氫氣醫(yī)學(xué)研究中給氫方式選擇及研究進(jìn)展

李恒宇， 李嘉圖， 林瑩妮， 李紅鵬， 李慶云

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸病研究所，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025）

氫氣（H2）是一種常溫下惰性氣體，具有一定還原性，還通過清除氧自由基及調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等機(jī)制來對多種疾病起到治療作用。 相關(guān)研究中所采用的給氫方式包括吸入H2、腹腔注射富氫液體或促進(jìn)內(nèi)生H2等，給氫方式的選擇還取決于具體研究目的。 本文對H2醫(yī)學(xué)研究給氫方式的選擇及相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

H2醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展沿革

早在1975 年，《科學(xué)》雜志上最早發(fā)表高壓H2用于治療無毛白化病大鼠皮膚癌模型[1]，該文提出H2能清除羥基自由基。 但是由于高壓H2實驗難以重復(fù)， 未見后續(xù)研究報道。Ohsawa 等[2]于2007 年提出H2可通過清除羥自由基，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷， 開啟了H2醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域的新篇章。 自此，H2作為治療性氣體在多種疾病中的應(yīng)用得到廣泛研究。 2008 年，Cai 等［3］在國際上首次證實了吸入 H2對新生兒缺血缺氧性腦病具有良好療效。 同年，Kajiyama 等［4］證明了飲用富氫水可治療人類代謝綜合征和早期糖尿病。 鑒于飲用氫水不能提供穩(wěn)定且持續(xù)的 H2，2009 年Shimouchi等［5］嘗試應(yīng)用牛奶動員腸道細(xì)菌產(chǎn)生H2，發(fā)現(xiàn)與飲用氫水組相比，牛奶可使受試者穩(wěn)定且持續(xù)地呼出H2，但此試驗對乳糖不耐受人群并不適宜，且產(chǎn)量與作用范圍有限，現(xiàn)實應(yīng)用價值不高，故后續(xù)研究不多。 2010 年，日本學(xué)者證明含氫水滴眼可治療視網(wǎng)膜缺血［6］，提出局部用藥新思路。 同年，Kawamura 等［7］發(fā)現(xiàn)用2%含H2氣體灌注離體肺可顯著抑制多種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，預(yù)防移植肺的缺血再灌注損傷，延長保存時間。 后續(xù)研究顯示，H2對移植肺的冷缺血期、再灌注期以及離體肺灌注支持過程中均有保護(hù)作用。 近年來，研究還證實含H2腹膜透析液可改善透析液誘導(dǎo)的腹膜損傷［8］；吸入2%含H2氣體可減輕小腸移植后的氧化應(yīng)激及炎癥[9]；2%含H2氣體灌注降低豬的離體肺白介素（interleukin,IL）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）-α的表達(dá)等［10］。

供氫途徑選擇及研究進(jìn)展

一、含H2氣體

1.吸入途徑：最早的外源性H2吸入應(yīng)用于潛水醫(yī)學(xué)領(lǐng)域， 主要為了增加潛水深度并避免氮麻醉而選擇氫氧混合氣作為呼吸介質(zhì)。 雖此舉并非為了治療疾病，但首次證實了吸入H2的安全性。 目前可利用H2電解水生成裝置，通過面罩或鼻導(dǎo)管同時為患者提供氧氣（O2）與H2。 此法反應(yīng)快速，給藥直接，但持續(xù)吸入效果并不理想。 而且，若氫氧比例失調(diào)易發(fā)生爆炸危險，因此并不安全，這就要求H2濃度需控制在4%以下或75%以上的安全范圍。 不過，尚未觀測到H2吸入引起生理上的不良反應(yīng)， 吸入H2不影響血液生理參數(shù)（pH、血壓、氧分壓及體溫等）。 多種疾病模型研究表明2%～4%低濃度含H2氣體可有效改善帕金森?。?1］、呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷［12］及高氧誘發(fā)的肺損傷［13］等。Buchholz 等［14］通過麻醉液體氣化器，讓小鼠用面罩吸入含2% H2氣體，證實H2可減輕移植物誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)CC 趨化因子配體2（CC chemokine Iigand 2，CCL2）、IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的上調(diào)，顯著降低脂質(zhì)過氧化及中性粒細(xì)胞募集。 Fukuda 等［15］給麻醉的小鼠施用含H2氣體，即在再灌注前10 min 通過氣體流量計將H2氣體以流速1 L/min 供應(yīng)到含麻醉氣體 （1.5%七芳烴）一氧化二氮（N2O）/O2（70∶30）氣體中，直到再灌注結(jié)束（總共190 min），同時在實驗過程中利用氣體流量計控制流量，呼吸氣體分析儀測定H2濃度，證實H2可減少氧化應(yīng)激?？梢娢際2研究需設(shè)計相應(yīng)的組合吸入氣體的成分及吸入H2的設(shè)備，并合理選擇H2濃度。

2.腹腔注射： 動物模型中采用直接腹腔注射H2的方法，相較于直接吸入操作較為簡易，且能較長時間維持呼出氣 H2高濃度。 黃國慶等［16］比較了腹腔注射 H2、氫水及靜脈注射氫水3 種方式，發(fā)現(xiàn)腹腔注射H2使呼出氣中H2達(dá)峰時間最長[分別為（17.8±6.48）、(3.25±1.80）和（7.45±1.39） min，P＜0.01]；半減期最長[分別為（141.50±85.01）、（7.40±2.09）和（1.20±0.37） min，P＜0.01]， 提示腹腔注射 H2能長時間維持H2水平。 Wang 等［17］建立兔后肢缺血再灌注模型，將 30 只家兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組（IR 組）、缺血再灌注合并 H2灌注組（IRH 組）。IRH 組腹腔注射 H2，假手術(shù)組和 IR 組腹腔注射等量的空氣。 腹腔注射H2可降低血清丙二醇水平及骨骼肌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 （induced nitric oxide synthase，iNOS）， 并增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表達(dá)水平，提示 H2對 IR 誘導(dǎo)的骨骼肌損傷具有保護(hù)作用。

二、富氫液體

1.口服富氫水： 口服富氫水可有效避免吸入法給氫的潛在不安全性，目前常用的制備方法有以下4 種。 ①電解法制氫：通過電解水，同時產(chǎn)生H2與O2，通常H2在水中的飽和濃度大約為1.6 ppm（1 ppm=1 mg/L）；②鎂濾芯制氫：在濾芯中加入金屬鎂、托瑪琳等，當(dāng)水流過濾芯時，經(jīng)置換反應(yīng)，產(chǎn)生H2，不過，隨著使用次數(shù)增加，濾芯被氧化，制氫能力下降；③氫棒制氫：基本原理同鎂濾芯制氫，使氫棒（含金屬鎂）與水在密閉容器中反應(yīng)，氫棒周圍產(chǎn)生H2，但多次使用會因鎂粒子被氧化導(dǎo)致效果下降；④高壓溶解法：使用高壓和特殊工藝將高濃度的H2溶解在水中并密封保存， 高壓下H2濃度可達(dá) 3 ppm 及以上。 Nishimaki 等［18］給癡呆小鼠飲用飽和氫氣水， 發(fā)現(xiàn)可以降低氧化應(yīng)激并改善小鼠認(rèn)知功能。Muramatsu 等［19］通過妊娠大鼠羊水中注射脂多糖建立新生大鼠支氣管肺發(fā)育不良 （bronchopulmonary dysplasia, BPD）模型， 母體大鼠飲用富氫水可使其子代體內(nèi)活性氧含量下降，BPD 明顯改善。 Matsumoto 等［20］發(fā)現(xiàn)飲用富氫水可增加帕金森小鼠模型胃促生長素分泌而改善基底節(jié)多巴胺神經(jīng)元的缺失。 另外，與其他給氫模式相比，飲用富氫水可顯著增加胃腸道系統(tǒng)局部H2濃度［21］，可能更適于用于胃腸道疾病相關(guān)研究。

富氫水制備方便且安全性高， 更便于臨床應(yīng)用及推廣。目前已有多項臨床研究證實富氫水的保護(hù)作用。 一項隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照研究結(jié)果顯示，飲用富氫水治療48 周可降低帕金森病患者統(tǒng)一帕金森病綜合量表評分， 提高患者生活質(zhì)量［22］。 另一項新近雙盲、安慰劑對照交叉研究發(fā)現(xiàn)，飲用富氫水治療28 d 可改善非酒精性肝硬化患者肝臟脂肪浸潤并降低天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平［23］。 此外，飲用富氫水還可降低輕度認(rèn)知障礙（mid cognitive impairment，MCI）患者阿爾茨海默病評估量表-認(rèn)知亞量表（Alzheimers disease asesment scale-cognitive section，ADAS-cog）評分[18]，降低高強(qiáng)度運動后血乳酸水平并改善運動相關(guān)的自覺疲勞程度量表評分（ratings of perceived exertion, RPE）［24］，改善代謝綜合征患者脂代謝紊亂［25］，并改善接受 mFOLFOX6 方案（奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶）化學(xué)治療（化療）的結(jié)直腸癌患者的肝功能［26］。

2.注射用富氫0.9%氯化鈉溶液：富氫0.9%氯化鈉溶液的制備方法與制備富氫水方法相似。 濃度一般低于口服用富氫水，為1 ppm 左右。 與口服富氫水相比，注射用富氫0.9%氯化鈉溶液更易控制H2的濃度，同樣成本低，方便、安全，并增加了H2利用度。 注射方式分為腹腔注射、靜脈注射、鞘內(nèi)注射以及玻璃體內(nèi)注射等，腹腔注射最為多用。 在多柔比星誘導(dǎo)的心肌病大鼠模型中，腹腔注射富氫鹽水可改善心功能并減輕心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤及心肌細(xì)胞局灶性肌溶解，提高大鼠生存率[27]。 Ogawa 等［28］通過夾閉沙鼠雙側(cè)椎動脈 15 min造成缺血性聽力損失模型后對其靜脈注射5 mL 富氫0.9%氯化鈉溶液，發(fā)現(xiàn)H2治療可減少沙鼠耳蝸損傷，并使其聽力部分恢復(fù)。

3.其他： 富氫0.9%氯化鈉溶液器官冷藏液可改善移植器官的冷缺血再灌注損傷； 富氫0.9%氯化鈉滴眼液開啟了H2局部用藥的先河。 此外，因為H2易穿透皮膚并通過血流分布全身，因此也可用富氫水淋浴，不過，由于H2的溶解度很低，容易彌散在空氣中，H2吸收效率很低，往往用量大而吸收量小，且難以定量研究，因此成本高，且H2濃度難以控制，實驗中與實際醫(yī)療中很少采用。 Uto 等［29］發(fā)現(xiàn)富含氫的威斯康辛大學(xué)溶液 （hydrogen-rich University of Wisconsin solution, HRUW）可降低大鼠移植肝的氧化應(yīng)激損傷及肝細(xì)胞凋亡。 HRUW 可延長移植物保存時間，改善移植物功能。Takahashi 等［30］將大鼠左肺門夾閉 1 h，再灌注 3 h 來誘導(dǎo)肺缺血再灌注損傷。在大鼠肺缺血期間，給予灌注0.9%氯化鈉溶液或富氫0.9%氯化鈉溶液至大鼠左胸腔， 通過氣相色譜儀測量左肺中氫濃度。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)富氫0.9%氯化鈉溶液組的肺功能顯著高于0.9%氯化鈉溶液組， 而促炎因子水平顯著低于0.9%氯化鈉溶液組。

三、H2微泡法

由于H2溶解度低， 無論是直接吸入還是溶于液體都難以定向釋放，在一定程度上限制了其應(yīng)用，超聲微泡載藥技術(shù)可彌補(bǔ)該缺陷。 超聲微泡載藥一般使用脂質(zhì)微泡，具有靶向性好、提高靶向藥物濃度、安全、穩(wěn)定、傳輸效應(yīng)高、及免疫反應(yīng)小的優(yōu)點，還便于超聲造影檢查［31］。H2載藥微泡的制備方法套用一般脂類載藥微泡的制備法，形成以一定比例混合的全氟丙烷 （C3F8）/H2微泡。 動物實驗證實濃度為 （1.14±0.07）×1010微泡/mL 的溶液， 微泡釋放 H2達(dá)到峰值時間為80 s，溶液中 H2含量能維持在（33.45±0.67） ppm，遠(yuǎn)高于普通富氫水［32］。 陳逸寒［33］對載氫超聲微泡對于小鼠缺血再灌注心肌的定向釋放進(jìn)行了研究。 利用薄膜震蕩法制作氟氫比(C3F8/H2)為 3∶0、1∶1 和 0∶3 的脂質(zhì)微泡，將其按一定濃度通過尾靜脈注射入SD（Sprague-Dawley）大鼠體內(nèi)，應(yīng)用超聲檢測左心室造影成像效果。 結(jié)果證實了H2微泡在心肌缺血再灌注損傷中起保護(hù)作用，同時提出超聲引導(dǎo)氣體可視化治療新思路。 因此，H2超聲微泡法具有靶向性好及濃度高等優(yōu)點，還可超聲觀察，但此方面研究還少，尚有待深入。

四、促進(jìn)內(nèi)源氫產(chǎn)生

除前述外源性給氫途徑外，刺激內(nèi)源氫的產(chǎn)生亦可達(dá)到供氫目的。 人體內(nèi)源氫來源于體內(nèi)細(xì)菌的糖酵解，主要來自腸道，給藥方便且產(chǎn)H2速度快，具體方法包括口服藥物（阿卡波糖、果糖等）及膳食促進(jìn)（姜黃、牛奶等）。 但由于腸道菌群存在個體差異性，缺乏定量實驗以及H2只能從腸道開始擴(kuò)散，選擇用此方法供氫時需考慮上述諸多變量。

Nishimura 等［34］研究顯示給大鼠口服寡聚果糖可顯著增加腹腔內(nèi)及門靜脈的H2濃度。口服寡聚果糖組腹腔組織（尤其是脂肪組織）中H2濃度是對照組的5.6～43 倍，而腹腔中H2濃度是對照組的11 倍。 給高脂飲食的大鼠連續(xù)喂養(yǎng)寡聚果糖或菊粉 （50 g/kg），28 d 可降低脂肪組織中核因子（nuclear factor，NF）-κB、IL-6 及 CCL2 基因表達(dá)水平，提示口服寡聚果糖可能通過促進(jìn)內(nèi)源氫產(chǎn)生， 并通過抗炎作用改善代謝綜合征。 口服乳果糖亦可促進(jìn)腸道內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生H2，健康人在口服6 g 乳果糖70 min 后呼出H2濃度開始逐漸上升，至 180 min 后達(dá)到（38.0±4.2） ppm，但存在一定個體差異，其中14%健康人口服乳果糖后呼出H2濃度未見明顯變化［35］。 研究者發(fā)現(xiàn)口服乳果糖可有效改善結(jié)腸炎小鼠腸道的組織結(jié)構(gòu)損傷，并降低炎癥因子水平，該保護(hù)作用可被抑制腸道菌群的抗生素所阻斷。 此外，飲用牛奶比飲用富氫水能使呼出氣H2含量達(dá)到峰值的時間延遲， 且能長時間維持高的呼出氣H2含量且受乳糖不耐受影響。 內(nèi)源氫還受生理條件的影響，有研究發(fā)現(xiàn)實驗動物脫水時呼氣H2含量上升。因此，內(nèi)源氫研究需考慮乳糖及果糖不耐受，生理狀況及腸道菌群的個體差異等［36］。

總之，各種供氫方式已得到研究，但其治療的有效性及安全性仍需大量大樣本前瞻性臨床研究來進(jìn)一步明確。 實際臨床應(yīng)用中尚存在不少問題有待解決，例如，針對不同疾病如何選擇合適的供氫方式， 不同供氫方式所需的有效H2濃度、達(dá)峰值的速度、持續(xù)時間及用量等。 此外，含氫溶液中H2濃度的定量研究較少，且由于H2溶解度小并存在揮發(fā)問題，因此如何提高并保持含氫溶液的濃度成為一大難題，采用納米技術(shù)有望解決。