三套管法[4]建立模型；IR 損傷替代模型操作簡單，可行性高，但僅能模擬肺移植的部分病理生理過程。 目前替代模型有“肺離體再灌注模型”和“肺門夾閉熱缺血模型”，前者是將離體肺連接到類似體外循環(huán)的獨立灌注系統(tǒng)中，進行人工控制通氣和循環(huán)支持，優(yōu)點在于對肺循環(huán)和肺通氣的精確控制，缺點是需體外循環(huán)設(shè)備[5]；后者通過顯微外科技術(shù)夾閉單側(cè)肺門，阻斷該側(cè)通氣與血流一段時間，模擬肺移植過程中IR 損傷的效果[6]，操作較簡單。

一、大鼠原位肺移植模型

1971 年Asimacopoulos 等[7]首次建立了大鼠原位肺移植模型，但操作難度大且成功率低。 1989 年Mizuta 等[8]將套管技術(shù)用于肺移植模型中肺動靜脈的吻合， 有效縮短手術(shù)時間并降低難度，隨后又在支氣管吻合中使用此技術(shù)，為三套管法的雛形。 近年來，部分學者在傳統(tǒng)三套管法的基礎(chǔ)上進行改進，以提高肺移植模型的成功率和降低手術(shù)難度。 戴斌等[9]選擇暫不移除受體原左肺并牽出胸腔，以利于暴露肺門部肺動脈、肺靜脈及支氣管，開闊手術(shù)視野，還可減輕對右側(cè)肺和縱隔的壓迫。 此外，在供肺吻合過程中，保留原左肺動靜脈及支氣管的1/2 管壁做牽引，代替?zhèn)鹘y(tǒng)三套管法中完全離斷受體原左肺再吻合，有助于防止血管撕裂、保持吻合方向及避免吻合口扭轉(zhuǎn)。Habertheuer 等[10]采用受體近端套管技術(shù)，即在受體肺動脈和肺靜脈上放置套管，而非對供體血管套管。 研究者還采用受體的左下葉肺靜脈進行靜脈吻合，而非肺動脈干， 并使用三軸血管夾穩(wěn)定器裝置使血管夾在胸腔內(nèi)穩(wěn)定地夾緊支氣管和血管， 從而避免干擾心臟和對側(cè)肺運動，成功率提高。

近期，Chang 等[11]建立大鼠原位左肺移植模型，研究含低濃度的人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶中提取的新型肽GV1001 的肺保存液對肺移植后IR 損傷的保護作用， 結(jié)果表明低濃度GV1001 具有潛在的保護作用，因此，在適當?shù)臐舛确秶鷥?nèi)，GV1001 有望成為緩解IR 損傷的抗炎藥；Liu 等[12]應用三套管法建立大鼠原位肺移植模型，研究自噬在冷IR 損傷中的作用，發(fā)現(xiàn)自噬在冷IR 過程中被激活，調(diào)節(jié)大鼠肺移植模型的自噬水平，可干預冷IR 損傷。 Ohsumi 等[13]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠原位肺移植模型中， 七氟醚預處理或后處理肺對早期IR損傷具有保護作用；此外，移植肺中緩激肽水平降低對IR 損傷也有保護作用[14]。 Rajab 等[15]在吻合肺動脈、肺靜脈及支氣管前，先向受體大鼠靜脈注射脂肪乳劑（intralipid，ILP），研究發(fā)現(xiàn)， 與對照組比較，ILP 能顯著提高經(jīng)歷6 h 冷缺血和24 h 再灌注原位移植肺的氧合能力；Das 等[16]應用原位肺移植大鼠模型， 比較吸入納米顆粒他克莫司和肌肉注射他克莫司的免疫抑制效果，發(fā)現(xiàn)兩者效果相似，但吸入法可降低腎毒性等不良反應發(fā)生的可能。Watanabe 等[17]利用大鼠原位肺移植模型， 證實脂肪組織源性間充質(zhì)干細胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，ADMSC）可強化他克莫司降低同種異體移植免疫反應的作用， 且能減少肺移植后所需免疫抑制藥物的劑量及相關(guān)并發(fā)癥。

二、IR損傷替代模型

1.肺離體再灌注模型： 此模型實質(zhì)上是將離體肺連接于體外循環(huán)的獨立灌注系統(tǒng)中。 王波等[18]選用SD（Sprague-Dawley）大鼠，麻醉后氣管插管，接動物呼吸機。切開胸骨，取出心、肺組織，呈半膨脹狀態(tài)時完全浸入4℃低鉀右旋糖酐（low potassium dextran，LPD）液 6 h。 心、肺組織從保存液中取出, 垂直懸掛于恒溫容器中灌注。 灌注期間呼吸機通氣。而后建立同種異體血循環(huán)通路， 首先經(jīng)充氮氣膜肺將流入道血液去氧化, 再經(jīng)熱交換器變溫后的 37℃去氧化靜脈血用滾壓泵以 40 mL/（kg·min） 流速通過 16 號導管經(jīng)肺動脈灌入雙肺， 經(jīng)肺氧合后因重力經(jīng)左心房道流入儲血器后再回滾壓泵，連續(xù)循環(huán)灌注。 離體肺持續(xù)灌注1 h 后成功建立IR 損傷模型。 Liu 等[19]應用此模型觀察到缺血前給予異氟醚和七氟醚可抑制灌注液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH） 活性， 并增加腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 濃度，以減輕大鼠離體 IR 損傷。 Wu等[20]用大鼠離體肺持續(xù)灌注和停止通氣60 min 再通氣60 min 建立模型，研究發(fā)現(xiàn)煙酸預處理可抑制肺的氧化應激和炎癥損傷，且能減輕IR 損傷引起的肺泡-毛細血管屏障功能障礙。 周縯[21]和李夢倩等[22-23]應用此類模型，研究了右美托咪定對肺IR 損傷的保護作用，證實了右美托咪定通過抑制胞外信號調(diào)節(jié)激酶 （extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2 和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）激活以及抑制受體相互作用蛋白激酶 3 （receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）/混合系列蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域 （mixed lineage kinase domain-like，MLKL）介導的肺組織細胞程序性壞死來減輕大鼠離體肺IR 損傷。

2.肺門夾閉熱缺血模型：急性肺IR 模型有大鼠、小鼠和犬科模型3 種。

（1）大鼠模型：楊世疆等[24]選用無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級 Wistar 大鼠，麻醉后氣管切開，接小動物呼吸機。打開胸腔，用顯微血管夾或血管鉗[25]自左上向右下夾閉左側(cè)肺門（左肺無通氣，肺門血管無舒縮提示阻斷滿意）。 潮氣量減少1/3 后，暫時關(guān)閉手術(shù)切口，保持肺門阻斷60 min。 再打開胸腔，取出血管夾，手控呼吸至左肺完全復張，關(guān)閉胸腔，繼續(xù)輔助呼吸120 min 后拔出氣管插管。吳智勇等[26]通過物理降溫后阻斷左肺門30 min，再以紅外線燈復溫2 h 的方法，成功建立大鼠深低溫肺IR 模型。Yabuki 等[27]選用8 周齡大鼠，適應1 周后麻醉，經(jīng)氣管插管機械通氣，吸入室內(nèi)空氣，呼吸頻率為80 次/min，呼氣末正壓2 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），維持麻醉。固定于右側(cè)臥位，左側(cè)后外側(cè)開胸，經(jīng)第5 肋間隙開胸。 左肺韌帶、左肺門切除后，經(jīng)左奇靜脈注射50 U 肝素。 肝素給藥后5 min，結(jié)束吸氣，分別用微血管夾鉗夾閉左肺動脈、左肺靜脈和左支氣管。 在左肺通過濕紗布覆蓋保證胸腔37～38℃并保持120 min 的缺血，120 min 后取微血管夾，左肺通氣再灌注。閆小強等[28]選用健康成年2 月齡SD 大鼠，雌雄不限，體重250～300 g，采用夾閉左肺門45 min 再灌注120 min 的方法制備肺IR 損傷模型。

（2）小鼠模型 ：鄭志坤等[29]選用 SPF 級 C57BL/6J 小鼠。腹腔注射麻醉。 靜脈留置針于小鼠聲門開放時插入氣管，連接小動物呼吸機。打開胸腔，充分暴露手術(shù)視野。用顯微血管夾自左上往右下夾閉左側(cè)肺門，將排氣量減少1/3，暫時關(guān)閉胸腔，阻斷60 min 后再次打開。 取出血管夾，手控呼吸至左肺完全復張，關(guān)閉胸腔，置于32℃恒溫箱中，待小鼠完全蘇醒后拔出氣管插管。 也有應用左胸開放后阻斷肺門的方法，缺血時間 30 min 或 60 min，再灌注時間 60 min 或 3 h不等[30-34]。 Razi 等[33]應用小鼠肺IR 模型研究發(fā)現(xiàn)天然抗氧化劑膳食亞麻籽（flax seed，F(xiàn)S）可減輕肺 IR 損傷，10%FS喂養(yǎng)可使細胞凋亡蛋白酶水平顯著降低，凋亡活性下降。 肺勻漿和支氣管肺泡灌洗液分析顯示炎癥浸潤明顯減少，抗氧化酶表達明顯增加，肺損傷標志物減少。

（3）犬科模型：犬科動物是大動物移植模型的首選[35]。 蘇雷等[36]應用血管夾夾閉成年犬左主支氣管及左肺動脈和靜脈，熱缺血1 h 后，在放有冰塊和冷生理鹽水的塑料袋中模擬冷缺血2 h；去除血管夾，使左肺血流恢復再灌注6 h，成功建立犬肺移植IR 損傷模型[36-37]。 應用犬肺移植IR 損傷模型研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑ONO-5064 Na 有助于減輕犬單肺移植IR 損傷[38]。 Wada 等[39]應用此模型證實犬肺移植模型遠端氣道上皮內(nèi)襯液中TNF-α、白介素-6（interleukin，IL-6）和 干 擾 素-γ（interferon，IFN-γ）的 時 間 變化；Ibrahim 等[40]評估了犬肺IR 損傷模型中人重組后腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）雙磷酸酶的治療作用，發(fā)現(xiàn)胞外ATP（extracellular ATP，eATP）的積聚與移植肺的 IR相關(guān)，減少局部eATP 堆積可能有助于減輕移植肺的IR 損傷。 Luh 等[41]應用犬肺IR 損傷模型研究蛋白酶抑制劑加貝酯甲磺酸鹽（gabexate mesilate，F(xiàn)OY）對犬肺IR 模型的影響，證實了FOY 可通過改善犬肺泡膜通透性、中性粒細胞浸潤和活化程度，以減輕IR 誘導的急性肺損傷。張皓[42]亦用類似的方法，成功建立犬肺IR 損傷模型，用以研究去氫駱駝蓬堿在犬肺IR 損傷中的作用及機制。

建立理想的肺移植模型是研究IR 損傷機制并確定防治措施，以及改進手術(shù)方法的基礎(chǔ)。隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展，大鼠、小鼠因其實驗成本低更受研究人員的青睞。 在模型選擇方面，原位肺移植模型能夠模擬肺移植的全部過程，光鏡下即可觀察到移植肺出現(xiàn)典型的IR 損傷病理變化。 但其操作過程復雜， 研究者需要較高的外科手術(shù)水平和豐富的經(jīng)驗；肺離體再灌注模型對實驗器材要求較高；肺門夾閉熱缺血模型雖僅能模擬IR 過程，但其操作簡單，單人即可完成[20]。因此，實驗時可根據(jù)研究目的和條件選擇合適的造模方法。