微波輔助酶萃取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定靈芝中6種硒形態(tài)

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(1.烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,烏蘭察布 012000; 2.烏蘭察布市獸藥監(jiān)察所,烏蘭察布 012000)

硒是人體必須的生命元素[1],是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性中心,具有清除自由基、抗癌防癌、保護肝臟、防衰老、增強免疫等作用[1-2]。自然界中硒主要以無機硒和有機硒兩種形態(tài)存在,有機硒易被吸收,生物學(xué)活性高,對人體有益[3-4];而無機硒對人體有害,其中硒酸鹽及亞硒酸鹽毒性較大,會導(dǎo)致生物體病變,日本已于1993年禁止在食品和飼料中添加無機硒[5-6]。一些商販為了提高商品中硒含量,會在其中非法添加硒酸鹽、亞硒酸鹽等無機硒。為保障消費者權(quán)益,指導(dǎo)消費者合理補硒,需對市售富硒產(chǎn)品中硒形態(tài)進行檢測。

目前關(guān)于硒形態(tài)分析方法主要有原子熒光光譜法(AFS)[7-8]、原子吸收光譜法(AAS)[9]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)[10]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[11-12]和高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)[13-15]等。其中HPLC-ICP-MS將高選擇性的色譜分離技術(shù)與高靈敏度的質(zhì)譜檢測技術(shù)聯(lián)用,與現(xiàn)有其他技術(shù)相比,其在準(zhǔn)確度、靈敏度、分析效率等方面均有很大優(yōu)勢[15-16]。

本工作以靈芝為研究對象,采用微波輔助酶萃取靈芝中硒酸[Se(Ⅵ)]、亞硒酸[Se(Ⅳ)]、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、甲基硒代半胱氨酸(Se MeCys),建立了HPLC-ICP-MS同時測定靈芝中6種常見硒形態(tài)的方法,以期為靈芝等中草藥中硒形態(tài)的分離和檢測提供技術(shù)參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀;Agilent 7700x型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀;MARS型微波消解儀;AVANTI J-15型高速冷凍離心機;Milli-4.6 mm,5μm)等分析柱時對硒形態(tài)分離效果的影響。結(jié)果表明:Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱(250 mm×4.1 mm,10μm)能有效分離Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet、SeCys2、SeMeCys等5種硒形態(tài);安捷倫ZORBAX SB-Aq C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱可有效分離6種硒形態(tài);其余4種色譜柱存在部分目標(biāo)物不出峰、重疊[Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)]或分離度差等現(xiàn)象。因此,試驗選擇安捷倫ZORBAX SB-Aq C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱進行分析。plus 2150型超純水處理系統(tǒng);ME 204E型電子分析天平。

6種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1 000 mg·L-1,分別稱取適量硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品,用5%(體積分?jǐn)?shù),下同)鹽酸溶液溶解并定容至100.0mL。

6種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:10 mg·L-1,分別吸取6種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1mL于100mL容量瓶中,用5%鹽酸溶液稀釋至刻度。

6種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別吸取適量6種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中,用5%鹽酸溶液稀釋至刻度,混勻,配制成質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

Se(Ⅵ)[GBW 10033,(75.1±2.4)μg·g-1]、Se(Ⅳ)[GBW 10032,(68.9±1.4)μg·g-1]、SeMeCys[GBW 10088,(34.8±1.0)μg·g-1]、SeCys2[GBW 10087,(44.2±1.0)μg·g-1]、Se Met[GBW 10034,(97.9±2.5)μg·g-1]等硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于95%;SeEt標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98%;蛋白酶XIV的酶活性為200 000 U·g-1;其他所用試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 微波

1)萃取 功率300 W;升溫程序:0～10 min,由室溫升至37 ℃,保持30 min。

2)消解 功率1 200 W;升溫程序:0～10 min,由室溫升至160 ℃,保持30 min。

1.2.2 HPLC

安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫35 ℃;流動相為含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉的20 mmol·L-1檸檬酸溶液(pH 4.5);等度洗脫;流量為1.0mL·min-1。

1.2.3 ICP-MS

高頻入射功率1 500 W;蠕動泵轉(zhuǎn)速0.1 r·min-1;霧化室溫度2 ℃;載氣流量0.8 L·min-1,等離子體氣流量15 L·min-1,輔助氣流量0.8 L·min-1;采樣錐孔徑1.0 mm,截取錐孔徑0.7 mm;檢測同位素82Se;采樣周期0.8 s,采集時間600 s。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

用粉碎儀將靈芝磨成粉狀后,過0.15 mm篩,于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 6種硒形態(tài)的測定

稱取0.5 g靈芝樣品于50mL離心管中,加入水10mL和蛋白酶XIV 20 mg按微波萃取條件進行萃取,萃取液經(jīng)10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min后,過0.22μm濾膜,濾液供HPLC-ICP-MS分析。

1.3.3 ICP-MS總硒的測定

稱取0.2 g靈芝樣品于消解罐中,加入3mL市售過氧化氫溶液和5mL硝酸按微波消解條件進行消解,消解結(jié)束后冷卻,將消解液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中,用5%鹽酸溶液稀釋至刻度,混勻,按照ICP-MS儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

結(jié)合硒形態(tài)分析的相關(guān)文獻[15-17],試驗考察了分別采用Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱(250 mm×4.1 mm,10μm)、Waters Symmetry Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm)、安捷倫XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、AichromBond-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、資生堂Shiseido C18(250 mm×4.6 mm,5μm)、安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(250 mm×

2.2 色譜流動相的選擇

結(jié)合待測6種硒形態(tài)的理化性質(zhì),試驗考察了分別以磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、檸檬酸等化合物溶解而成的弱酸性溶液為流動相,并在其中添加庚基磺酸鈉、七氟丁酸、氫氧化四甲基胺等離子對試劑時對6種硒形態(tài)的分離情況的影響。結(jié)果表明:以含0.1%(體積分?jǐn)?shù))七氟丁酸的磷酸二氫銨或磷酸二氫鉀溶液作為流動相時,4種有機硒分離效果較好,而Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)色譜峰重復(fù)性較差,且易與SeCys2色譜峰重疊;以含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉的20 mmol·L-1檸檬酸溶液(pH 4.5)為流動相進行等度洗脫時,Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、Se Met、SeCys2、SeEt、Se MeCys等6種硒形態(tài)可完全分離,且峰形尖銳對稱。因此,試驗選擇含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉的20 mmol·L-1檸檬酸溶液(pH 4.5)作為流動相,并在優(yōu)化條件下對50μg·L-1的6種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定,色譜圖見圖1。

圖1 6種硒形態(tài)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the 6 selenium species

由圖1可知:Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、Se Met、SeCys2、SeEt、Se MeCys等6種硒形態(tài)的保留時間分別為3.21,4.06,6.41,4.38,7.38,6.05 min。

2.3 檢測同位素的選擇

基于硒在自然界中有80Se、78Se、76Se、82Se、77Se、74Se等6種同位素(其中80Se的豐度最大,其次為78Se和82Se),分別考察這6種同位素作為檢測同位素時,各硒形態(tài)在ICP-MS中的響應(yīng)信號強度。結(jié)果表明:等離子氣氬氣產(chǎn)生的多原子離子

36Ar38Ar＋、38Ar38Ar＋、38Ar2H＋、38Ar40Ar＋、40Ar40Ar＋、40Ar2H2＋等會干擾74Se＋、76Se＋、77Se＋、78Se＋、80Se＋、82Se＋的測定,其中,80Se＋和78Se＋受多原子離子40Ar40Ar＋的干擾最嚴(yán)重,且無法通過數(shù)字校正和檢測條件調(diào)諧優(yōu)化來消除,而40Ar2H2＋對82Se＋的干擾可通過選擇碰撞池(CCT)模式和優(yōu)化碰撞反應(yīng)氣流量消除。因此,試驗選擇82Se作為檢測同位素。

2.4 提取方式的選擇

試驗考察了振蕩提取、超聲提取、微波萃取等提取方式對蛋白酶XIV提取靈芝中硒形態(tài)的影響。結(jié)果表明:振蕩提取耗時長,提取效率低;振蕩和超聲都會在提取過程中產(chǎn)熱,而蛋白酶XIV活性在高溫下受抑制(蛋白酶XIV最佳酶解溫度為37 ℃,80 ℃以上受熱15 min失活),導(dǎo)致提取效率降低;微波萃取是利用電磁波產(chǎn)生的電磁場作用使固體或半固體物質(zhì)中的目標(biāo)物與基體分離,能保持目標(biāo)物的原本化合物狀態(tài)和有效控制蛋白酶XIV最佳酶解溫度,采用微波萃取得到的硒化物的提取率高達99.2%。因此,試驗選用的提取方式為微波萃取。

2.5 酶的種類和用量的選擇

目前,硒形態(tài)分析的前處理方法主要有酸消解、緩沖鹽提取和酶解等[11,15-16]。其中酸消解和緩沖鹽提取適合用于無機硒的提取,而對有機硒的萃取效果較差,這主要是由于強酸還原能力強,樣品中硒的形態(tài)易發(fā)生轉(zhuǎn)變;酶解具有高效、溫和、特異性強等優(yōu)點,且不易發(fā)生硒形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化?；谇叭搜芯炕A(chǔ)[7,16-17],試驗考察了胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶K、蛋白酶XIV等蛋白酶對靈芝中硒形態(tài)提取效果的影響。結(jié)果表明:微波輔助蛋白酶XIV提取靈芝中的Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、Se Met、SeCys2、SeEt、Se MeCys等6種硒形態(tài)效果最好。當(dāng)靈芝樣品量為1.0 g時,試驗考察了不同用量的蛋白酶XIV對硒形態(tài)提取效率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 蛋白酶XIV的用量對6種硒形態(tài)提取效率的影響Fig.2 Effect of the amount of protease XIV on extraction rate of the 6 selenium species

由圖2可知:隨著酶用量的增大,提取液中6種硒形態(tài)的提取效率也隨之增大,當(dāng)?shù)鞍酌竂IV用量為20.0 mg時,6種硒形態(tài)提取效率達到最大值,且趨于平衡。因此,試驗選擇蛋白酶XIV的用量為20.0 mg。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與測定下限

按照儀器工作條件對質(zhì)量濃度為0.5,1.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0μg·L-1的6種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定,以6種硒形態(tài)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.5～100.0μg·L-1,其他參數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)計算方法檢出限(3S/N),以10倍信噪比(S/N)計算方法測定下限(10S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收試驗

按照試驗方法對靈芝樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

6種硒形態(tài)的精密度和回收試驗的結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for recovery and precision(n＝6)

由表2可知:6種硒形態(tài)的回收率為91.7%～98.7%,RSD為0.031%～3.2%,表明該方法準(zhǔn)確度和精密度均較高。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對市售赤芝、紫芝、無柄紫芝、富硒赤芝等進行硒形態(tài)分析,結(jié)果見表3。

由表3可知:受檢靈芝中普遍存在Se(Ⅳ),部分靈芝樣品中含有Se(Ⅵ);除了富硒赤芝外,赤芝、紫芝、無柄紫芝中的硒含量都較低,且無機硒含量小于有機硒含量;赤芝和紫芝硒成分以Se Met為主,無柄紫芝硒成分以SeCys2為主,富硒赤芝硒成分以SeCys2和SeMet為主。這說明富硒赤芝含有豐富的硒成分,且以多種硒形態(tài)存在,可作為良好的補硒產(chǎn)品。

表3 市售靈芝中6種硒形態(tài)測定結(jié)果Tab.3 Determination results of the 6 selenium species in commercial Ganoderma lucidum

本工作采用微波輔助酶萃取靈芝中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、Se Met、SeCys2、SeEt、Se MeCys等6種硒形態(tài),建立了HPLC-ICP-MS同時測定靈芝中這6種硒形態(tài)的方法。本方法具有分離效果好、檢出限低、精密度高、準(zhǔn)確度好等優(yōu)點,可作為靈芝等中草藥中硒形態(tài)分析的檢測方法。