pH值偏移處理對油莎豆蛋白結(jié)構(gòu)及乳化性質(zhì)的影響

王 琳，周國衛(wèi)，于志超，孟洛冰，王玉瑩，張安琪，王喜波，江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

油莎豆又名油莎草、老虎豆、鐵荸薺，是一種莎草屬植物[1]。油莎豆富含油脂、糖、蛋白質(zhì)及維生素等，極具開發(fā)價值[2]。油莎豆尤其適合糖尿病患者和消化系統(tǒng)疾病患者食用，同時它還具有預(yù)防心臟疾病的作用[3]。油莎豆蛋白含有18 種氨基酸，總氨基酸含有29.88%，其中必需氨基酸占46.03%，非必需氨基酸占53.97%[4]。油莎豆蛋白可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中清蛋白為主要的蛋白組分（82.23%～91.93%），球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量較少（3%～7.5%）[5]。油莎豆蛋白雖然具有良好的營養(yǎng)價值，但是其溶解性及乳化性質(zhì)還有待提高。

乳化性質(zhì)是蛋白質(zhì)的重要功能性質(zhì)。從各種天然來源提取的植物蛋白質(zhì)可以用作乳化劑，因?yàn)樗鼈兡軌虼龠M(jìn)形成乳液，并改善乳液的穩(wěn)定性[6]。乳化性作為蛋白加工過程中重要的功能指標(biāo)，是決定蛋白在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用的重要體現(xiàn)，是影響蛋白產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。提高乳化性有利于改進(jìn)食品組織結(jié)構(gòu)、口感、外觀，以提高食品保存性[7]。因此乳化性是目前植物蛋白的研究熱點(diǎn)。pH值偏移對大豆等蛋白結(jié)構(gòu)及乳化性已有部分研究，發(fā)現(xiàn)它不會產(chǎn)生毒性和安全性等問題[8]。Jiang Jiang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，極端酸性pH值處理可以引起大豆蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而提高其乳化性。Zhang Yanjun等[9]研究了pH值對菠蘿蜜蛋白乳化性的影響，發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜蛋白的溶解度首先隨pH值的增加而降低，隨pH值進(jìn)一步增加溶解度增加，在中性條件下的菠蘿蜜蛋白顯示出更高的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。Renkema等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白、卵蛋白經(jīng)pH值偏移處理后，側(cè)鏈相互作用減弱，蛋白分子的三級結(jié)構(gòu)受到很大破壞。目前關(guān)于油莎豆的報道還主要集中于油莎豆的種植、油莎豆中油脂及蛋白提取的工藝優(yōu)化，而關(guān)于pH值偏移處理對油莎豆蛋白結(jié)構(gòu)及乳化性的影響鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)主要研究pH值偏移對油莎豆蛋白結(jié)構(gòu)及其乳化性的影響，為油莎豆蛋白未來在食品中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎豆（市售），油莎豆粉碎后，過60 目篩，用正己烷進(jìn)行脫脂處理，得脫脂油莎豆粕。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Sigma公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker、5×蛋白上樣緩沖液 索萊寶生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3600Plus型紫外-可見分光光度計、FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；ULTRA-TURRAX T18 Basic型高速分散機(jī) 德國IKA公司；FD5-series型冷凍干燥機(jī) 美國西盟國際集團(tuán)；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；Mastersizer 2000型粒度分布儀 美國布魯克海文儀器公司；Gel Doc EZ imager型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 油莎豆粕基本成分分析

粗蛋白含量：按GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定；粗脂肪含量：按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》方法測定；淀粉含量：按GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》方法測定；總糖含量的測定參考苯酚-硫酸法；水分含量：按GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》方法測定；灰分含量：按GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》方法測定；粗纖維含量：按GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》方法測定。

1.3.2 油莎豆蛋白提取工藝流程

脫脂油莎豆粕→pH 8.5堿提→離心→pH 4.5酸沉→離心→沉淀水洗3 次→復(fù)溶調(diào)pH 7→冷凍干燥→油莎豆蛋白。

工藝條件：將脫脂油莎豆粕與去離子水以體積比1∶15混合攪拌均勻，用NaOH調(diào)pH值至8.5浸提1.5 h，于8 000×g離心20 min。取上清液用HCl調(diào)pH值至4.5，再于8 000×g離心20 min。取沉淀水洗3 次，取少量水溶解沉淀并用NaOH調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥即得油莎豆蛋白，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為72%，蛋白提取率為63.42%，通過凱氏定氮法（N×6.25）測定所得。油莎豆蛋白基本成分分析方法同1.3.1節(jié)。

1.3.3 pH值偏移處理油莎豆蛋白

配制pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L），將油莎豆蛋白分散于不同pH值的磷酸鹽溶液中并于磁力攪拌器上室溫攪拌，使其充分溶解，4 ℃靜置過夜。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Laemmli等[11]的方法并加以改進(jìn)，配制5%的上層膠和13%的下層膠備用。將蛋白樣品稀釋為5 mg/mL，并與5×SDS上樣緩沖液以4∶1進(jìn)行混合，沸水處理5 min。將冷卻后的蛋白溶液吸取7 μL注入樣孔。初始電壓設(shè)定為90 V，進(jìn)入下層膠時設(shè)定電壓為120 V。電泳結(jié)束后將凝膠條用考馬斯亮藍(lán)染色液（R250）染色過夜，之后用脫色液脫色3～4 次，采用Gel Doc EZ imager型凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

將處理后的蛋白樣品進(jìn)行冷凍干燥，將1 mg樣品和溴化鉀粉末混合磨粉并壓制成片，用于傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）[12]進(jìn)行全波段掃描，設(shè)定參數(shù)為掃描次數(shù)32 次，測量范圍為4 000～400 cm－1，分辨率為4 cm－1。

1.3.6 粒徑分布的測定

將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）稀釋至1 mg/mL，粒度儀規(guī)格：顆粒折射率1.460，平衡時間120 s，分散劑折射率1.330。

1.3.7 紫外掃描

參照Morales等[13]的方法，將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L）進(jìn)行稀釋，使其質(zhì)量濃度為2 mg/mL，于紫外-可見分光光度計進(jìn)行紫外掃描，設(shè)置波長范圍200～400 nm，掃描速率為100 nm/min。實(shí)驗(yàn)值取3 次掃描的平均值。

1.3.8 內(nèi)源熒光光譜

參照文獻(xiàn)Liu Yan等[14]的方法，并略作修改。將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L）進(jìn)行稀釋，使其質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，于熒光分光度計進(jìn)行掃描。設(shè)定狹縫寬度5.0 nm，電壓700 mV，發(fā)射波長300～400 nm，激發(fā)波長290 nm，掃描速率5 nm/s。

1.3.9 濁度測定

采用Kurganov等[15]的方法。將處理后的蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）進(jìn)行稀釋，使其質(zhì)量濃度為2 mg/mL，用旋渦振蕩器將其混合，于紫外-可見分光光度計波長400 nm處測定其OD值，用所得OD值表示濁度。

1.3.10 溶解度測定

參考Samoto等[16]的方法。將樣品用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）稀釋后10 000×g離心20 min。取上清液適度稀釋，采用Lowry法測上清液中蛋白含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶解度按式（1）計算：

1.3.11 表面疏水性測定

參照Haskard等[17]的方法，略作修改。將不同條件下的樣品溶液用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）稀釋為不同質(zhì)量濃度（0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL）。然后將20 μL 1-苯胺基萘-8-磺酸（1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid，ANS）溶液（8.0 mmol/L，pH 7.0）分別加入上述配制好的不同質(zhì)量濃度溶液，用旋渦振蕩儀充分混合，將其放置在暗環(huán)境中反應(yīng)15 min。設(shè)置發(fā)射波長為470 nm，激發(fā)波長為390 nm，在此條件下測定樣品的熒光強(qiáng)度。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，斜率表示蛋白表面疏水性。

1.3.12 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

參照Pearce等[18]的方法。將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋，使其質(zhì)量濃度為2 mg/mL，以體積比3∶1將蛋白溶液與大豆油混合，用高速分散均質(zhì)器于11 000 r/min攪打1 min，于0 min和10 min分別從底部吸取溶液100 μL，將其加入到10 mL 0.1%的SDS溶液中混合均勻，用紫外-可見分光光度計于波長500 nm處分別測定吸光度，以SDS溶液作為空白。其乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsification stability index，ESI）按式（2）、（3）計算：

式中：N為稀釋倍數(shù)100；T為常數(shù)2.303；L為比色池光徑1 cm；φ為油相體積分?jǐn)?shù)0.25；C為乳化液形成前蛋白溶液的質(zhì)量濃度，10 mg/mL；A0、A10分別為乳狀液在第0、10分鐘的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS 19統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析，使用Origin 9.0軟件作圖，Peakfit 4.12軟件計算蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆粕及油莎豆蛋白的主要成分

對油莎豆粕的基本組成成分進(jìn)行測定分析，結(jié)果見表1。

表1 油莎豆粕的主要成分Table 1 Main components of C. esculentus L. dregs

表2 油莎豆蛋白的主要成分Table 2 Main components of C. esculentus L. protein

由表1可知，油莎豆粕中的粗蛋白、淀粉和總糖含量較高，具有很好的潛在利用價值。對油莎豆蛋白的基本組成成分進(jìn)行測定分析。由表2可知，凱氏定氮法測得蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（72.12±0.24）%。

2.2 SDS-PAGE圖譜

圖1 油莎豆SDS-PAG圖Fig. 1 SDS-PAGE pattern of C. esculentus L. protein

由圖1 可知，油莎豆蛋白亞基分子質(zhì)量分布于97.4～14.4 kDa之間，由凝膠成像儀分析可知其主要亞基分子質(zhì)量分布為17～22、31～38、75 kDa。由此可知，油莎豆蛋白多肽亞基大多數(shù)分布于低分子質(zhì)量（＜43 kDa）范圍中。在高分子質(zhì)量（＞94.7 kDa）范圍內(nèi)未見條帶分布。Codina-Torrella等[5]也得出相似結(jié)論。

2.3 FTIR分析

圖2 p值偏移處理對油莎豆蛋白FTIR光譜的影響Fig. 2 Effect of pH-shifting treatment on the FTIR spectrum of C. esculentus L. protein

Zhang Qiuting等[19]報道FTIR光譜上的酰胺I區(qū)域（1 600～1 700 cm－1）主要表示酰胺基團(tuán)的C＝O彎曲振蕩。每個子峰和二級結(jié)構(gòu)之間的對應(yīng)關(guān)系如下：α-螺旋為1 648～1 664 cm－1，β-折疊為1 615～1 637 cm－1和1 682～1 700 cm－1，β-轉(zhuǎn)角為1 664～1 681 cm－1，無規(guī)卷曲為1 637～1 648 cm－1[20]。油莎豆蛋白的FTIR光譜如圖2所示。由表3可知，隨pH值增加，二級結(jié)構(gòu)中β-折疊相對含量顯著降低，α-螺旋相對含量顯著增加，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量也略有增加。多肽鏈上羰基和氨基之間的氫鍵是維持α-螺旋穩(wěn)定的主要作用力[21]。油莎豆蛋白等電點(diǎn)為4.5，在中性條件下蛋白帶負(fù)電荷，在酸性條件下α-螺旋相對含量低可能是因?yàn)榈鞍追肿娱g電荷發(fā)生中和反應(yīng)，產(chǎn)生靜電作用，影響氫鍵的穩(wěn)定性[22]。說明靜電作用和氫鍵穩(wěn)定性都會影響α-螺旋含量[23]。β-折疊含量還與蛋白質(zhì)的疏水相互作用有關(guān)，其含量降低表明分子內(nèi)部的疏水性位點(diǎn)暴露，疏水性增強(qiáng)[24]，因此在pH 6～9的范圍內(nèi)，油莎豆蛋白β-折疊相對含量降低，表面疏水性增加。隨著pH值增加，β-轉(zhuǎn)角相對含量也略有增加，也可以說明pH值增加使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加舒展[25]。

表3 p值偏移處理對油莎豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 3 ffect of p-shifting treatment on the secondary structures of C. esculentusL. protein

表3 p值偏移處理對油莎豆蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 3 ffect of p-shifting treatment on the secondary structures of C. esculentusL. protein

注：結(jié)果以 ±s表示（n=3）；同列不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

pH 相對含量/%α-螺旋 β-折疊 β-轉(zhuǎn)角 無規(guī)卷曲3 28.11±0.32a 41.36±0.16f 10.50±0.21a 20.03±0.20a 4 30.48±0.24b 38.82±0.32e 10.52±0.56a 20.18±0.13b 5 31.10±0.26c 38.02±0.23d 10.49±0.22a 20.38±0.17bc 6 32.26±0.19e 36.48±0.29c 10.84±0.25b 20.42±0.24c 7 33.61±0.33f 34.85±0.60b 11.04±0.16b 20.50±0.15a 8 34.15±0.19g 34.59±0.24b 10.94±0.23b 20.52±0.24b 9 34.21±0.21g 33.70±0.17a 11.52±0.19c 20.57±0.23c 10 31.69±0.23d 36.86±0.22c 11.18±0.17b 20.27±0.26c

2.4 粒徑分布結(jié)果

圖3 p值偏移處理對油莎豆蛋白粒徑分布及平均粒徑的影響Fig. 3 Effects of pH-shifting treatment on the particle size distribution and average particle size of C. esculentus L. protein

粒徑是可以間接反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的指標(biāo)，粒度分布可以充分反映樣品溶液中粒子的大小和均勻性。由圖3可知，隨pH值增加，蛋白粒度分布逐漸從雙峰分布轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏宸植迹砻鞯鞍踪|(zhì)更均勻地分散在溶液體系中[26]。隨pH值增加，蛋白的平均粒徑在等電點(diǎn)（pH 4.5）附近急劇增大，pH值偏離等電點(diǎn)后，平均粒徑逐漸減小。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近蛋白靜電荷為0，分子間作用力減弱，蛋白顆粒間相互碰撞、聚集沉淀，形成聚集體，蛋白分子粒度尺寸因此變大[27]。隨pH值增加，平均粒徑變小，這可能說明蛋白分子解聚展開，結(jié)構(gòu)變得更加舒展，蛋白溶液體系隨pH值增加變得越來越穩(wěn)定。pH 9以后平均粒徑略有上升可能是因?yàn)閜H值過高導(dǎo)致蛋白變性過度，蛋白分子相互交聯(lián)產(chǎn)生新的聚集體。

2.5 溶解度分析

圖4 p值偏移處理對油莎豆蛋白溶解度的影響Fig. 4 Effect of pH-shifting treatment on the solubility of C. esculentus L. protein

由圖4可知，隨pH值增加蛋白質(zhì)溶解度先降低后增加，并在等電點(diǎn)（pH 4.5）附近達(dá)到最小值。這可能是因?yàn)榈鞍缀退g相互作用的減少增強(qiáng)了蛋白分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和沉淀，溶解度降低[28]。溶解度隨pH值升高而增加是由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加舒展，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)與極性基團(tuán)暴露出來，附近的結(jié)合水增多，促進(jìn)了蛋白的水化作用，提高了蛋白質(zhì)的溶解度[29]。同時，油莎豆蛋白顆粒減小，增加了蛋白質(zhì)顆粒的比表面積，也是溶解度增加的原因之一，該結(jié)論與2.2節(jié)粒徑測量結(jié)果一致。此外，有研究表明，pH值偏移處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，同時亞基之間二硫鍵斷裂，有助于溶解度的增加[30]。在pH 9之后溶解度變化趨于平緩，這可能是因?yàn)樵趶?qiáng)堿環(huán)境中蛋白嚴(yán)重變性，蛋白質(zhì)分子重新聚集沉淀。蛋白質(zhì)溶解度與蛋白質(zhì)的許多功能特性密切相關(guān)，包括其乳化性、凝膠形成能力和形成特性[31]。

2.6 紫外掃描光譜分析

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外光譜主要是由于蛋白中的發(fā)色基團(tuán)對紫外光的吸收作用。根據(jù)紫外吸收光譜的不同，可以推斷出蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的改變[32]。由圖5可知，隨pH值增加，紫外吸收強(qiáng)度先降低后增加，且在等電點(diǎn)（pH 4.5）附近達(dá)到最小值。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，溶解度達(dá)到最小值，影響了發(fā)色基團(tuán)的暴露，從而導(dǎo)致紫外吸收強(qiáng)度降低。但隨pH值增加，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)更加舒展，發(fā)色基團(tuán)與芳雜環(huán)疏水基團(tuán)更多地暴露，從而引起紫外吸收的增加。蛋白紫外吸收強(qiáng)度的變化說明pH值偏移處理可以誘導(dǎo)蛋白體系構(gòu)象發(fā)生變化，從而引起蛋白質(zhì)分子微環(huán)境的改變。

圖5 p值偏移處理對油莎豆蛋白紫外光譜的影響Fig. 5 Effect of pH-shifting treatment on the UV absorption spectrum of C. esculentus L. protein

2.7 熒光光譜分析

圖6 p值偏移處理對油莎豆蛋白熒光光譜的影響Fig. 6 Effect of pH-shifting treatment on the fluorescence spectrum of C. esculentus L. protein

內(nèi)源熒光光譜是檢測蛋白構(gòu)象變化的一種方法，它通過分析光譜變化反映出側(cè)鏈的變化[31]。間接說明了大豆蛋白三級結(jié)構(gòu)的改變。蛋白的內(nèi)源熒光主要來自于色氨酸（Trp），分子中苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）到Trp殘基之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致Phe和Tyr的作用很小，因此油莎豆蛋白的熒光峰實(shí)際上是色氨酸殘基的熒光峰[33]。由圖6可知，不同pH值處理的蛋白熒光光譜形狀沒有發(fā)生改變，但熒光強(qiáng)度發(fā)生了明顯變化。熒光強(qiáng)度隨pH值增加先降低后增加，在等電點(diǎn)附近熒光強(qiáng)度最低。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近，蛋白分子發(fā)生聚合沉淀，使暴露在蛋白分子表面的Trp殘基被包裹在蛋白分子內(nèi)部，導(dǎo)致蛋白熒光強(qiáng)度降低[34]。隨pH值增加，蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等作用力發(fā)生改變，蛋白結(jié)構(gòu)變得更加舒展，蛋白內(nèi)部的Trp殘基暴露出來，熒光強(qiáng)度增加。

2.8 濁度分析

為進(jìn)一步說明pH值偏移引起的蛋白分子聚集以及粒徑大小的關(guān)系，對油莎豆蛋白的濁度進(jìn)行測定[34]。由圖7可知，隨pH值增加，蛋白質(zhì)濁度先增加后降低，并在等電點(diǎn)（pH 4.5）附近達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近，蛋白凈電荷為零，分子間作用力減弱，蛋白顆粒間相互碰撞、聚集沉淀，顆粒較大，導(dǎo)致濁度增加[35]。Renkema等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，并通過疏水相互作用等作用力形成聚集體。堿性條件有利于蛋白質(zhì)溶解，所以隨pH值繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)溶解度增加，蛋白分子解聚，結(jié)構(gòu)被打開，顆粒變小，濁度降低。

圖7 p值偏移處理對油莎豆蛋白濁度的影響Fig. 7 Effect of pH-shifting treatment on the turbidity of C. esculentus L. protein

2.9 表面疏水性分析

圖8 p值偏移處理對油莎豆蛋白表面疏水性的影響Fig. 8 Effect of pH-shifting treatment on the surface hydrophobicity of C. esculentus L. protein

表面疏水性是用于評估暴露于蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán)數(shù)量的一種方法，通常用于反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，也與蛋白功能性質(zhì)有關(guān)[36]。由圖8可知，隨pH值增加，蛋白質(zhì)表面疏水性先降低后增加，并在等電點(diǎn)（pH 4.5）附近達(dá)到最低值，在pH 9之后又有小幅度降低。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，疏水基團(tuán)被埋藏在蛋白內(nèi)部，蛋白質(zhì)表面疏水性降低。蛋白質(zhì)表面疏水性隨pH值增大而升高是由于蛋白分子解折疊展開，埋藏在蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，ANS熒光探針結(jié)合位點(diǎn)增多[37]。pH值增加，表面疏水性增加，熒光強(qiáng)度就越大，這與2.5節(jié)熒光光譜分析一致。研究表明，當(dāng)pH值超過一定范圍后，蛋白質(zhì)的二硫鍵被破壞，亞基解離，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，增加其表面疏水性[38]。pH 9之后表面疏水性降低，這可能是因?yàn)閜H值過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度變性，蛋白分子重新聚集，疏水基團(tuán)被重新包裹在蛋白分子內(nèi)部[39]。

2.10 EAI及ESI分析

圖9 p值偏移處理對油莎豆蛋白乳化性的影響Fig. 9 Effect of pH-shifting treatment on the emulsifying properties of C. esculentus L. protein

由圖9可知，隨pH值增加，油莎豆蛋白的EAI先降低后增加，并在等電點(diǎn)附近達(dá)到最小值。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近，蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白分子發(fā)生聚集，疏水基團(tuán)被包裹在分子內(nèi)部，影響乳化的進(jìn)行，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)EAI的降低。楊令葉[40]研究表明，花椒籽仁蛋白pH值在等電點(diǎn)附近時溶解度降低，參與乳化作用的蛋白減少，從而導(dǎo)致EAI降低；Puppo等[41]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的乳化性與疏水性和疏水基團(tuán)的分布有關(guān)。堿性環(huán)境中隨pH值增加，蛋白質(zhì)EAI也逐漸增加，這可能是因?yàn)閜H值升高，顆粒尺寸變小，蛋白結(jié)構(gòu)展開，原本包裹在蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，增強(qiáng)其表面活性[42]，導(dǎo)致蛋白EAI升高。

ESI趨勢與EAI相似，在等電點(diǎn)處達(dá)到最小值。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近，油水界面吸附蛋白質(zhì)減少，界面穩(wěn)定性受到破壞，蛋白質(zhì)分子易發(fā)生聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)ESI降低[43]。pH值偏離等電點(diǎn)后，隨pH值增加ESI逐漸升高，這可能因?yàn)殡S著pH值增加，蛋白溶解度提高，更多蛋白分子吸附到油水界面，堆積在油滴周圍，防止界面穩(wěn)定性的破壞，從而蛋白質(zhì)ESI升高。

3 結(jié) 論

隨pH值升高，油莎豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)中β-折疊相對含量降低，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量增加。α-螺旋相對含量低可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境中，蛋白分子間部分電荷發(fā)生中和反應(yīng)，產(chǎn)生靜電作用，影響氫鍵的穩(wěn)定性。β-折疊相對含量降低可以表明蛋白疏水性增強(qiáng)。蛋白平均粒徑在堿性條件下隨pH值升高而減小，蛋白粒度分布逐漸從雙峰分布轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏宸植?，表明蛋白質(zhì)可以更均勻地分散在溶液體系中。通過熒光光譜與紫外光譜分析可知pH值偏移處理使蛋白分子構(gòu)象發(fā)生了改變，在堿性條件下蛋白分子內(nèi)部多肽鏈部分展開，疏水基團(tuán)暴露，蛋白結(jié)構(gòu)變得更加舒展。隨pH值增加，蛋白濁度降低，說明蛋白粒子更加分散。蛋白EAI及ESI隨pH值增加先降低后增加，表面疏水性也有相同趨勢，說明pH值升高，蛋白結(jié)構(gòu)展開，包裹在蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，表面活性增強(qiáng)，導(dǎo)致EAI升高，同時蛋白溶解度提高，更多蛋白分子吸附到油水界面，堆積在油滴周圍，防止界面穩(wěn)定性的破壞，蛋白質(zhì)ESI升高。