多灶肝細(xì)胞癌異質(zhì)性的多組學(xué)研究與臨床意義

匡 銘, 許麗霞, 劉 信, 章 穎, 沈順利

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.肝外科； b.腫瘤科； c.放射治療科， 廣州 510080

肝細(xì)胞癌(HCC)是一種原發(fā)于肝臟的惡性腫瘤，高居全球癌癥死亡率的第四位[1]。我國每年新診斷的HCC患者約46.61萬例，每年大概有42.21萬例患者死于HCC，發(fā)病及死亡人數(shù)均接近世界的一半[2]。HCC的惡性程度高，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差。據(jù)報道[3-5]，有50%～75%的HCC在診斷時已是多個病灶，治療方式十分有限且效果不佳。

對于多灶HCC，剩余肝臟儲備功能的不足極大增加了手術(shù)切除的難度，即使可以順利手術(shù)，患者術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%～80%，極高的復(fù)發(fā)率導(dǎo)致患者預(yù)后不良[6]，預(yù)防復(fù)發(fā)是實現(xiàn)HCC患者長期生存的關(guān)鍵[7]。然而，在STORM研究[8]中，索拉非尼作為一線靶向藥物，并沒有降低根治性治療后HCC患者的復(fù)發(fā)率。HCC高度的異質(zhì)性被認(rèn)為是治療失敗的主要原因[4,9]。此外，對于失去根治性治療機(jī)會的晚期HCC患者，靶向治療作為一線治療方案，其中位無進(jìn)展生存時間僅為3.6～7.3個月[10-11]，不良反應(yīng)的發(fā)生率超過80%。越來越多的臨床研究結(jié)果顯示免疫治療是晚期HCC很有前景的治療手段。免疫檢查點抑制劑，如細(xì)胞程序性死亡蛋白-1(programed cell death protein-1，PD-1)抗體治療晚期HCC患者的一線治療總體生存時間為28.6個月，二線治療總體生存時間為12.9～15個月[12-14]。然而，PD-1抗體治療HCC的總體響應(yīng)率低于20%[13-14]。藥物靶點和免疫微環(huán)境的異質(zhì)性被認(rèn)為是臨床上靶向和免疫治療療效不一的主要原因[15]。

相比于單個病灶，多灶HCC的腫瘤異質(zhì)性更為復(fù)雜[16-18]。HCC的多個病灶可能來源于多個中心或者是同一個原發(fā)灶的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移[19]。近來多個研究從基因突變、拷貝數(shù)變異(copy number alterations，CNAs)、結(jié)構(gòu)變異(structure variations，SVs)和HBV DNA的整合位點[20-24]的角度評估了多灶HCC的腫瘤起源和基因組異質(zhì)性。此外，多灶HCC的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，尤其是免疫的異質(zhì)性與免疫治療反應(yīng)有關(guān)[23-25]。

本文基于多灶HCC的基因組和轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性研究領(lǐng)域的文獻(xiàn)報道，并結(jié)合作者的研究成果，重點介紹多灶HCC的腫瘤起源、基因組結(jié)構(gòu)、克隆進(jìn)化以及不同病灶間的RNA表達(dá)和腫瘤免疫微環(huán)境特征，并探討上述異質(zhì)性對多灶HCC精準(zhǔn)診療的影響。

1 多灶HCC的基因組特征

1.1 多灶HCC的起源種類及基因組特征 多灶HCC可分為多中心起源HCC(multicentric occurrence HCC，MO-HCC)和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移HCC(intrahepatic metastases HCC，IM-HCC)兩種類型，臨床預(yù)后差別巨大。MO-HCC的起源是一種多克隆的過程[26]，意味著各病灶從起源時就有著相互獨立的克隆來源。這種類型的多灶HCC患者進(jìn)行根治性手術(shù)治療的效果較好，且即使術(shù)后復(fù)發(fā)，仍能從二次手術(shù)或局部治療中獲得較好的治療效果。相比之下，IM-HCC則由相同克隆來源的腫瘤細(xì)胞發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，此種類型腫瘤的生物學(xué)行為更具侵襲性，患者接受手術(shù)治療后常早期即出現(xiàn)復(fù)發(fā)[27]，即使采取更為激進(jìn)的治療方式，預(yù)后仍然較差。因此，區(qū)分這兩種不同來源的HCC對優(yōu)化多灶HCC患者的預(yù)后判斷具有重要意義。

傳統(tǒng)方法如觀察腫瘤的組織病理學(xué)形態(tài)[28-29]，檢測p53等高頻突變蛋白[30]等難以區(qū)分IM-HCC和MO-HCC。越來越多的研究[21,26,31-32]利用全基因組/外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測序來識別一些生物標(biāo)志物，從而區(qū)分腫瘤的起源。采用基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，Miao等[31]探究了兩例多灶HCC患者腫瘤的克隆起源及其接受根治性手術(shù)治療后預(yù)后的差異。患者1不同病灶間的基因突變模式、CNA譜、SV特征和HBV DNA整合位點十分相似，該患者的多發(fā)病灶被認(rèn)為是IM-HCC，在根治性手術(shù)后3個月即死于復(fù)發(fā)?；颊?的各個病灶之間具有明顯的HBV DNA整合位點和基因組突變的差異，其多發(fā)病灶被認(rèn)為具有獨立的來源(MO-HCC)，且轉(zhuǎn)錄組功能分析結(jié)果顯示，該患者沒有發(fā)現(xiàn)任何一個在前一例患者中發(fā)現(xiàn)的與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的分子特征。該患者術(shù)后2年仍然處于無瘤生存狀態(tài)[31]。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，同一多灶HCC患者不同病灶間，基因突變譜、CNAs、SVs和腫瘤克隆進(jìn)化存在很明顯的異質(zhì)性。不同多灶HCC患者之間，所有病灶共有的基因突變比例差異較大。研究[4,32-33]表明，IM-HCC的共有基因突變比例在8%～97%，而MO-HCC不同病灶間幾乎沒有相同的基因突變。CNAs在多灶患者不同病灶間也存在較大的異質(zhì)性。例如，在IM-HCC中，共有CNAs的比例為22.2%～100%，MO-HCC不同癌灶間共有的CNAs最高為46.7%[26]。作者采用全外顯子組及全基因組測序技術(shù)，也證實了多灶HCC患者不同病灶間基因突變和CNAs存在較大的異質(zhì)性[23]。HBV感染者在肝癌發(fā)生前，HBV DNA與宿主基因組的隨機(jī)位點結(jié)合，使得這個位點結(jié)合信息對每一個腫瘤克隆都是特異的。因此，具有相同HBV DNA整合位點的病灶被認(rèn)為是肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶[32]。包括作者研究在內(nèi)的多項研究[24,26,34]顯示，IM-HCC中HBV DNA整合的模式相同，而在MO-HCC中HBV DNA整合的模式不同，進(jìn)一步證實了上述觀點。此外，在不同病灶中基因組SVs的數(shù)目存在差異[21]，Miao等[31]在多灶HCC的不同灶中發(fā)現(xiàn)了13～26個數(shù)目不等的SVs。作者的研究結(jié)果則顯示在同一患者中，較小病灶的SV數(shù)量與較大病灶相比，有增加的趨勢[24]。

1.2 多灶HCC的克隆進(jìn)化及其在精準(zhǔn)靶向治療中的意義 遺傳起源與克隆進(jìn)化分析進(jìn)一步證實了多灶HCC的基因異質(zhì)性。基于所有體細(xì)胞突變構(gòu)建多灶HCC患者的遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，不同患者之間存在很大差異[23,26,31]。進(jìn)一步將包括可靶向用藥等主要的驅(qū)動突變映射到每個遺傳進(jìn)化樹中，只有9%～85%的驅(qū)動基因改變位于樹干[18]，這表明多灶腫瘤遵循腫瘤分支進(jìn)化的模式[26,32]。作者的研究表明，只有30%(18/60)的驅(qū)動基因改變和20%(3/15)的藥物靶點位于遺傳進(jìn)化樹的樹干，說明多灶HCC患者中不同病灶間存在著巨大異質(zhì)性。值得注意的是，僅1/6患者的進(jìn)化樹樹干中發(fā)現(xiàn)了索拉非尼靶基因的改變(如BRAF擴(kuò)增、PDGFRB擴(kuò)增和VEGFA擴(kuò)增等)，這可能是臨床中索拉非尼治療反應(yīng)率相對較低的原因[23]。筆者的研究表明，藥物靶點的異質(zhì)性有助于解釋多灶HCC患者對靶向藥物治療反應(yīng)不一的臨床現(xiàn)象。

研究驅(qū)動基因突變的克隆狀態(tài)有助于區(qū)分腫瘤克隆進(jìn)化過程中的早期事件和晚期事件，靶向主要驅(qū)動基因克隆突變(早期事件)是一種較好的治療策略[35-38]。一些驅(qū)動基因突變在多灶HCC中顯示為克隆突變，如TERT、CTNNB1、TP53和BRAF，被認(rèn)為是HCC復(fù)發(fā)的典型驅(qū)動基因[18,39-40]。通過全外顯子測序，研究人員還發(fā)現(xiàn)53.8%的致癌突變表現(xiàn)為亞克隆，位于進(jìn)化樹的分支上[20]。多灶HCC的克隆和分支進(jìn)化是HCC精準(zhǔn)靶向治療的一大障礙。對于有手術(shù)機(jī)會的多灶HCC患者，對其所有病灶進(jìn)行敏感靶點的檢測，尋找進(jìn)化樹樹干上的共有敏感靶點，進(jìn)行精準(zhǔn)靶向治療，有望預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。

2 多灶HCC的轉(zhuǎn)錄組特征

2.1 多灶HCC的RNA表達(dá)特征及通路分析 隨著RNA測序技術(shù)在多灶HCC的腫瘤組織和癌旁肝組織的應(yīng)用，多灶HCC的轉(zhuǎn)錄組特征逐漸被揭示[23,31]。通過比較腫瘤和癌旁組織的基因表達(dá)水平，可鑒定上調(diào)和下調(diào)的基因種類和變化比率，進(jìn)一步分析腫瘤的特征性基因變化譜。作者團(tuán)隊通過基因本體分析發(fā)現(xiàn)多灶HCC中主要富集免疫反應(yīng)和代謝過程相關(guān)的基因集[23]。同樣地，Miao等[31]也發(fā)現(xiàn)在多灶肝癌中免疫反應(yīng)和代謝通路得到富集，這一結(jié)論在HCC的大規(guī)模多組學(xué)整合研究[40]中也得到了驗證，表明免疫和代謝這兩個通路的調(diào)節(jié)機(jī)制對于多灶HCC發(fā)生發(fā)展具有重要作用。Zhang等[32]報道了1例有9個病灶的多灶HCC，通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)不同的病灶有著顯著不同的富集通路，但來自于相同病灶的取材點在轉(zhuǎn)錄組水平則更為相似，提示病灶間的異質(zhì)性大于病灶內(nèi)的異質(zhì)性，這可能預(yù)示著在治療反應(yīng)過程中，同一病灶的表型可能更為一致，而不同病灶則會存在差異，從而產(chǎn)生混合效應(yīng)。作者在多灶HCC的大癌灶中發(fā)現(xiàn)更多的增殖相關(guān)通路富集，例如血管新生、血管內(nèi)皮生長因子、PI3K-AKT等信號通路，而小癌灶則有更多的免疫相關(guān)通路富集，例如TNFα、IFNα、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞受體信號通路等[24]。這些結(jié)果部分解釋了臨床多灶HCC患者在接受靶向治療或者免疫治療時不同病灶療效的異質(zhì)性。

在前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，作者發(fā)現(xiàn)Edmondson-Steiner分級為2級和3級HCC患者的RNA表達(dá)譜存在明顯的區(qū)別，提示RNA表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)[23]。HBV相關(guān)HCC患者的臨床預(yù)后可以從轉(zhuǎn)錄組分析角度去判斷：細(xì)胞骨架的重構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的組裝與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，臨床預(yù)后不佳可能與細(xì)胞增殖、核酸代謝、蛋白翻譯以及大分子組裝相關(guān)，提示RNA表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)[31]。此外，多組學(xué)分析可以預(yù)測多灶HCC的腫瘤增殖和侵襲能力，為術(shù)后的輔助治療提供指導(dǎo)[19]。因此，多灶HCC的RNA表達(dá)分析具有臨床預(yù)后的預(yù)測潛力，在臨床實踐中的應(yīng)用前景十分廣泛。

RNA表達(dá)受到許多因素的影響，包括基因組和表觀遺傳的調(diào)控。RNA表達(dá)很大程度上受到基因組拷貝數(shù)的影響[31]，也可能源于甲基化水平的不同。Ding等[41]發(fā)現(xiàn)，早在多灶HCC發(fā)生之前，肝硬化或者纖維化的結(jié)節(jié)中已經(jīng)發(fā)生了特征性的DNA 甲基化，并在肝臟中形成“場效應(yīng)”，為腫瘤的發(fā)生和發(fā)展提供了具有選擇性的生存優(yōu)勢。此外，RNA表達(dá)調(diào)控的其他表觀遺傳修飾例如m6A和m7G等研究也在探索中，相關(guān)機(jī)制的揭示有望為HCC的治療帶來突破。

2.2 多灶HCC轉(zhuǎn)錄組特征對精準(zhǔn)免疫治療的指導(dǎo)意義

免疫治療在HCC治療中有著很好的應(yīng)用前景，但其較低的反應(yīng)率和不同病灶的混合效應(yīng)仍然是目前面臨的最主要挑戰(zhàn)，HCC患者不同的癌灶間存在顯著不同的免疫微環(huán)境，包括免疫效應(yīng)細(xì)胞、免疫抑制細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子、生長因子等，共同塑造了多灶肝癌免疫微環(huán)境的異質(zhì)性。因此，從多灶HCC的免疫特征層面理解其免疫逃逸機(jī)制并開發(fā)更有效的免疫治療極為重要[4]。多灶HCC在轉(zhuǎn)錄組水平的解析可為臨床實踐提供有價值的參考信息。分析多灶HCC的RNA表達(dá)譜，一方面可以開發(fā)潛在的治療靶點，另一方面也有助于預(yù)測術(shù)后腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)[31]。

不同起源模式的多灶HCC有著不同的免疫微環(huán)境特征。Dong等[4]發(fā)現(xiàn)IM-HCC 病灶中T淋巴細(xì)胞浸潤減少，而M2型巨噬細(xì)胞浸潤增加。相比之下，在MO-HCC中免疫檢查點抑制性分子的表達(dá)更多。IM-HCC有更多共有的新生抗原和T淋巴細(xì)胞(抗原)受體庫，而MO-HCC則很少。此外，由于MO-HCC免疫浸潤較低，所以會發(fā)生更多的免疫編輯。筆者團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)多灶HCC中存在顯著的免疫異質(zhì)性，體現(xiàn)在免疫分子表達(dá)水平上的差異，但有趣的是，CD8+T淋巴細(xì)胞富集結(jié)節(jié)中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4和PD-1、PD-L1等抑制性免疫分子的表達(dá)也同樣升高，使得浸潤的CD8+T淋巴細(xì)胞難以發(fā)揮抗腫瘤功能[23]，因此，對于CD8+T淋巴細(xì)胞高浸潤的患者，進(jìn)行PD-1/PD-L1抑制劑治療可以緩解其免疫抑制狀態(tài)，從而增強(qiáng)浸潤C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞的殺傷能力。此外，作者發(fā)現(xiàn)與同一多灶性HCC病例中的大癌灶相比，小癌灶具有更多的免疫細(xì)胞浸潤和免疫通路上調(diào)，這可能部分解釋了為何小癌灶和大癌灶在抗PD-1治療時反應(yīng)不同[24]。

近期一項多灶HCC的研究將HCC分為3個亞型：免疫健全型、免疫缺陷型、免疫抑制型，不同的亞型中免疫細(xì)胞的組成差異較大，為將來的研究提供了很好的分類參考。免疫健全型具有正常的T淋巴細(xì)胞浸潤，但B淋巴細(xì)胞浸潤少；免疫缺陷型的淋巴細(xì)胞浸潤較少，但有較多的樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞；免疫抑制型中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞較多，同時伴隨PD-1、PD-L1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4以及Tim-1的表達(dá)上調(diào)[32]。此外，CD45和Foxp3可以作為簡單有效的免疫治療預(yù)測標(biāo)志物，提示免疫異質(zhì)性分析對指導(dǎo)免疫治療具有重要意義。

3 小結(jié)

綜上所述，針對多灶HCC患者進(jìn)行不同或聯(lián)合的免疫治療時需要考慮多灶HCC免疫微環(huán)境的異質(zhì)性[24,32]。采用免疫檢查點抑制劑單藥或聯(lián)合靶向藥物治療的個體化免疫治療策略是多灶HCC患者獲得更好臨床療效的重要環(huán)節(jié)。