法尼醇在促氟康唑耐藥白念珠菌凋亡中的作用機(jī)制

周羅成， 王 寧， 朱瑩瑩， 張姣姣， 王海嶸， 康 健

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，上海 200096）

白念珠菌 （Candida albicans） 是真菌感染（fungal infection）較為常見的病原真菌之一，其治療常用到氟康唑等三唑類藥物[1]。近年來，由于大量使用三唑類藥物，白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥性日益顯現(xiàn)。 我國(guó)研究顯示，白念珠菌血癥對(duì)氟康唑的耐藥率約為10%[2]， 上海長(zhǎng)海醫(yī)院的一項(xiàng)研究顯示，2012—2014 年分離的1 764 株白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥率為14.6%[3]。 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院2014 年檢測(cè)出白念珠菌約為12%[4]， 而其他一些地區(qū)的單中心研究耐藥情況更嚴(yán)重， 如杭州第三人民醫(yī)院為20.7%、河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院則是54.1%[5-6]。 故白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥的產(chǎn)生機(jī)制研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。

造成白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥的重要機(jī)制之一為白念珠菌體內(nèi)可產(chǎn)生外排泵蛋白，可以將真菌體內(nèi)的氟康唑泵出， 造成菌株體內(nèi)有效藥物濃度下降，從而導(dǎo)致對(duì)氟康唑耐藥[7]。與耐藥相關(guān)的外排泵蛋白主要有多藥耐藥 1 （multidrug resistance 1，MDR1） 基因轉(zhuǎn)錄的滲透性糖蛋白（permeability glycoprotein，Pgp） 及白念珠菌耐藥基因 1（Candida drug resistance 1，CDR1）、CDR2 轉(zhuǎn)錄的 Cdr1 蛋白（CDR protein 1，Cdr1）、Cdr2[8-9]。 有研究表明法尼醇是白念珠菌的群體感應(yīng)分子[10]，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制藥物外排蛋白的功能，并誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡。 另有學(xué)者構(gòu)建了Cdr1 蛋白高表達(dá)的白念株菌株， 發(fā)現(xiàn)法尼醇在白念珠菌細(xì)胞內(nèi)與谷胱甘肽結(jié)合成為法尼醇-谷胱甘肽結(jié)合物，后者被高表達(dá)的Cdr1 蛋白泵排出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽耗盡，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高，最終導(dǎo)致真菌死亡[11]。 同時(shí)張曉云等[12]的研究表明MDR1 在氟康唑耐藥白念珠菌中也存在高表達(dá)。 據(jù)此推測(cè)，法尼醇可能會(huì)通過高表達(dá)MDR1 基因轉(zhuǎn)錄的Pgp，導(dǎo)致耐藥白念珠菌細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量減少， 細(xì)胞內(nèi)活性氧類（reactive oxygen species，ROS）積聚增多，胱天蛋白酶3（caspase 3）活性增加，由此導(dǎo)致耐藥白念珠菌細(xì)胞凋亡。

材料與方法

一、材料

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控株SC5314 由中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)提供。氟康唑購(gòu)自上海信誼藥廠有限公司，胱天蛋白酶3 活性試劑盒及總谷胱甘肽試劑盒購(gòu)自南京建成有限公司（貨號(hào)：G007）；酶標(biāo)儀購(gòu)自 THERMO 公司（貨號(hào)：MK3）；還原型谷胱甘肽試劑盒(Glutathione Assay Kit)購(gòu)自 Sigma 公司（貨號(hào)：CS0260）；PCR 引物由生工生物工程 （上海）有限公司合成。

二、濃度梯度法誘導(dǎo)氟康唑耐藥株

通過濃度梯度法獲得本研究所需的氟康唑誘導(dǎo)耐藥株。 將白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株在沙氏葡萄糖瓊脂（Sabouraud dextrose agar，SDA）培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h，后取單個(gè)菌落再次接種在SDA 培養(yǎng)基48 h 以保證菌株的活力及純度。后取單個(gè)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌落轉(zhuǎn)種于未含有氟康唑藥物的SDA 培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)，從而制備成含菌培養(yǎng)液，使得菌液濃度為0.5 麥?zhǔn)蠁挝弧?離心后取菌懸液100 μL 分別涂布于含有不同倍數(shù)最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的氟康唑培養(yǎng)液中30℃培養(yǎng)，并分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)氟康唑的敏感性，最后達(dá)到氟康唑敏感株 MIC≤8 μg/mL，耐藥株 MIC≥64 μg/mL，符合美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的 M27-A3 方 案判定標(biāo)準(zhǔn)，并-80℃保種[9]。

三、四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）比色法

氟康唑耐藥組及對(duì)照組的白念珠菌均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)， 使用麥?zhǔn)媳葷岱ù_定真菌濃度為1×106～1×107菌落形成單位（colony forming unit，CFU）/mL。2 組中加入法尼醇， 并補(bǔ)充RPMI 1640 培養(yǎng)液使2 組菌液的法尼醇濃度統(tǒng)一為200 μmol/L，37℃孵育24 h。 用酶標(biāo)儀于570 nm 處以空白孔調(diào)零測(cè)各孔光密度值。

四、胱天蛋白酶3活性檢測(cè)

使用胱天蛋白酶3 活性測(cè)試盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)胱天蛋白酶3 活性。 對(duì)樣品離心， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，去上清，加裂解液冰浴裂解；后 4℃離心（12 000 轉(zhuǎn)/min，10～15 min）； 取樣加入 2×反應(yīng)液、裂解液及 5 μL Ac-DEVD-PNA，37 ℃孵育 4 h， 發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯，用酶標(biāo)儀在λ=405 nm 測(cè)定其吸光值A(chǔ)，計(jì)算誘導(dǎo)劑與陰性對(duì)照A 的比值以確定胱天蛋白酶3 的活性 （氟康唑耐藥組胱天蛋白酶活化程度值/對(duì)照組相應(yīng)值）。

五、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定

使用微量酶標(biāo)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽以及氧化型谷胱甘肽含量。 細(xì)胞樣品用PBS 洗滌1 次，1 500 轉(zhuǎn)/min 離心，去上清液。按沉淀體積的3 倍體積加5%磺基水楊酸 （sulfosalicylic acid dihydrate，SSA）溶液，震蕩懸浮，凍融 2 次，12 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，取上清液。

在樣品上清液中加入還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotine adenine dinucleotide phosphate，NADPH），前、后 5 min 各于 412 nm 處讀值，計(jì)算ΔA412。 使用谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液的值來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)ΔA412/min，根據(jù)公式：每毫升樣本中的谷胱甘肽（nmol）=ΔA412/min（樣品）×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)/ΔA412/min（標(biāo)準(zhǔn)）×樣品的體積ΔA412/min （1 nmol） 表示 1 nmol 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，從而計(jì)算出樣品中的谷胱甘肽含量。

使用總谷胱甘肽測(cè)定試劑盒（微板法）測(cè)定其含量。在樣品中加入測(cè)定盒試劑，并充分混勻，酶標(biāo)儀中 405 nm 處前、后 5 min 讀取 2 次數(shù)值 A1、A2并計(jì)算，ΔA=A2-A1，根據(jù)公式：總谷胱甘肽=ΔA（測(cè)定值）/ΔA（標(biāo)準(zhǔn)值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

氧化型谷胱甘肽=總谷胱甘肽含量-谷胱甘肽含量。

六、細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試驗(yàn)測(cè)定各組白念珠菌胞內(nèi)ROS 活性，對(duì)結(jié)果取相對(duì)值（耐藥組/對(duì)照組）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 取ROS 活性檢測(cè)試劑二氯氫化熒光素二乙酸酯（dichlorofuorescin diacetate，DCFHDA）加入培養(yǎng)基，濃度為 10 μmol/L。 37℃孵育待檢測(cè)細(xì)胞60 min，并將收集好的細(xì)胞用PBS 重懸。 將DCFH-DA、待檢測(cè)細(xì)胞混合，酶標(biāo)儀測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SAS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，取均值。 計(jì)量資料以表示，采用 t 檢驗(yàn)。 P＜0.05 表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、2組加入法尼醇后菌株增殖情況比較

MTT 法檢測(cè)顯示2 組菌株的增殖情況， 與0 h對(duì)比， 培養(yǎng)24 h 后對(duì)照組的細(xì)胞增殖率為0.86±0.05，而耐藥組為0.64±0.05。 法尼醇對(duì)耐藥組菌株的增殖抑制較對(duì)照組顯著（t=5.41，P=0.005 7）。

二、白念珠菌活化胱天蛋白酶-3的檢測(cè)

白念珠菌細(xì)胞內(nèi)胱天蛋白酶-3 活化程度相對(duì)值對(duì)照組為1.00±0.00，氟康唑耐藥組為1.84±0.70，氟康唑耐藥組胞內(nèi)胱天蛋白酶-3 活化程度明顯高于對(duì)照組（t=5.16，P=0.035 5）。

三、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定

白念珠菌胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的相對(duì)含量對(duì)照組為 1.00±0.00，氟康唑耐藥組為 0.63±0.17，2 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.27，P=0.011 4）。 白念珠菌胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽相對(duì)含量對(duì)照組為1.00±0.00，而氟康唑耐藥組為 0.32±0.10，2 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.13，P=0.001 3）。

四、ROS活性的測(cè)定

對(duì)照組中白念珠菌胞內(nèi)ROS 活性相對(duì)值為1.00±0.00，氟康唑耐藥組為 1.45±0.30，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.48，P=0.023 0）。

討 論

有文獻(xiàn)報(bào)道法尼醇可造成白念珠菌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制之一為法尼醇可以在白念珠菌細(xì)胞內(nèi)與谷胱甘肽相結(jié)合，兩者形成的結(jié)合態(tài)被白念珠菌耐藥蛋白Cdr1 泵出菌株細(xì)胞外， 從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽減少， 細(xì)胞的抗氧化還原能力減弱，細(xì)胞死亡[12-13]。但其所用菌株為SC5314 標(biāo)準(zhǔn)菌株及CDR1 基因敲除或 CDR1 基因高表達(dá)的 CAI4、DSY449 菌株，且此類菌株均對(duì)氟康唑敏感，故不能由此推測(cè)法尼醇對(duì)氟康唑耐藥的白念珠菌具有同樣的殺滅作用。

通過濃度梯度法，本研究成功獲得了氟康唑耐藥的白念珠菌菌株，并在加入法尼醇24 h 后，進(jìn)行菌株增殖情況的比較，顯示耐藥菌的增殖被顯著抑制，表明法尼醇對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌的增殖具有抑制作用。

胱天蛋白酶家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起非常重要的作用，其中胱天蛋白酶3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子。激活后的胱天蛋白酶3 通過裂解切割多種胞漿、胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。 本研究選擇測(cè)定2 組菌株胞內(nèi)的胱天蛋白酶3 活性水平來觀察細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加入法尼醇后，氟康唑耐藥組的胱天蛋白酶3 活性水平為對(duì)照組的（1.84±0.70）倍，提示法尼醇能夠促進(jìn)耐藥白念珠菌細(xì)胞凋亡。

根據(jù)之前文獻(xiàn)推測(cè)法尼醇誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)的作用機(jī)制很可能是：法尼醇和還原型谷胱甘肽形成結(jié)合物后，由耐藥真菌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的Pgp 將該復(fù)合物排出， 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽濃度降低，ROS 活性增強(qiáng)，過高的ROS 水平會(huì)使得耐藥真菌通過細(xì)胞凋亡途徑死亡[15]。 本研究發(fā)現(xiàn)耐藥組中的還原型谷胱甘肽含量下降，ROS 活性水平上升。上述結(jié)果提示法尼醇可使耐藥真菌體內(nèi)谷胱甘肽減少，導(dǎo)致其體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，抗氧化能力下降，耐藥真菌細(xì)胞內(nèi)ROS 增高，之后通過激活胱天蛋白酶族，促進(jìn)白念珠菌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致耐藥白念珠菌增殖顯著受抑。

本研究初步發(fā)現(xiàn)法尼醇對(duì)于氟康唑耐藥的白念珠菌有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制耐藥真菌增殖的作用，其可能的機(jī)制為法尼醇導(dǎo)致耐藥白念珠菌細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量下降，ROS 水平上升， 胱天蛋白酶3 酶活性增加，最終導(dǎo)致耐藥白念珠菌細(xì)胞凋亡。 鑒于白念珠菌耐藥的復(fù)雜性，本研究結(jié)果或?qū)槟退幇啄钪榫难芯糠较蛱峁┬碌倪x擇。