茴香揮發(fā)物對三七根腐病菌的抑制活性及抑菌物質(zhì)鑒定

劉海嬌 方嵐 蘇應(yīng)威 朱書生 張子龍 楊敏

摘要：【目的】明確茴香揮發(fā)物對三七主要根腐病菌的抑制活性及主要抑菌物質(zhì)，為利用茴香與三七多樣性種植防控三七根腐病提供理論依據(jù)。【方法】采用菌絲生長速率法測定茴香莖葉揮發(fā)物對3種三七根腐病菌（茄腐鐮刀菌F-3、惡疫霉菌D-1和毀滅柱孢菌RS006）的抑制活性;收集茴香揮發(fā)物并通過氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析揮發(fā)物成分及其相對含量;通過化合物抑菌活性測定明確揮發(fā)物中主要的抑菌物質(zhì)?！窘Y(jié)果】茴香莖葉揮發(fā)物對3種三七根腐病菌（F-3、D-1和RS006）菌絲生長的抑制活性均隨著用量的增加而增強，且對D-1和RS006的抑制能力強于F-3;當(dāng)用量達(dá)2.0 g/皿時，莖部揮發(fā)物對F-3、D-1和RS006的抑制率分別為14.50%、66.10%和85.90%;葉部揮發(fā)物對F-3、D-1和RS006的抑制率分別為15.20%、67.60%和79.10%。GC-MS分析表明，茴香揮發(fā)物中主要是烯烴類（39.47%）和萜烯類（25.68%）物質(zhì)，主要的單體成分為1，6-二甲基-1，5環(huán)辛二烯（36.82%）、4-烯丙基苯甲醚（17.05%）、萜品油烯（9.28%）、茴香腦（7.68%）和羅勒烯（5.19%）等。揮發(fā)物單體抑菌活性測定結(jié)果表明，4-烯丙基苯甲醚的抑菌活性較強，在1200 mL/m3時對F-3和RS006的抑制率分別為48.59%和86.17%，在800 mL/m3時對D-1的抑制率已達(dá)100.00%?！窘Y(jié)論】茴香揮發(fā)物能較好地抑制三七根腐病菌生長，主要的抑菌單體成分為4-烯丙基苯甲醚，可利用茴香與三七進(jìn)行間作或套作以防控根腐病。

關(guān)鍵詞： 茴香;揮發(fā)物;三七;根腐病菌;4-烯丙基苯甲醚

中圖分類號： S435.672;S476.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2145-07

Antimicrobial activities test and antibacterial substance identification of fennel volatiles against the growth of

Panax notoginseng root rot pathogens

LIU Hai-jiao1， FANG Lan1， SU Ying-wei1， ZHU Shu-sheng1， ZHANG Zi-long2*， YANG Min1*

（1Key Laboratory for Agro-biodiversity and Pest Control of Ministry of Education， Yunnan Agricultural University， Kunming? 650201， China; 2College of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine，

Beijing? 102400， China）

Abstract：【Objective】The inhibitory activity and main components of fennel volatiles against root rot pathogens of Panax notoginseng were studied to provide theoretical basis for reducing root rot of P. notoginseng by crop diversity planting. 【Method】First， the mycelium growth rate method was used to determine the antifungal activity of fennel stems and leaves volatiles against P. notoginseng root rot poathogens（Fusarium solani F-3， Phytophthora cactorum D-1 and Cylindrocarpon destructans RS006）. Then， the volatiles were collected and their components and relative contents were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. Finally， the main antifungal substances in the volatiles were determined by the inhibitory activity. 【Result】The results showed that the inhibitory rate of fennel stems and leaves against the mycelial growth of pathogens（F-3， D-1 and RS006） increased with the increase of dosage， and the inhibitory strength against D-1 and RS006 was stronger than that against F-3. The inhibition rates of stem volatiles against F-3， D-1 and RS006 were 14.50%， 66.10% and 85.90% respectively， and that of leaf volatiles were 15.20%， 67.60% and 79.10% respectively when the dosage was 2.0 g/dish. GC-MS analysis showed that the main volatiles of fennel were alkenes（39.47%） and terpenes（25.68%）， and the main monomers were 1，6-dimethyl-1，5-cyclooctadiene（36.82%）， estragole （17.05%）， 1-methyl-4-（1-methylethylidene）-cyclohexene（9.28%）， anethole（7.68%）， β-ocimene（5.19%）. The antifungal activity results of volatile monomers showed that estragole exhibited stronger inhibitory ability， the inhibitory rates against F-3 and RS006 were 48.59% and 86.17% respectively at 1200 mL/m3 and the inhibition rate against D-1 reached 100.00% at 800 mL/m3. 【Conclusion】Fennel volatiles have good inhibitory effects against the growth of root rot pathogens of P. notoginseng and estragole is the main antifungal component. There is certain potential to control the root rot by intercropping or interplanting fennel with P. notoginseng.

Key words： fennel; volatile; Panax notoginseng; root rot pathogens; estragole

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31760535）; Young and Middle-aged Academic and Technical Leaders Reserve Programme in Yunnan（202005AC160045）;Yunnan Eco-friendly Food International Coo-peration Research Center Project（2019ZG00901-02）

0 引言

【研究意義】三七（Panax notoginseng）是我國特有的名貴中藥材，云南是其原產(chǎn)地和主產(chǎn)地，是云南生物醫(yī)藥和大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心品種（崔秀明和黃璐琦，2018）。目前，三七種植面臨嚴(yán)重的連作障礙問題，根腐病暴發(fā)是主要表現(xiàn)形式，嚴(yán)重影響三七的產(chǎn)量和質(zhì)量（吳鳳云等，2017;張紅瑞等，2018）。作物多樣性種植是控制病害行之有效的方法，多樣性種植的方式包括輪作、間作、套作和伴生種植等（楊靜等，2012）。實際生產(chǎn)中，輪作是緩解三七連作障礙最常用的方法（張子龍等，2015），但作物與三七輪作周期長，往往需要15～20年才可再次種植三七（余前進(jìn)，2015）。因此，篩選適宜的多樣性種植作物，利用不同作物對非寄主病原菌的抑制能力與三七進(jìn)行間作、輪作或伴生種植，可作為一種生態(tài)友好型的病害控制方式推廣應(yīng)用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自1986年以來，研究明確了三七根腐病的主要病原，包括真菌、卵菌、細(xì)菌和線蟲等20多種，其中真菌是最重要的病原，主要包含鐮刀菌屬（Fusarium）、土赤殼屬（Ilyonectria）和疫霉屬（Phytophthora）等病原物（Liu et al.，2019）。揮發(fā)是植物化感作用的形式之一，揮發(fā)物是植物—微生物互作的重要物質(zhì)載體（Sharifi and Ryu，2018）。利用作物揮發(fā)物抑制病原菌的特性進(jìn)行病害控制是有效的方式。據(jù)文獻(xiàn)報道，西芹揮發(fā)物對黃瓜枯萎病菌有化感抑制作用，且化感效果隨濃度的增加而增加（陳磊等，2012）;蔥屬作物的揮發(fā)物可抑制包括三七根腐病菌在內(nèi)的多種植物病原菌的菌絲生長（楊敏等，2013;張偉等，2013）;香蕉與細(xì)香蔥間作或輪作可有效控制香蕉枯萎病，其作用機理為細(xì)香蔥的揮發(fā)物中含有抑制香蕉枯萎病病原菌的物質(zhì)（Zhang et al.，2013）。茴香（Foeniculum vulgare Mill.）為傘形科茴香屬草本香料植物，其果實、根、莖和葉均可藥食兩用，茴香提取液主要成分有精油、黃酮、糖苷、甾醇及生物堿等物質(zhì)（韓光順等，2018）。茴香與扁豆間作，能顯著降低扁豆根腐病的發(fā)病率（Abdel-Monaim and Abo-Elyousr，2012）;茴香與甜瓜輪作不僅可抑制枯萎病菌的生長和繁殖，改善土壤環(huán)境，還能降低甜瓜產(chǎn)生的化感自毒物質(zhì)酚酸，緩解甜瓜連作障礙（王素娜，2017）;此外，還有研究證明茴香揮發(fā)物對真菌、細(xì)菌等微生物具有抑菌作用（王建清等，2011;何新萍等，2012;馬江鋒和曾紅，2016）。【本研究切入點】茴香揮發(fā)物具有抑菌活性，與其他作物間作或輪作具有較好的防控土傳病害效果，能否利用茴香與三七進(jìn)行多樣性種植以緩解三七根腐病尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用菌絲生長速率法測定茴香莖葉揮發(fā)物對三七主要根腐病菌的抑制活性，收集茴香揮發(fā)物并通過氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）鑒定揮發(fā)物單體物質(zhì)，測定揮發(fā)物中主要單體化合物對三七根腐病菌的抑制效果，明確茴香揮發(fā)物對三七根腐病菌的抑制效果及主要活性物質(zhì)，為利用茴香與三七間作或套作防控三七根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 供試三七根腐病菌株為茄腐鐮刀菌（F. solani）F-3、惡疫霉菌（P. cactorum）D-1和毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室提供。

1. 1. 2 供試植物材料 茴香植株，品種為四季茴香，生長時間約60 d，購自農(nóng)貿(mào)市場。

1. 1. 3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：用于培養(yǎng)F-3和RS006;胡蘿卜培養(yǎng)基（CA）：用于培養(yǎng)D-1。

1. 1. 4 供試標(biāo)準(zhǔn)品 月桂烯[含穩(wěn)定劑BHT，純度>70.0%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]、γ-萜品烯[純度>95.0%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]、羅勒烯（純度≥90%，SIGMA-ALDRICH）和4-烯丙基苯甲醚[純度>98.0%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 茴香揮發(fā)物抑菌活性測定 采用菌絲生長速率法測定。取供試茴香莖葉部分，先用3%次氯酸鈉表面消毒3 mim，隨后用無菌水沖洗5次。將莖和葉分開，分別切成約5 mm長的小段置于滅菌培養(yǎng)皿中備用。在制備好的培養(yǎng)基平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，在滅菌天平上稱取植物組織放入培養(yǎng)皿蓋上并均勻鋪開（皿蓋上提前放置1片滅菌紙用于放置莖葉組織）。莖和葉分別設(shè)置0.5、1.0和2.0 g/皿3個水平，以不放植物組織的平板作為空白對照，每處理3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿用封口膜密封后倒置放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待對照菌落長到培養(yǎng)皿直徑的2/3時，采用十字交叉法測量菌落直徑，并按以下公式計算抑制率（楊敏等，2013）。

抑制率（%）=（對照菌落平均直徑-處理菌落平

均直徑）/對照菌落平均直徑×100

1. 2. 2 供試植物揮發(fā)物收集 將3 kg茴香莖葉切成5 mm左右小段，置于自制收集裝置收集揮發(fā)物（劉海嬌等，2018）。收集裝置利用空氣泵將揮發(fā)物帶入裝有吸附樹脂的吸附柱中，連續(xù)收集24 h后，將吸附柱取下并用正己烷洗脫3次，合并收集洗脫液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮后氮吹濃縮至干，再用甲醇溶解后過0.22 μm有機濾膜，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 揮發(fā)物成分GC-MS分析 收集到的揮發(fā)物用GC-MS（島津GC-MS-QP 2010，ultra）進(jìn)行分析。GC分析條件：SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）;起始柱溫40 ℃，以3.0 ℃/min升溫至80.0 ℃后，以5.0 ℃/min升溫至260.0 ℃，保持30.00 min;載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度250.0 ℃，進(jìn)樣量2 μL，按分流比10∶1分流進(jìn)樣。MS分析條件：EI電離源，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍35～500 m/z，采集方式Scan，掃描間隔0.30 s。根據(jù)NIST14s譜圖庫中的保留時間檢索對比鑒定揮發(fā)物的成分，并通過不同化合物峰面積的百分比確定相對含量。

1. 2. 4 茴香揮發(fā)物單體抑菌活性測定 將1.5 mL離心管的蓋子剪下進(jìn)行滅菌，在制備好的培養(yǎng)基平板中央先接種直徑5 mm的菌餅，再分別加入10、20、40和60 μL揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品到離心管蓋子中，并置于培養(yǎng)皿蓋上，使其在培養(yǎng)皿中的終濃度為200、400、800和1200 mL/m3，以不加標(biāo)準(zhǔn)品為對照，每處理4次重復(fù)。培養(yǎng)條件及抑制率計算方法同1.2.1。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010和SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪圖，采用Duncans新復(fù)極差法和獨立樣本t檢驗進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 茴香揮發(fā)物抑菌活性分析結(jié)果

茴香的莖和葉揮發(fā)物對3種供試根腐病菌的抑制活性隨著用量的增加而增強（圖1）。在本試驗所設(shè)水平下，茴香的莖對RS006（圖1-E和圖1-F）和D-1（圖1-C和圖1-D）表現(xiàn)為低促高抑的濃度效應(yīng)，即在最低用量0.5 g/皿時促進(jìn)病原菌生長，當(dāng)用量增加到1.0和2.0 g/皿時可抑制病原菌的生長;最大用量2.0 g/皿時，莖部揮發(fā)物對F-3、D-1和RS006的抑制率分別為14.50%、66.10%和85.90%，葉部揮發(fā)物對F-3、D-1和RS006的抑制率分別為15.20%、67.60%和79.10%。綜合3個濃度分析（表1），茴香莖揮發(fā)物對F-3、D-1和RS006的抑菌活性與茴香葉揮發(fā)物對3種根腐病菌的抑制活性差異不顯著（P>0.05，下同）。

2. 2 茴香揮發(fā)物單體成分分析結(jié)果

由于茴香莖和葉揮發(fā)物對三七根腐病菌的抑制活性無顯著差異，因此將茴香莖、葉合并收集揮發(fā)物。試驗共檢測到104種化學(xué)成分，以下僅列出相似度≥80%且相對峰面積≥0.1%的組分，共28種，分別屬于烯烴類、萜烯類、醚類、羧酸酯類、醇類、烷烴類、苯環(huán)類和酮類，總相對含量為95.83%。其中，烯烴類物質(zhì)相對含量最高，為39.47%，包含10種物質(zhì);萜烯類共有8種物質(zhì)，相對含量25.68%;醚類有2種物質(zhì)，相對含量24.73%;羧酸酯類有3種物質(zhì)，相對含量4.91%;其他為醇類、烷烴類、苯環(huán)類和酮類，相對含量及物質(zhì)種數(shù)分別為0.45%（1種）、0.24%（2種）、0.23%（1種）和0.12%（1種）。所有物質(zhì)中，相對含量大于1.00%的揮發(fā)物有10種，分別為1，6-二甲基-1，5環(huán)辛二烯（36.82%）、4-烯丙基苯甲醚（17.05%）、萜品油烯（9.28%）、茴香腦（7.68%）、羅勒烯（5.19%）、γ-萜品烯（4.74%）、（1S-exo）-1，3，3-三甲基雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2-醇乙酸酯（4.14%）、月桂烯（2.10%）、2-甲基-5-異丙基雙環(huán)[3.1.0]己-2-烯（1.83%）和羅勒烯異構(gòu)體混合物（1.60%）（表2）。

2. 3 茴香中主要揮發(fā)物單體抑菌活性分析結(jié)果

在相對含量排前10的揮發(fā)物單體中，選取相似度≥95%的4種單體化合物月桂烯、γ-萜品烯、羅勒烯和4-烯丙基苯甲醚，測定該4種單體化合物對三七根腐病菌的抑制活性。由圖2可知，4種揮發(fā)物單體中，除月桂烯對F-3和D-1無抑制活性外，其他3種化合物對供試根腐病菌均有抑制活性，但抑菌能力存在差異。4-烯丙基苯甲醚對3種病原菌的抑制活性最強，且抑制率隨濃度的升高顯著增加，對F-3和RS006在供試最高濃度1200 mL/m3時其抑制率分別達(dá)48.59%和86.17%，在800 mL/m3時對D-1的抑制率已達(dá)100.00%。γ-萜品烯對RS006的抑制活性較強，其抑制率為54.01%～63.14%，對F-3和D-1在供試最高濃度下其抑制率低于25.00%。羅勒烯對F-3和D-1的抑制活性與γ-萜品烯類似，對RS006表現(xiàn)出低促高抑現(xiàn)象，但促進(jìn)或抑制作用均較弱。月桂烯僅對RS006表現(xiàn)出抑制活性，但抑制活性不強，在供試最高濃度下其抑制率為26.36%。

3 討論

三七根腐病是一類極難防治的土傳病害，已成為限制三七健康生產(chǎn)的瓶頸問題。與作物合理輪作是減輕三七根腐病危害的有效措施之一。本研究結(jié)果顯示，茴香莖葉揮發(fā)物對供試根腐病菌具有較強的抑制活性。在高用量2.0 g/皿時，茴香莖部揮發(fā)物對D-1和RS006的抑制率分別達(dá)66.10%和85.90%，茴香葉部揮發(fā)物對D-1和RS006的抑制率也分別達(dá)67.60%和79.10%。已有研究證實，蔥屬作物（大蒜、洋蔥、蔥和韭菜）的揮發(fā)物和浸提液對引起三七根腐病的惡疫霉菌和腐皮鐮孢菌均具有明顯的抑制效果，蔥屬作物可用作輪作作物控制三七根腐病（張偉等，2013）;茴香與扁豆間作可顯著降低由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和茄腐鐮刀菌（F. solani）引起的扁豆根腐病（Abdel-Monaim and Abo-Elyousr，2012）;茴香組織揮發(fā)物對煙草疫霉菌菌絲生長有抑制作用，生產(chǎn)上可利用茴香與煙草合理輪作或間作來控制煙草黑脛病的發(fā)生和危害（方玉婷等，2015）;茴香與甜瓜輪作對降低甜瓜的連作障礙也有較好的效果（王素娜，2017）。因此，利用茴香與三七間作、套作或?qū)④钕惴襁M(jìn)三七連作土中，可對根腐病菌起到一定的抑制作用，從而減輕三七根腐病的發(fā)生和危害，但其具體防控效果還需田間試驗進(jìn)一步驗證。

茴香揮發(fā)物中的絕大部分物質(zhì)為烯烴類、萜烯類、醚類和羧酸酯類等，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，4-烯丙基苯甲醚是揮發(fā)物中相對含量較高且抑菌活性較好的單體物質(zhì)。已有的對茴香揮發(fā)物的研究多集中在其干燥果實小茴香中，高莉等（2007）采用水蒸氣蒸餾法獲取小茴香揮發(fā)油，其主要成分為反式茴香腦、α-水芹烯和愛草腦（即4-烯丙基苯甲醚），抑菌試驗結(jié)果表明，小茴香揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果;馬愛云等（2017）測定了茴香組織中的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)茴香葉和花精油中含有檸檬烯、反式茴香腦和α-蒎烯等，茴香精油中的反式茴香腦、茴香醛和4-烯丙基苯甲醚等具有較強的抑菌活性。本研究中，4-烯丙基苯甲醚對供試根腐病菌也具有較好的抑菌活性，在最高供試濃度時對根腐病菌F-3、D-1和RS006的抑制率分別達(dá)48.59%、100.00%和86.17%。值得注意的是，與一些商用農(nóng)藥相比，4-烯丙基苯甲醚的抑菌活性不算強，如以異硫氰酸烯丙酯為主要成分的辣根素，其對禾谷鐮刀菌（F. graminearum）和立枯絲核菌等10余種植物病原真菌及瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、辣椒疫霉（P. capsici）等卵菌的菌絲生長半數(shù)有效濃度（EC50）為0.94～24.64 μg/mL。因此，在后續(xù)的研究中需進(jìn)一步明確茴香揮發(fā)物不同成分間是否存在協(xié)同抑菌作用，為深入解析茴香揮發(fā)物的抑菌機制提供參考。

4 結(jié)論

茴香揮發(fā)物對三七根腐病菌具有較好的抑制活性，茴香揮發(fā)物中的4-烯丙基苯甲醚抑菌活性較強，可利用茴香與三七進(jìn)行間作或套作以防控根腐病。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）