鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白研究新進(jìn)展

柴 媛，王俊瑞，朝魯門(mén)其其格

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒童重癥監(jiān)護(hù)病房）

鮑曼不動(dòng)桿菌是一種非發(fā)酵糖的革蘭陰性桿菌，生存性和侵襲性極強(qiáng)，在醫(yī)院環(huán)境中廣泛分布，是引起免疫缺陷和ICU 病人感染的主要病原體，可導(dǎo)致醫(yī)院獲得性肺炎及血液、腹腔、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和皮膚組織的感染。導(dǎo)管相關(guān)性的敗血癥是鮑曼不動(dòng)桿菌感染的主要表現(xiàn)和最嚴(yán)重的形式，在醫(yī)院的感染和總死亡率可高達(dá)70%[1]。目前其耐藥性已被全球所關(guān)注，致病性成為研究的新領(lǐng)域，對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌的研究熱點(diǎn)集中于外膜蛋白。鮑曼不動(dòng)桿菌相關(guān)的外膜蛋白，包括外膜蛋白A、外膜蛋白W、外膜蛋白33-36、外膜蛋白22、外膜蛋白Caro、OprD 蛋白及外膜蛋白AIS-1969 等，因此，以下綜述總結(jié)了鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白的最新研究。

1 外膜蛋白A（OmpA）

OmpA 是一種非特異、低滲透性的慢孔蛋白，在外膜蛋白中含量相對(duì)較高，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的通透性。OmpA 的結(jié)構(gòu)域是β桶狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，是一種面向胞質(zhì)的球狀蛋白，具有穩(wěn)定性和細(xì)胞完整性[2]。OmpA 的功能體現(xiàn)在鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性、致病性及免疫調(diào)節(jié)方面。

1.1 與耐藥的相關(guān)性

鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA 的耐藥機(jī)制主要與其本身孔蛋白缺失、射流泵的形成及基因突變有關(guān)。最近的一項(xiàng)研究，Hyo Il Kwon 通過(guò)敲除OmpA 基因，使ATCC17978 和MDR1656-2 兩目標(biāo)菌株的外膜丟失OmpA，最終使對(duì)抗目標(biāo)菌株的抗菌劑的最低抑菌濃度（MIC）降低，其機(jī)制為親脂性抗菌劑（青霉素G、頭孢噻吩、新生霉素）在已修飾的外膜擴(kuò)散增加，親水性抗菌劑（頭孢他啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南和萘啶酸）則通過(guò)OmpA 通道穿過(guò)外膜，這都導(dǎo)致對(duì)抗菌素的敏感性增加[2]，這表明了OmpA 參與鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥。Smani 的研究證實(shí)，OmpA 參與化合物從細(xì)胞外穿過(guò)外膜，并與內(nèi)膜射流泵外排系統(tǒng)耦合形成功能性外排系統(tǒng)，這些外排泵（RND家族、MFS 家族）使抗生素（氨曲南、萘啶酸）的敏感性降低[3]。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥體現(xiàn)在parC、gyrA 基因的雙重突變使拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和Ⅳ的結(jié)構(gòu)被改變，導(dǎo)致OmpA 結(jié)合位點(diǎn)的改變[4]，最終產(chǎn)生耐藥。

1.2 致病性

鮑曼不動(dòng)桿菌的致病機(jī)制主要是生物膜的形成，主要涉及生物膜相關(guān)蛋白。OmpA 是一種生物膜內(nèi)在蛋白，通過(guò)參與生物膜的形成產(chǎn)生致病。包括粘附宿主細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和血清抵抗。2019 年Rmaghan Soltani Shirazi 等人通過(guò)鮑曼不動(dòng)桿菌感染小鼠建立小鼠感染模型外周血IL-6 的表達(dá)水平PCR 結(jié)果分析得出，IL-6 過(guò)量表達(dá)的同時(shí)OmpA 也表現(xiàn)為高表達(dá)，這說(shuō)明OmpA 高表達(dá)在鮑曼不動(dòng)桿菌致宿主感染過(guò)程中起重要作用[5]。

1.2.1 粘附宿主細(xì)胞 呼吸道上皮細(xì)胞比非呼吸道上皮細(xì)胞更易受到鮑曼不動(dòng)桿菌侵襲，與其本身致病力較弱及宿主定植有關(guān)。鮑曼不動(dòng)桿菌是通過(guò)菌毛結(jié)構(gòu)粘附于支氣管上皮細(xì)胞，之后上皮細(xì)胞膜延伸到細(xì)菌周圍，通過(guò)肌動(dòng)蛋白重排和膜重組介導(dǎo)，以拉鏈樣機(jī)制使細(xì)胞產(chǎn)生凸起，將細(xì)菌埋入上皮細(xì)胞。通過(guò)比較鮑曼不動(dòng)桿菌野生株與OmpA 敲除株的侵襲力得出，鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA敲除株的侵襲力顯著降低到95%，該研究證實(shí)，OmpA 可直接導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附和侵襲。

1.2.2 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 此前已有研究表明，純化的OmpA（3μg/mL、6μg/mL）可進(jìn)入Hep-2 細(xì)胞，于線粒體中釋放細(xì)胞促凋亡因子細(xì)胞色素C 和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF），誘導(dǎo)細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，觸發(fā)宿主細(xì)胞DNA 降解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。純化的鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606T 中OmpA 含有一段核定位序列，使其具有多種亞細(xì)胞靶向性，不僅可以誘導(dǎo)線粒體凋亡，還可直接入侵宿主細(xì)胞核并與核氨基酸（NLS）結(jié)合，激活caspases 和凋亡誘導(dǎo)因子促進(jìn)細(xì)胞核易位，誘導(dǎo)真核細(xì)胞凋亡[6]。3.2μg/mL OmpA 作用于樹(shù)突細(xì)胞（DC），靶向作用于線粒體，產(chǎn)生活性氧（ROS）直接導(dǎo)致暴露于OmpA 處理的DC 的凋亡或壞死，由此提出OmpA 可誘導(dǎo)DC 早發(fā)型凋亡和遲發(fā)型壞死。

1.2.3 調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬 自噬是細(xì)胞的保護(hù)反應(yīng)，通過(guò)清除受損細(xì)胞器和錯(cuò)誤表達(dá)的蛋白質(zhì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。自噬調(diào)控炎癥因子釋放，產(chǎn)生機(jī)體防御，避免過(guò)度炎癥反應(yīng)。2017 年研究示，鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA 可通過(guò)MAPK/JNK 信號(hào)通路誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞發(fā)生不完全自噬[7]，OmpA 持續(xù)作用于宿主細(xì)胞，抑制自噬體降解，炎癥因子過(guò)度產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體致病。 2018 年該學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)OmpA 可增高RAW264.7 細(xì)胞LC3B- II 的表達(dá)水平，通過(guò)Akt/mTOR/p70S6K 信號(hào)通路觸發(fā)RAW264.7 細(xì)胞自噬，通過(guò)降低細(xì)胞磷酸化水平，抑制炎癥因子釋放，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生防御保護(hù)[8]，此研究的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了OmpA 可以抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，為未來(lái)抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染提供理論依據(jù)。

1.2.4 血清抵抗 特異性抗體在細(xì)菌表面的暴露促進(jìn)了巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的攝取，巨噬細(xì)胞在初始感染部位的聚集是抵抗細(xì)菌感染的重要免疫防御。研究指出，將暴露于亞胺培南的多重耐藥（MDR）鮑曼不動(dòng)桿菌滅活的細(xì)胞疫苗注入小鼠體內(nèi)，使小鼠產(chǎn)生免疫抗體，機(jī)體互補(bǔ)介導(dǎo)細(xì)菌溶解和吞噬，增加小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)MDR 鮑曼不動(dòng)桿菌的有效攝取和殺傷[9]。鮑曼不動(dòng)桿菌感染宿主細(xì)胞時(shí)激活體液免疫，OmpA 與補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白H 因子結(jié)合阻斷補(bǔ)體旁路途徑，使細(xì)菌在血清中完全繁殖。因此，激活補(bǔ)體途徑是血清中重要的免疫防御機(jī)制，補(bǔ)體的激活可能在降低鮑曼不動(dòng)桿菌逃避免疫清除方面發(fā)揮重要作用。

1.3 免疫調(diào)節(jié)

鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA 不僅誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也參與破壞T 細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，誘導(dǎo)產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)。該研究發(fā)現(xiàn)，200ng/mL 濃度的OmpA 會(huì)通過(guò)TLR2、MAPK 和NF-ΚB 旁路激活樹(shù)突狀細(xì)胞，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)分子CD86、CD80、CD40、MHCⅠ類和Ⅱ類的表達(dá)，促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞分化，增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)。OmpA 不是唯一的血清抗性分子，但當(dāng)宿主一旦被感染，OmpA 仍被認(rèn)為是體液免疫發(fā)生應(yīng)答的主要靶標(biāo)。

OmpA 是鮑曼不動(dòng)桿菌中的潛在抗原靶標(biāo)，活化的OmpA 在免疫中起決定性作用。研究表明，在小鼠鼻內(nèi)接種鮑曼不動(dòng)桿菌重組OmpA 可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜和全身抗體，再將此小鼠經(jīng)MSD 腹腔感染，發(fā)現(xiàn)免疫后的小鼠存活率明顯高于對(duì)照組[10]，因此，接種重組OmpA 可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的OmpA 抗體，其水平的高低與小鼠的生存顯著相關(guān)?；诿庖叩鞍捉M學(xué)和反向疫苗學(xué)的報(bào)告示，人血清抗OmpA 免疫球蛋白G（IgG）抗體水平的表征表明，OmpA 在健康個(gè)體和鮑曼不動(dòng)桿菌感染病人中均具有免疫原性，因此，OmpA 也是一種潛在的預(yù)防鮑曼不動(dòng)桿菌感染疫苗的候選抗原。

2 外膜蛋白W（OmpW）

外膜蛋白W（OmpW）是一種疏水性孔蛋白，由183 個(gè)氨基酸組成，不僅嵌于外膜，也存在于周質(zhì)和內(nèi)膜。目前的研究涉及細(xì)菌的多種功能，其體現(xiàn)在離子滲透、耐藥性、致病性及免疫性。

2.1 離子滲透

OmpW 可形成小分子疏水通道，允許離子滲透。將鮑曼不動(dòng)桿菌OmpW 突變株與野生株分別置于100um 55Fe 中，在作用的1 h、3 h、6 h，OmpW突變株與野生株中細(xì)菌鐵含量均增加，并且OmpW突變株中鐵含量顯著低于野生株。證實(shí)了OmpW參與鐵離子攝取和吸收，同時(shí)影響鐵在宿主體內(nèi)的平衡[23]。

2.2 耐藥性

Huang 的研究證實(shí)，OmpW 可引起鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素和亞胺培南產(chǎn)生耐藥，OmpW 的表達(dá)水平在耐碳青霉烯類菌株中顯著高于標(biāo)準(zhǔn)株，但在耐多粘菌素的菌株中卻為低表達(dá)[11，12]。OmpW 也可將替加環(huán)素轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜蛋白，但當(dāng)OmpW 缺失時(shí)，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素和亞胺培南的敏感性不會(huì)改變，表明OmpW 參與替加環(huán)素和亞胺培南的耐藥，但不是主要的機(jī)制。OmpW 是一個(gè)可以容納粘菌素分子的通道，僅有助于粘菌素與外膜蛋白結(jié)合。粘菌素的最低抑菌濃度（MIC）在OmpW 突變株與野生株中的值均為0.25 mg/L，該結(jié)果提示OmpW不參與粘菌素耐藥過(guò)程。

2.3 致病性

目前發(fā)現(xiàn)OmpW 作用于Hep-2 細(xì)胞，通過(guò)特定途徑活化使促凋亡因子上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，故OmpW 可能通過(guò)某種途徑參與致病，但具體機(jī)制尚不明確，因此，有必要進(jìn)一步闡明OmpW 在導(dǎo)致人體感染鮑曼不動(dòng)桿菌的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮作用。

2.4 免疫原性

研究表明，OmpW 的保守性＞91%，與大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的同源性較強(qiáng)，是高度免疫原性蛋白，OmpW 誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgG 進(jìn)行有效免疫應(yīng)答，該免疫可降低細(xì)菌載量和血清促炎細(xì)胞因子的水平[12]，這表明可將OmpW 作為抗原候選物研制疫苗來(lái)預(yù)防鮑曼不動(dòng)桿菌感染。

3 外膜蛋白33-36（Omp33-36）

Omp33-36 是β桶狀孔蛋白，分子量為33-36 kDa，與OmpA 類似同樣是一種水通道蛋白[13]，參與鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥、致病、細(xì)胞凋亡及自噬調(diào)節(jié)。選取對(duì)碳青霉烯耐藥的JC10/01 菌株，通過(guò)大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化證實(shí)Omp33-36 的表達(dá)顯著降低了亞胺培南和美羅培南的MIC。Omp33-36 確實(shí)參與了鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類（亞胺培南和美羅培南）的耐藥。Smani 等人通過(guò)敲除Omp33-36 的基因發(fā)現(xiàn)，基因缺失的菌株對(duì)人肺上皮細(xì)胞的粘附性和細(xì)胞內(nèi)侵襲性減低，更容易在體內(nèi)被免疫系統(tǒng)清除，導(dǎo)致菌株的細(xì)胞毒性明顯降低；Carlos Rumbo 等將8μg/mL 的Omp33- 36 作 用 于Hep- 2 細(xì) 胞，Omp33-36 可活化Bcl-2 家族促凋亡蛋白，引起線粒體損傷，細(xì)胞色素C 釋放到胞質(zhì)，激活凋亡小體，觸發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最近，An Z 研究指出鮑曼不動(dòng)桿菌Omp34在RAW264.7細(xì)胞中通過(guò)線粒體衍生的ROS 激活NLRP3 炎性體相關(guān)蛋白表達(dá)，激活釋放IL-1β，因此為防止由鮑曼不動(dòng)桿菌誘導(dǎo)的NLRP3 炎性體過(guò)度激活而引起的嚴(yán)重感染可通過(guò)下調(diào)ROS 來(lái)實(shí)現(xiàn)[14]。還證實(shí)Omp34可以增加促凋亡蛋白Bax、Bad 表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL 表達(dá)，通過(guò)線粒體途徑引起HeLa細(xì)胞凋亡[15]。Smani 等人也通過(guò)標(biāo)記自噬標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞在電鏡下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增長(zhǎng)、細(xì)胞膜生長(zhǎng)形成自噬體，證實(shí)了Omp33-36 可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。如果沒(méi)有細(xì)胞凋亡就不會(huì)發(fā)生細(xì)胞自噬，故可將Omp33-36 作為抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染治療的靶點(diǎn)。通過(guò)鑒定1500 株鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，Omp34 的保守性可達(dá)98%，也已發(fā)現(xiàn)抗原區(qū)域用于疫苗開(kāi)發(fā)[16，17]，故Omp34也可用于免疫。

4 外膜蛋白22（Omp22）

Omp22 分子量22.35kDa，長(zhǎng)度為217 個(gè)氨基酸，已報(bào)道的851 株鮑曼不動(dòng)桿菌中保守性達(dá)95%以上?？纱碳に拗骷?xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Omp22 的主動(dòng)、被動(dòng)免疫均可以提高小鼠存活率，重組Omp22在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生更高滴度的IgG 抗體，使小鼠臟器細(xì)菌量降低105～106 倍，抑制外周血和臟器細(xì)菌增殖，同時(shí)降低血清促炎因子、趨化因子水平。將不同劑量的Omp22 作用于小鼠，小鼠主要器官的組織學(xué)無(wú)任何病理變化，這一結(jié)果證實(shí)Omp22不會(huì)引起致病[18，19]。研究發(fā)現(xiàn)OmpK/Omp22 融合抗原比單獨(dú)分別使用這兩種抗原對(duì)機(jī)體具有更大的保護(hù)作用[20]。將與MF59 協(xié)同的OmpK/Omp22 融合蛋白30μg注入小鼠氣道，小鼠血液和肺組織的細(xì)菌負(fù)荷及血液炎性細(xì)胞因子水平顯著降低，小鼠的存活率更高，這表明與MF59 協(xié)同的OmpK/Omp22 融合蛋白更好地發(fā)揮了免疫應(yīng)答和保護(hù)作用[21]，證明了Omp22 具有安全性和保守性，可作為候選抗原開(kāi)發(fā)抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染疫苗。

5 Caro蛋白

一種外膜蛋白，分子量29kDa，呈β桶狀拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，與鳥(niǎo)氨酸和碳青霉烯類抗生素的攝取相關(guān)。一項(xiàng)研究通過(guò)比較亞胺培南耐藥株與敏感株外膜蛋白間的差異，發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥株中缺失Caro 蛋白[22]，Caro 蛋白表達(dá)降低導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥。既往研究證實(shí)，Caro 蛋白為熱修飾蛋白，溫度變化可影響其分子質(zhì)量，經(jīng)過(guò)95℃預(yù)處理的Caro 蛋白的分子質(zhì)量為29000，而不經(jīng)預(yù)處理的分子質(zhì)量?jī)H為24000。此外，在蛋白質(zhì)離子通道上未發(fā)現(xiàn)亞胺培南的特異結(jié)合位點(diǎn)，因此可將CarO 蛋白視為非特異性離子通道。

6 OprD蛋白

OprD 蛋白是可滲透的孔蛋白，分子量43kDa。OprD 蛋白的下調(diào)或缺失會(huì)使使細(xì)菌細(xì)胞滲透性下降，導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類產(chǎn)生耐藥。2017 年關(guān)于巴西鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白的研究報(bào)道指出，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性與OprD 蛋白缺失有關(guān)[23]。關(guān)于革蘭陰性細(xì)菌的報(bào)道中提出，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥確實(shí)與OprD 蛋白的缺失有關(guān)。

7 外膜蛋白AIS-1969（Omp AIS-1969）

OmpAIS-1969 同樣是鮑曼不動(dòng)桿菌的一種外膜蛋白，OmpAIS-1969 全長(zhǎng)855 個(gè)氨基酸，含有43個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)OmpAIS-1969 重組蛋白作用于小鼠使其產(chǎn)生特異性的IgG，降低了小鼠外周血中的細(xì)菌含量和炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)，病理性損傷被抑制，小鼠的死亡率下降。因此，OmpAIS-1969 有較好的免疫保護(hù)作用，可以作為鮑曼不動(dòng)桿菌重組亞單位疫苗的重要候選抗原之一，有效的拮抗鮑曼不動(dòng)桿菌的感染[24]。

8 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，本文詳述了鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性、對(duì)各類抗生素耐藥、致病及免疫性。由于作用機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致臨床鮑曼不動(dòng)桿菌在傳播的高感染率和難治愈率。近年，鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床檢出率增高，特別是多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率明顯增加。因此鮑曼不動(dòng)桿菌在國(guó)內(nèi)外成為研究熱點(diǎn)，尤其是外膜蛋白?，F(xiàn)已闡明通過(guò)一種或幾種機(jī)制聯(lián)合作用導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的原因，且鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制和致病機(jī)制密切相關(guān)。隨著研究思路的創(chuàng)新和技術(shù)的成熟，會(huì)有更多的外膜蛋白被發(fā)現(xiàn)，并且膜蛋白介導(dǎo)的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥及致病機(jī)制會(huì)更清晰。最新發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白可作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此，對(duì)于疫苗研究及免疫性診斷提供理論基礎(chǔ)。

目前，對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白的致病機(jī)制研究相對(duì)較少，故仍需通過(guò)先進(jìn)技術(shù)與方法進(jìn)一步了解鮑曼不動(dòng)桿菌膜蛋白的致病機(jī)制等因素，為鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床靶向治療和抗感染藥物研究奠定基礎(chǔ)，并提供更多理論依據(jù)。