3株奶牛生殖道分離乳酸菌的益生特性評價(jià)

宋朋杰 武小虎 王東升 楊潔 李亞娟 蔣威 沈文祥 邵丹 嚴(yán)作廷

摘要：【目的】評價(jià)健康奶牛生殖道分離乳酸菌益生特性，發(fā)掘其作為益生菌制劑細(xì)菌成分的可能性，為開發(fā)防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑提供科學(xué)依據(jù)。【方法】以直腸把握法無菌采集產(chǎn)后40～60 d健康奶牛子宮分泌物，采用MRS培養(yǎng)基在厭氧條件（氧氣濃度<1.2%，37 ℃）下分離乳酸菌，通過擴(kuò)增16S rDNA序列進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行抑菌活性、耐藥性、黏附子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞特性及安全性評估，分析其開發(fā)成益生菌制劑的可能性?！窘Y(jié)果】經(jīng)16S rDNA測序分析共獲得8株乳酸菌，分別為植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖桿菌、蒙氏腸球菌、德氏乳桿菌、戊糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選取其中3株（植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌）進(jìn)行益生特性評價(jià)。3株奶牛生殖道乳酸菌培養(yǎng)上清液對大腸桿菌、無乳鏈球菌及金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出良好的抑制效果，約在接種 3 h后進(jìn)入典型的指數(shù)生長期，生長至平臺期后植物乳桿菌OD620 nm為1.375、鼠李糖桿菌OD620 nm為1.314、副干酪乳桿菌OD620 nm為1.250。副干酪乳桿菌的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，植物乳桿菌和鼠李糖桿菌的產(chǎn)酸能力幾乎相同，但均不產(chǎn)H2O2。3株奶牛生殖道乳酸菌對青霉素G、氯霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢唑林和四環(huán)素等7種抗菌藥物高度敏感;能同時(shí)檢測到磺胺類耐藥基因sul2，在副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌中還同時(shí)檢測到氨基糖苷類耐藥基因aphA-2和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaIMP。副干酪乳桿菌能很好地黏附于奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，且黏附效率與副干酪乳桿菌濃度呈正相關(guān)。3株奶牛生殖道乳酸菌的混合菌液經(jīng)腹腔注射小鼠后未引起臟器病變，且對小鼠的行為活動(dòng)、采食飲水亦無明顯影響?！窘Y(jié)論】從奶牛生殖道分離獲得的植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌可作為潛在的益生菌，用于開發(fā)防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑。

關(guān)鍵詞： 奶牛;生殖道;乳酸菌;子宮內(nèi)膜炎;益生特性;微生態(tài)制劑

中圖分類號： S852.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2278-09

Probiotic evaluation of three strains of lactic acid

bacteria isolated from cow genital tract

SONG Peng-jie1， WU Xiao-hu1*， WANG Dong-sheng1， YANG Jie1， LI Ya-juan1，2，

JIANG Wei1， SHEN Wen-xiang1， SHAO Dan1， YAN Zuo-ting1*

（1Lanzhou Institude of Husbandry and Pharmaceutical Sciences， Chinese Academic of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development of Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Engineering & Technology Research Center of? Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province， Chinese Academic of Agricultural Sciences， Lanzhou? 730050， China; 2College of Animal Science and Technology，

Guangxi University， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】To evaluate the probiotic characteristics of lactic acid bacteria isolated from the reproductive tract of dairy cows，? explore its potential to be bacterial component to provide raw materials for microecological agents， and offer theoretical basis for the development of microecological agents for prevention and treatment of endometritis in cows. 【Method】The vaginal secretions of healthy dairy cows from 40 to 60 d after parturition were collected aseptically by rectal palpation method. Lactic acid bacteria were isolated by MRS medium under anaerobic conditions（oxygen concentration <1.2%， 37 ℃）. The antimicrobial activity， drug resistance， adhesion to endometrial epithelial cells and safety were evaluated to analyze the possibility of its development as probiotics by 16S rDNA sequence amplification. 【Result】A total of 8 lactic acid bacteria were obtained by 16S rDNA sequencing， including Lactobacillus plantarum， L. paracasei， Bacillus cereus， Rhamnose lactobacillus， Enterococcus mongholicus， L. delbrueckii， L. pentosus and Streptococcus thermophilus. According to the preliminary experimental results， three of them（L. plantarum， L. paracasei and Rhamnose lactobacillus） were selected for probiotic evaluation. About 3 h after inoculation， all three strains entered the typical exponential growth phase，and the supernatant of genital tractlactic acid bacteria showed fine inhibition to Escherichia coli，? Streptococcus agalactiae and Staphylococcus aureus， and the OD620nm of L. plantarum was 1.375， R. lactobacillus was 1.314， L. paracasei was 1.250 at platform stage. L. paracasei had the strongest acid producing ability， while L. plantarum and R. lactobacillus had almost the same acid production capacity， but they did not produce H2O2. Three strains of genital tract lactic acid bacteria were sensitive to 7 antibiotics such as penicillin G， chloramphenicol， amoxicillin， ampicillin， cefotaxime， cefazolin and tetracycline， and sulfa resistance genes sul2 were detected. In L. paracasei and L. rhamnosus， amino glycoside? resistance gene aphA-2 and β-lactam resistance gene blaIMP were detected. L. paracasei could adhere to epithelial cells of genital tract， and adhesion rate was positively correlated with L. paracasei concentration. The mixed bacteria liquid of the three strains of lactic acid bacteria isolated from the reproductive tract of cows were injected into rat， and did not cause visceral diseases， and had no obvious effects on behavior and ingestion of rat. 【Conclusion】L. plantarum，L. paracasei and L. rhamnosus have the potential as probiotics to further develop lactic acid bacteria microecological preparations.

Key words： cows; genital tract; lactic acid bacteria; endometritis; probiotic characters; microecological preparations

Foundation item：National Key Research and Development Program（2017YFD0502201）; Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund（1610322018003）; Lanzhou Science and Technology Planning Project（2018-1-100）

0 引言

【研究意義】子宮內(nèi)膜炎作為奶牛產(chǎn)后的一種多發(fā)病，是導(dǎo)致奶牛不孕、受孕率低下及空懷期延長的主要病因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在不孕奶牛中患子宮內(nèi)膜炎的比例高達(dá)95%（Zobel，2013;馬帥等，2018;邵丹等，2019）。患子宮內(nèi)膜炎的奶牛因其子宮局部存在炎癥，而阻礙精子運(yùn)行及受精卵著床，嚴(yán)重影響生殖激素水平，致使其繁殖效率明顯降低，給整個(gè)奶牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。益生菌（Probiotics）是指適當(dāng)攝入后對宿主產(chǎn)生各種有益影響的可傳代培養(yǎng)微生物（Prado et al.，2015;楊虹等，2019），具有抵抗機(jī)體各種不利條件（唾液酶、低pH、胰液和膽汁等）的能力，且能在胃腸道黏膜、呼吸道黏膜、乳腺上皮及子宮內(nèi)膜上皮等部位定殖而發(fā)揮生物學(xué)功能，有利于宿主微生物環(huán)境的調(diào)節(jié)（Zoumpopoulou et al.，2017）。乳酸菌是最常見的一種益生菌，具有綠色安全的特點(diǎn)，在維持奶牛胃腸道菌群平衡上已得到廣泛應(yīng)用。Peter等（2018）研究表明，將布氏乳桿菌投入患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮中能顯著降低IL-1β和IL-8等炎性細(xì)胞因子的釋放，對奶牛子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng)具有明顯抑制作用。因此，開展健康奶牛生殖道分離乳酸菌的益生特性評價(jià)，對開發(fā)防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有采用益生菌治療牛子宮內(nèi)膜炎的相關(guān)研究報(bào)道。Otero等（2006）從健康奶牛生殖道分離獲得76株乳酸菌，且證實(shí)大部分菌株能抑制奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的生長。McFarland（2014）研究表明，將鼠李糖乳桿菌、乳酸片球菌和羅伊氏乳桿菌按25∶25∶2比例組合后，能明顯降低原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的大腸桿菌感染率，并使IL-8和IL-1β的表達(dá)量分別降低4.7和2.2倍。Liu等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，從健康奶牛生殖道內(nèi)分離獲得的鼠李糖乳桿菌GR-1能改善大腸桿菌誘導(dǎo)破壞的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，限制炎癥反應(yīng)，降低細(xì)胞凋亡概率，即具有預(yù)防奶牛產(chǎn)后子宮疾病的功效。Genís等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌、乳酸片球菌、羅伊氏乳桿菌和薩克乳桿菌均能有效抑制大腸桿菌感染子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，并降低炎性細(xì)胞因子IL-8和IL-1β的表達(dá)，在調(diào)節(jié)奶牛子宮內(nèi)膜炎和炎癥反應(yīng)方面具有巨大潛力。桑夢琪等（2018）研究證實(shí)從健康奶牛子宮頸口分離到的乳酸菌具有良好安全性。關(guān)于乳酸菌對奶牛生殖健康潛在的有益影響，李炳志（2008）從健康奶牛子宮分離乳酸菌并制成發(fā)酵上清液，對21頭患子宮內(nèi)膜炎的奶牛進(jìn)行子宮灌注治療，結(jié)果顯示其有效率為95.23%（20/21），治愈率達(dá)85.71%（18/21）;侯榮倫（2011）研究發(fā)現(xiàn)健康奶牛生殖道內(nèi)的優(yōu)勢菌群為乳酸菌，并分離出4株對金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌具有很強(qiáng)抑制作用的乳酸菌，可作為開發(fā)奶牛生殖道微生態(tài)制劑的潛在菌株;李向楠（2014）從產(chǎn)后30～60 d的健康奶牛子宮頸口分離獲得4株乳酸菌，并證實(shí)其對致病性大腸桿菌具有抑菌作用;Prabhurajeshwar和Chandrakanth（2017）在產(chǎn)后奶牛生殖道內(nèi)投放益生菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能有效調(diào)節(jié)奶牛生殖道菌群平衡，阻止致病性微生物群在生殖道內(nèi)定殖，進(jìn)而有效防止奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生;Peter等（2018）研究發(fā)現(xiàn)布氏乳桿菌能提高患亞臨床奶牛子宮內(nèi)膜炎奶牛受孕率，且能降低子宮內(nèi)膜趨化因子（CXCL1/2、CXCL3和CXC）的表達(dá)量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】乳酸菌代謝產(chǎn)物對多種致病性、產(chǎn)毒性和腐敗性微生物具有抑制作用，且在平衡生殖道和胃腸道菌群紊亂及疾病預(yù)防方面發(fā)揮關(guān)鍵作用（Perczak et al.，2018）?？股氐氖褂秒m然在很大程度上減少了乳房炎及子宮內(nèi)膜炎造成的危害，但同時(shí)誘發(fā)日趨嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問題，因此研發(fā)新型高效的益生菌制劑替代抗生素用于臨床治療已成為趨勢（Francoz et al.，2017）。至今，奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療仍以抗生素為主，尚無用于防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑上市。【擬解決的關(guān)鍵問題】以臨床分離的乳酸菌為研究對象，進(jìn)行抑菌活性、耐藥性、黏附子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞特性及安全性評估，分析其作為益生菌制劑細(xì)菌成分的可能性，為開發(fā)防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所涉及樣品均采集自甘肅省規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場產(chǎn)后40～60 d的健康奶牛;致病性大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphglococcas aureus）和無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所中獸醫(yī)研究室分離保存;原代奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王九峰教授課題組惠贈(zèng);營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MHA瓊脂培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基及牛津杯等購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、辣根過氧化物酶（HRP）購自北京索萊寶科技有限公司;青霉素、氯霉素及苯唑西林等13種藥敏紙片購自O(shè)xoid Limited公司;Gibco胎牛血清和Gibco獸用子宮培養(yǎng)拭子購自古氏貿(mào)易（上海）有限公司;M0401通用細(xì)菌采樣管、0.22 μm細(xì)菌濾器及細(xì)菌DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;16S rDNA PCR試劑盒購自TaKaRa公司。主要儀器設(shè)備：Ettler Toledo便攜式pH計(jì)，麥?zhǔn)媳葷醿x，UV-BlueStar Plus紫外—可見光分光光度計(jì)，LAI-3-T厭氧培養(yǎng)箱，生物安全柜等。

1. 2 樣品采集及乳酸菌分離

從多個(gè)規(guī)?；膛霾杉a(chǎn)后健康奶牛的子宮分泌物。采用直腸把握法觸摸子宮頸和子宮角，以判斷子宮復(fù)舊是否良好，選擇子宮復(fù)舊良好、卵巢無異常的奶牛進(jìn)行采樣。采樣時(shí)以溫水沖洗奶牛外陰，再用75%酒精棉球?qū)ν怅庍M(jìn)行消毒，將獸用培養(yǎng)拭子輕輕插入陰道，右手通過直腸輔助將拭子經(jīng)子宮頸進(jìn)入子宮體內(nèi)，將拭子頭從管體中推出并在子宮內(nèi)輕輕晃動(dòng)，以保證其充分接觸到子宮內(nèi)膜，然后將拭子向后拉入管體，避免污染。取出拭子迅速折斷，將粘有子宮分泌物的脫脂棉部分置于細(xì)菌專用采樣管內(nèi)，冰浴6 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。

1. 3 試驗(yàn)方法

1. 3. 1 乳酸菌分離鑒定 將采集的樣本用無菌棉簽小心涂布于MRS培養(yǎng)基上，在厭氧（氧氣濃度小于1.2%）培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～36 h，將生長良好的典型菌落反復(fù)接種至MRS培養(yǎng)基上，直至菌落形態(tài)一致，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，并提取DNA用于擴(kuò)增16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增引物為5'-GAGCGGATAAC AATTTCACACAGG-3'和5'-CGCCAGGGTTTTCCC AGTCACGAC-3'，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行測序，測序結(jié)果輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

1. 3. 2 微量稀釋法和牛津杯法測試乳酸菌抑菌能力 將分離乳酸菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，厭氧下37 ℃培養(yǎng)24 h后4000 r/min離心20 min，取上清液用細(xì)菌過濾嘴過濾后備用;將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌調(diào)整至0.5麥?zhǔn)辖臃N于MHA藥敏培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基放置3只經(jīng)高壓滅菌的牛津杯，牛津杯中加入乳酸菌培養(yǎng)上清液0.2 mL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后讀取抑菌圈直徑。取無菌96孔板，檢測乳酸菌培養(yǎng)上清液的最小抑菌濃度（MIC）。A1～A12每孔加入0.3 mL乳酸菌培養(yǎng)上清液，其余每孔加入0.1 mL MH肉湯培養(yǎng)基，以排槍從A1～A12每孔吸0.1 mL至B1～B12，混勻后吸0.1 mL至C1～C12，依次進(jìn)行二倍稀釋直至H1～H12。調(diào)整過夜培養(yǎng)的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌濃度，按1%比例接種至96孔板中，最后3列不接種作為空白對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后檢測其抑菌效果。

1. 3. 3 乳酸菌耐藥性及耐藥基因檢測 將過夜培養(yǎng)的分離乳酸菌濃度調(diào)整至0.5麥?zhǔn)?，?.2 mL涂布于MRS培養(yǎng)基上，采用藥敏紙片法測定乳酸菌對13種抗菌藥物的敏感性。采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取乳酸菌基因組DNA，通過PCR檢測氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和磺胺類等抗菌藥物的常見耐藥基因。特異性引物及擴(kuò)增片段大小見表1。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，退火30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1. 3. 4 乳酸菌生長曲線及產(chǎn)酸產(chǎn)H2O2能力測定 將過夜培養(yǎng)的新鮮乳酸菌液按1%比例接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，每隔2 h取樣檢測OD620 nm及培養(yǎng)物上清液pH，繪制乳酸菌的生長曲線和產(chǎn)酸曲線。TMB溶于二甲基亞砜（DMSO）配制TMB溶液（15 mg/mL），HRP溶于無菌水配制HRP溶液（10 mg/mL），將二者加入高壓滅菌的MRS培養(yǎng)基中，最終每個(gè)培養(yǎng)基中含5.0 mg TMB和0.2 mg HRP。然后將植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌接種至MRS培養(yǎng)基上，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于鑒別H2O2。HRP催化H2O2產(chǎn)生O2，而TMB在O2存在的情況下可將菌落染成藍(lán)色（Rodríguez et al.，2011）。即產(chǎn)H2O2的菌落為藍(lán)色，不產(chǎn)H2O2的菌落則不變色。

1. 3. 5 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng) 正常奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞貼壁生長，呈典型的鋪路石狀。復(fù)蘇后無菌條件傳代，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，以PBS洗滌3次，去除細(xì)胞碎片和代謝產(chǎn)物，加入0.5 mL 0.25%胰酶，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5 min，待細(xì)胞變圓潤、細(xì)胞間隙變大，且倒置顯微鏡下觀察有少量圓潤細(xì)胞漂浮時(shí)結(jié)束消化，棄胰酶，加入高糖型DMEM液體培養(yǎng)基，調(diào)整濃度至2.0×105個(gè)/mL，按10%比例加入胎牛血清，吹打成均勻的單個(gè)細(xì)胞后分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶（5 mL/瓶）。

1. 3. 6 乳酸菌黏附子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞試驗(yàn) 新鮮培養(yǎng)的奶牛子宮上皮細(xì)胞以高糖型DMEM液體培養(yǎng)基稀釋至1×105個(gè)/mL，按2.0 mL/孔接種于置有細(xì)胞爬片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h貼壁后備用;過夜培養(yǎng)的乳酸菌以PBS進(jìn)行稀釋，經(jīng)4000 r/min離心洗滌2次后以等體積的高糖型DMEM液體培養(yǎng)基重懸，分別按100∶1、600∶1和1000∶1的比例[細(xì)菌數(shù)（CFU/mL）∶細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mL）]加入6孔培養(yǎng)板中，每個(gè)比例設(shè)3個(gè)重復(fù);然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）中繼續(xù)孵育2 h，棄上清液，用PBS沖洗爬片3次以去除未黏附的乳酸菌;經(jīng)8%甲醛固定后進(jìn)行吉姆薩染色，油鏡下觀察黏附效果，每個(gè)細(xì)胞爬片觀察10個(gè)視野并進(jìn)行乳酸菌黏附計(jì)數(shù)。

黏附率（%）=黏附細(xì)菌數(shù)/初始細(xì)菌數(shù)×100

1. 3. 7 小鼠致病性試驗(yàn) 培養(yǎng)18 h的分離乳酸菌菌液4000 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌3次，然后用PBS調(diào)整濃度至1×109 CFU/mL。將SPF昆明小鼠分成4組，每組5只。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射0.1 mL混合菌液，陽性對照組小鼠腹腔注射0.1 mL大腸桿菌菌懸液（1.0×107CFU/mL），陰性對照組小鼠腹腔注射0.1 mL PBS，空白對照組小鼠不做任何處理。定時(shí)觀察小鼠的精神及行為有無異常，持續(xù)觀察48 h后剖檢觀察其臟器有無病理變化。

2 結(jié)果與分析

2. 1 奶牛生殖道乳酸菌測序結(jié)果

經(jīng)16S rDNA測序分析共獲得8株乳酸菌，經(jīng)BLAST比對分析，確定獲得的8株乳酸菌（圖1）分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（L. paracasei）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、鼠李糖桿菌（L. rhamnosus）、蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）、德氏乳桿菌（L. delbrueckii）、戊糖乳桿菌（L. pentosus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇2株具有良好抑菌活性（植物乳桿菌和副干酪乳桿菌）及1株具有良好黏附性（鼠李糖桿菌）的乳酸菌進(jìn)行后續(xù)研究。

2. 2 奶牛生殖道乳酸菌培養(yǎng)上清液抑菌效果

由圖2可看出，植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌培養(yǎng)上清液對大腸桿菌、無乳鏈球菌及金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出良好的抑制效果。其中，對大腸桿菌的抑菌圈直徑在18～20 mm（圖3）;對無乳鏈球菌的抑菌圈直徑在27～30 mm;對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑在24～28 mm，且鼠李糖桿菌對金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯優(yōu)于植物乳桿菌和副干酪乳桿菌?？傮w來看，以鼠李糖桿菌的抑菌效果最佳。植物乳桿菌培養(yǎng)上清液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的MIC分別為2-3、2-4和2-4;副干酪乳桿菌培養(yǎng)上清液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的MIC分別為2-3、2-3和2-4;鼠李糖桿菌培養(yǎng)上清液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的MIC均為2-4（表2）。

2. 3 奶牛生殖道乳酸菌的生長曲線及產(chǎn)酸產(chǎn)H2O2測定結(jié)果

3株奶牛生殖道乳酸菌均隨生長時(shí)間的推移，其菌體濃度逐漸增加，約在接種3 h后即進(jìn)入典型的指數(shù)生長期，至接種9 h后生長曲線趨于平坦，在接種13～14 h時(shí)達(dá)最大值（圖4）。乳酸菌生長至平臺期后，植物乳桿菌OD620 nm為1.375，鼠李糖桿菌OD620 nm為1.314，副干酪乳桿菌OD620 nm為1.250。

由圖5可看出，3株奶牛生殖道乳酸菌的產(chǎn)酸情況在接種14～16 h時(shí)達(dá)平臺期，但在接種16 h后發(fā)酵液pH還在繼續(xù)降低，直到接種24 h后發(fā)酵液pH才趨于穩(wěn)定，說明植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌在接種16 h后其產(chǎn)酸過程仍在繼續(xù)，并于接種24 h時(shí)達(dá)產(chǎn)酸最大值。其中，副干酪乳桿菌最先到達(dá)穩(wěn)定期且產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，其發(fā)酵液pH達(dá)3.68;植物乳桿菌和鼠李糖桿菌的產(chǎn)酸能力幾乎相同，發(fā)酵結(jié)束后其pH分別為3.80和3.82。此外，植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌在MRS培養(yǎng)基上形成的菌落顏色均無明顯變化，說明不產(chǎn)H2O2。

2. 4 奶牛生殖道乳酸菌的藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測結(jié)果

由表3可知，3株奶牛生殖道乳酸菌對青霉素G、氯霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢唑林和四環(huán)素等7種抗菌藥物高度敏感，說明植物乳桿菌、副干酪乳桿菌與鼠李糖桿菌聯(lián)合使用具有抗菌藥物可控制性。此外，3株奶牛生殖道乳酸菌均對苯唑西林產(chǎn)生抗性（耐藥），植物乳桿菌和副干酪乳桿菌對卡那霉素已產(chǎn)生抗性，植物乳桿菌和鼠李糖桿菌對諾氟沙星已產(chǎn)生抗性。耐藥基因檢測結(jié)果（表4）表明，在3株奶牛生殖道乳酸菌中同時(shí)檢測到磺胺類耐藥基因sul2，在副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌中還同時(shí)檢測到氨基糖苷類耐藥基因aphA-2和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaIMP。

2. 5 奶牛生殖道乳酸菌的黏附上皮細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌通過黏附于腸黏膜、子宮內(nèi)膜或生殖道黏膜形成穩(wěn)定的生物屏障，而抑制病原菌入侵及定殖，因此黏附性是評價(jià)乳酸菌益生特性的重要指標(biāo)之一（佘銀等，2018）。黏附上皮細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，3株奶牛生殖道乳酸菌中只有副干酪乳桿菌能很好地黏附于奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（圖6）。按100∶1、600∶1和1000∶1的比例（副干酪乳桿菌∶奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞）進(jìn)行副干酪乳桿菌黏附奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞試驗(yàn)時(shí)，其對應(yīng)的黏附率分別為6.1%、12.6%和16.5%，表明隨著副干酪乳桿菌濃度的增加，單個(gè)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞黏附的副干酪乳桿菌越來越多，即其黏附效率與副干酪乳桿菌濃度呈正相關(guān)。

2. 6 奶牛生殖道乳酸菌對小鼠致病性的檢測結(jié)果

腹腔注射大腸桿菌菌懸液的陽性對照組小鼠在攻毒后表現(xiàn)為精神沉郁，活動(dòng)減少，至攻毒48 h后有2只小鼠死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)其腹腔有積水，腸道發(fā)生輕度黏連;剖檢未死亡的3只小鼠也發(fā)現(xiàn)其腹腔存在積水。腹腔注射奶牛生殖道乳酸菌混合菌液的試驗(yàn)組小鼠精神狀態(tài)良好，行為無異常，采食飲水均正常，剖檢發(fā)現(xiàn)其腹腔無積水，臟器無移位、無出血癥狀，與空白對照組小鼠相比無明顯差異。

3 討論

目前，微生態(tài)制劑已在人類醫(yī)學(xué)臨床上展開應(yīng)用并取得良好成效（Zhang et al.，2018），但針對畜牧行業(yè)的益生菌應(yīng)用研究很少，尤其在奶牛生殖系統(tǒng)疾病防控方面尚無相關(guān)產(chǎn)品問世。本研究從產(chǎn)后健康奶牛子宮分泌物中分離出8株乳酸菌，最終篩選獲得3株具有益生特性的乳酸菌。乳酸菌通過產(chǎn)生有機(jī)酸、H2O2及細(xì)菌素，而抑制病原菌的入侵和生長，或通過激活機(jī)體腸道的過氧化物酶—硫氰酸鹽反應(yīng)系統(tǒng)，參與腸道抑菌過程（Voltan et al.，2008）。有機(jī)酸（乳酸、乙酸、丙酸、蘋果酸及琥珀酸等）是乳酸菌的主要代謝物質(zhì)之一，也是主要的抑菌成分（Wu and Shah，2017）。Zhao等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌能產(chǎn)生多種有機(jī)酸，其代謝產(chǎn)物不僅能抑制大腸桿菌和炭疽桿菌的生長，還能降低培養(yǎng)基中的膽固醇水平。本研究采用牛津杯抑菌試驗(yàn)檢測奶牛生殖道乳酸菌的抑菌活性，結(jié)果顯示篩選得到的3株奶牛生殖道乳酸菌對3種致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌）均具有良好的抑菌效果，抑菌圈直徑均在18 mm以上。3株奶牛生殖道乳酸菌的產(chǎn)酸能力差異不顯著，但抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示抑菌活性最高的是鼠李糖桿菌，說明有機(jī)酸對抑菌活性并不是起決定性作用，可能還存在其他物質(zhì)具有抑菌活性。朱芬花等（2017）分析了奶牛陰道分離乳酸菌的抑菌活性，但并未分析乳酸菌培養(yǎng)上清液的MIC。本研究在此基礎(chǔ)上，參考96孔板檢測抗菌藥物MIC的方法（Matuschek et al.，2018）檢測3株奶牛生殖道乳酸菌培養(yǎng)上清液的MIC，結(jié)果顯示不同乳酸菌培養(yǎng)上清液對不同致病菌的抑菌效果各不相同，總體上以鼠李糖桿菌的效果最佳。此外，本研究分離獲得的植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌均不具備產(chǎn)生H2O2的能力，因此具體是其培養(yǎng)上清液中的哪種物質(zhì)在發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。

抗菌藥物敏感性是評價(jià)益生菌安全性的重要指標(biāo)之一（Kumar and Kumar，2015;Sgibnev and Krem-leva，2017）。本研究結(jié)果表明，3株奶牛生殖道乳酸菌對青霉素G、氯霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢唑林和四環(huán)素等7種抗菌藥物高度敏感，即對抗菌藥物的敏感性良好。細(xì)菌不能直接利用環(huán)境中的葉酸，而需通過氨苯甲酸、谷氨酸和二氫蝶啶合成葉酸，以滿足自身的生長需求（寇宏等，2018）。磺胺類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸相似，是通過競爭作用抑制細(xì)菌葉酸合成而達(dá)到抑菌目的。sul2、sul3和sull是磺胺類抗菌藥物的耐藥基因（莊林林，2016），本研究從植物乳桿菌中檢測到sul2和sul3基因，從副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌中僅檢測到sul2基因，可能是由于磺胺類藥物的長期大量使用致使不同乳酸菌產(chǎn)生耐藥性。aphA-1、aphA-2和aad-9是氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥基因（Nzila et al.，2000），本研究從副干酪乳桿菌中檢測到aphA-1和aphA-2基因，從鼠李糖桿菌中檢測到aphA-2和aad-9基因;此外，從副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌同時(shí)檢測到β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因blaIMP。綜合3株奶牛生殖道乳酸菌的藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測結(jié)果可知，攜帶耐藥基因的奶牛生殖道乳酸菌并非對相應(yīng)的抗菌藥物完全耐藥，其具體原因還需進(jìn)一步探索?？傮w來看，從奶牛生殖道分離獲得的植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌對大部分抗菌藥物敏感，且在可控范圍之內(nèi)。

黏附性是臨床上篩選益生菌的重要指標(biāo)之一（Klopper et al.，2018），黏附性越強(qiáng)說明益生菌在局部成功定殖的可能性越大（Inturri et al.，2015）。當(dāng)高黏附性的乳酸菌優(yōu)先定殖于奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞時(shí)，可在子宮內(nèi)形成一道安全的物理屏障，即乳酸菌可直接黏附在腸道或生殖道表面并與黏附細(xì)胞進(jìn)行信號交流（Grigoryan et al.，2018），進(jìn)而通過空間位阻效應(yīng)減少病原菌的黏附及分泌抑菌活性分子，以減少病原菌在局部定殖而達(dá)到抑菌目的（白東寧等，2011;任大勇，2013）。乳酸菌黏附子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，副干酪乳桿菌能很好地黏附于奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，且隨副干酪乳桿菌濃度的增加，其黏附效率逐漸升高。此外，小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，以3株奶牛生殖道乳酸菌的混合菌液經(jīng)腹腔注射小鼠后并未引起臟器病變，且對小鼠的行為活動(dòng)、采食飲水亦無明顯影響，說明從奶牛生殖道分離獲得的植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌具有良好安全性，可用于開發(fā)防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑。

4 結(jié)論

從奶牛生殖道分離獲得的植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖桿菌具有安全性、產(chǎn)酸特性、抗菌藥物敏感性及抑菌活性，尤其是副干酪乳桿菌具有良好的黏附性，可作為潛在的益生菌，用于開發(fā)防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）