組織工程皮膚修復(fù)裸鼠創(chuàng)面缺損的實(shí)驗(yàn)研究

江蕾微，董 仙，葉 藤，劉 志，李遠(yuǎn)英，陸洪光

（貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550001）

皮膚是人體最大的器官之一，其在人體表面覆蓋并占體質(zhì)量總數(shù)約8%。皮膚組成包括真皮、表皮、皮膚附屬器官、皮下組織等，在正常情況下可為人體提供吸收、防護(hù)、調(diào)節(jié)體溫、分泌、感覺、代謝、排泄等功能。由上述可知，一旦皮膚受到損傷將導(dǎo)致患者相應(yīng)功能變化，此外外表美觀也將受到影響，并進(jìn)一步干擾患者身心健康。因此提示，如何針對(duì)缺損皮膚進(jìn)行積極修復(fù)是現(xiàn)階段臨床研究重點(diǎn)及熱點(diǎn)問題，也是確?；颊忒熜Ъ邦A(yù)后的關(guān)鍵。所謂組織工程皮膚，簡(jiǎn)單的說就是可以作為人工皮膚的成品，用于患者修復(fù)。植皮。組織從建等，以此修復(fù)患者存在損壞的皮膚組織。本次研究實(shí)驗(yàn)是將hAECs-DED的組織工程皮膚用于裸鼠創(chuàng)面移植，并觀察裸鼠的創(chuàng)面愈合效果及組織工程皮膚病理學(xué)等方面，以此來了解改組織的移植效果，為醫(yī)學(xué)發(fā)展提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（低糖型）（Gibco,USA），胎牛血清（Hyclone,USA），胰蛋白酶（Sigma公司,USA）,青霉素（哈藥總廠）,鏈霉素（華北制藥），10%福爾馬林固定液，0.9%氯化鈉注射液，超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司），手術(shù)器械一套,無菌紗布，棉球，無菌油紗等，倒置生物顯微鏡（OLYMPUS，CK40-F200）,倒置顯微鏡（尼康，TE2000-U＋DXM1200）,熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus 公司），光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus公司），RM2245型石蠟切片機(jī)（Leica公司，德國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本次觀察試驗(yàn)指標(biāo)為25克以內(nèi)無影響試驗(yàn)癥狀的裸鼠為試驗(yàn)對(duì)象。且試驗(yàn)對(duì)象為實(shí)驗(yàn)中心獲得，體征無任何試驗(yàn)影響因素。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

將鼠齡≤四周的確保健康的雄性裸鼠作為試驗(yàn)標(biāo)本，且將所偶有裸鼠進(jìn)行分組，即為組織工程組和空白對(duì)照組，每組均為十只裸鼠。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)操作

（1）動(dòng)物麻醉：以5%水合氯醛0.01ml/g進(jìn)行腹腔注射，3-5分鐘后裸鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)。

（2）操作步驟：

首先將皮膚缺損進(jìn)行模型建立且同步植皮；將試驗(yàn)落實(shí)麻醉后進(jìn)行固定，然后進(jìn)行試驗(yàn)常規(guī)操作，如麻醉，將試驗(yàn)裸鼠的背部皮膚進(jìn)行消毒，鋪巾后將試驗(yàn)裸鼠背部中間點(diǎn)為中心，且以1 cm為直徑后采取眼科剪刀將裸鼠皮膚去除，要注意的是刮掉筋膜時(shí)動(dòng)作要輕。在用雙抗清洗切除創(chuàng)口。最后采用組織工程皮膚，覆蓋創(chuàng)口，另一組則只進(jìn)行游紗布進(jìn)行創(chuàng)口打覆蓋縫合，且打包需要稍加壓進(jìn)行包扎，試驗(yàn)裸鼠必須單獨(dú)飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)，經(jīng)手術(shù)7天后將創(chuàng)面紗布包及油紗去除，行常規(guī)換藥，上述方法無以后后經(jīng)28天觀察期并進(jìn)行組織學(xué)檢查。

術(shù)后HE染色：于術(shù)后四周取材，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，包埋，4 mm連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次試驗(yàn)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后動(dòng)物傷口及存活情況

所有的裸鼠在術(shù)后能夠均無感染，化膿、體液滲出等不良反應(yīng)。攝食、飲水、排便正常，均成活至完成實(shí)驗(yàn)。

2.2 動(dòng)物創(chuàng)面愈合情況

經(jīng)移植后7天，可見試驗(yàn)中構(gòu)建組織工程皮膚與裸鼠皮膚的愈合效果較為明顯。且存在在創(chuàng)面收縮現(xiàn)象，組織工程組創(chuàng)面愈合率為57.49%±6.11%，對(duì)照組為22.93%±4.26%（n=10）。14天后，組織工程組中的裸鼠創(chuàng)面已經(jīng)明顯愈合且較優(yōu)于對(duì)照組，移植物顏色與同皮膚相近。組織工程組創(chuàng)面愈合率為92.80%±3.10%，對(duì)照組為54.57%±7.94%。經(jīng)組織皮膚一直21天后，觀察可見組織創(chuàng)口以基本成愈合現(xiàn)象，而對(duì)未移植組織皮膚的裸鼠存在未愈合情況，組織工程組創(chuàng)面愈合率為99.83%±5.25%，對(duì)照組為91.16%±4.79%。移植4周后，兩組肉眼觀均達(dá)到完全愈合。組織工程組創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯短于對(duì)照組，且兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖1，分別為組織工程皮膚組、對(duì)照組皮膚移植當(dāng)天，第14天，第21天創(chuàng)面愈合情況。

3 討 論

皮膚通過不斷對(duì)外界物質(zhì)信號(hào)準(zhǔn)確吸收并反饋至機(jī)體各組織器官中，從而使人體盡快適應(yīng)外界環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化。但應(yīng)注意的是，由于皮膚屬于人體與外界環(huán)境直接接觸的主要器官之一，因此在日常生活中難免由于撕裂傷、燒傷等因素導(dǎo)致皮膚缺損，皮損發(fā)生后若未及時(shí)修復(fù)可能增加創(chuàng)面電解質(zhì)、水、蛋白質(zhì)等成分丟失幾率，感染風(fēng)險(xiǎn)隨之提高，同時(shí)不利于保持患者外表美觀，應(yīng)引起相關(guān)醫(yī)務(wù)人員注意。

雖然自體斷層/全層皮片移植是現(xiàn)階段臨床用于修復(fù)皮膚創(chuàng)面缺損的主要材料來源，但針對(duì)大面積皮膚創(chuàng)面缺損患者而言供區(qū)不足仍是阻礙其獲得滿意缺損效果的主要因素之一。因此，如何明確皮膚替代拼已成為現(xiàn)階段臨床皮膚組織工程技術(shù)研究中亟待解決的重點(diǎn)問題。

皮膚組織工程技術(shù)是組織工程分支之一，屬于一門新興邊緣學(xué)科。皮膚組織工程技術(shù)主要研究方向包括修復(fù)受損皮膚結(jié)構(gòu)及功能、修復(fù)促進(jìn)多能干細(xì)胞及生物活性分子修復(fù)受損皮膚等。近年來隨著臨床中皮膚生物學(xué)、生物工程技術(shù)、生物材料科學(xué)等研究進(jìn)程迅猛發(fā)展，皮膚組織工程技術(shù)也也已取得一定進(jìn)步。

本實(shí)驗(yàn)將新鮮的組織工程全層皮膚hAECs-DED移植于裸鼠，經(jīng)觀察兩周后，所以只的人工皮膚基本與周圍裸鼠組織皮膚融合生長(zhǎng)，三個(gè)星期后明顯與周圍鼠皮并無差異。組織學(xué)顯示移植的組織工程皮膚與正常皮膚結(jié)構(gòu)相似，包括表皮和真皮。這些結(jié)果表明，本次試驗(yàn)的組織工程皮膚很穩(wěn)定，修復(fù)試驗(yàn)裸鼠皮膚缺損治療非常滿意，且存在很好的臨床應(yīng)用背景。

綜上，應(yīng)用組織工程皮膚對(duì)裸鼠創(chuàng)面缺損修復(fù)效果顯著，有利于提高皮膚創(chuàng)面缺損修復(fù)效果，值得今后實(shí)際工作中參考使用。