黃沙鱉β-防御素基因克隆及其表達(dá)分析

許飄尹 楊廷雅 胡大勝 韓書煜 黎姍梅 李明 盛雪晴 梁靜真 黃鈞

摘要：【目的】明確β-防御素在黃沙鱉先天免疫中的潛在作用，為開展黃沙鱉綠色病害防治及促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展打下基礎(chǔ)?！痉椒ā窟\(yùn)用RACE克隆黃沙鱉β-防御素基因（Hs-BD1）cDNA序列，采用SignalP-5.0、PredictProtein、PSIPRED、Robetta和Clustal X等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過實(shí)時熒光定量PCR檢測Hs-BD1基因在黃沙鱉不同組織中的表達(dá)特征及細(xì)菌感染前后的表達(dá)變化?！窘Y(jié)果】Hs-BD1基因cDNA序列全長493 bp，包括72 bp的5'非編碼區(qū)（5'-UTR）、201 bp的開放閱讀框（ORF）及220 bp的3'非編碼區(qū)（3'-UTR）。Hs-BD1基因編碼66個氨基酸殘基，包括22個氨基酸殘基組成的信號肽區(qū)、3個氨基酸殘基組成的前肽區(qū)和41個氨基酸組成的成熟肽區(qū)。其中，成熟肽區(qū)具有6個保守的半胱氨酸殘基（31Cys、58Cys、38Cys、52Cys、42Cys和59Cys）及位于C1和C2間的甘氨酸殘基（Gly），即Hs-BD1基因?qū)儆讦?防御素家族。Hs-BD1氨基酸序列與中華鱉β-防御素16的相似性最高（93.9%），基于β-防御素序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示黃沙鱉與中華鱉和西部錦龜聚為一支，其親緣關(guān)系相對較近。6個保守的半胱氨酸殘基分別以C1-C5、C2-C4和C3-C6的連接方式形成3個二硫鍵;Hs-BD1成熟蛋白三級結(jié)構(gòu)是由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成。Hs-BD1基因在黃沙鱉肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的相對表達(dá)量較高，在心臟、腸道、肌肉、腦組織和表皮中的相對表達(dá)量均較低;以溫和氣單胞菌攻毒后，Hs-BD1基因在黃沙鱉脾臟中的相對表達(dá)量呈上升—下降—上升—下降的變化趨勢，在攻毒后第3和36 h共出現(xiàn)2個表達(dá)峰值，對應(yīng)的相對表達(dá)量分別是攻毒前（0 h）的20.8和10.6倍，差異均極顯著（P<0.01）。【結(jié)論】Hs-BD1基因在黃沙鱉的多個組織中均有表達(dá)，尤其在肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的相對表達(dá)量較高，且可被溫和氣單胞菌感染誘導(dǎo)表達(dá)，說明Hs-BD1基因在黃沙鱉抵抗病原感染的過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 黃沙鱉;β-防御素;溫和氣單胞菌;Hs-BD1基因;表達(dá)特征

中圖分類號： S947.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2269-09

Cloning and expression analysis of β-defensin gene of

Huangsha turtle

XU Piao-yin1， YANG Ting-ya1， HU Da-sheng2， HAN Shu-yu2， LI Shan-mei2， LI Ming3， SHENG Xue-qing1， LIANG Jing-zhen1*， HUANG Jun1*

（1Institute of Animal Science and Technology， Guangxi University/Guangxi Aquatic Animal Disease Diagnostic Laboratory， Nanning 530005， China; 2Guangxi General Station of Aquaculture Technology Extension，? Nanning 530022， China; 3Yuzhou Station of Aquaculture Technology Extension， Yulin， Guangxi 537000， China）

Abstract：【Objective】This study aimed to clarify the mechanism of β-defensin and its potential role in the innate immu-nity of Huangsha turtle， and lay a foundation for carrying out the green disease prevention and control of Huangsha turtle and promoting the healthy development of its breeding industry. 【Method】The cDNA sequence of β-defensin gene， Hs-BD1 in Huangsha turtle was cloned by RACE method， and the bioinformatics analysis was conducted by the online softwares including SignalP-5.0， Predictprotein， PSIPRED， Robetta and Clustal X. The expression patterns in various tissues of Huangsha turtle and the ones after bacterial challenge of Hs-BD1 gene were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The cDNA sequence of Hs-BD1 gene was 493 bp in length， including a 5' untranslated region（UTR） of 72 bp， an open reading frame（ORF） of 201 bp and a 3'UTR of 220 bp. The Hs-BD1 gene coded 66 amino acids（aa） containing the signal peptide region of 22 aa， the propeptide region of 3 aa and the mature peptide region of 41 aa. The mature peptide had six conserved cysteine（Cys） residues（31Cys， 58Cys， 38Cys， 52Cys， 42Cys and 59Cys） and the conserved glycine（Gly） residue between C1 and C2， indicating that the amino acid sequence of Hs-BD1 gene belonged to the β-defensin family. The amino acid sequence of Hs-BD1 shared the highest similarity（93.9%） with Ps-BD16 from Pelodiscus sinensis， and the phylogenetic tree based on the similarity of amino acid sequences of β-defensin amino acid also showed that Huangsha turtle，P. sinensis and Chrysemys picta bellii clustered in a clade and their genetic relationships were relatively close. Six conserved cysteine residues formed three disulfide bonds by the conjunction type of C1-C5， C2-C4 and C3-C6. The tertiary structure of mature protein of Hs-BD1 was composed of α-helix， β-sheet and random coil. The expression levels of Hs-BD1 gene in the liver， spleen， lung and kidney were relatively high and the expression levels were relatively low in the heart， intestine， muscle， brain and skin. The relative expression levels of Hs-BD1 in the spleen showed an upward-downward-upward-downward trend post injection of Aeromonas sobria. There were two peak values（at 3 and 36 h post injection） in the relative expression levels of Hs-BD1， which were as 20.8 times and 10.6 times comparing to the expression level before infection（at 0 h） respectively，whose differences were extremely significant（P<0.01）. 【Conclusion】The Hs-BD1 gene is expressed in many tissues and the relative expression levels are especially high in liver， spleen， lung and kidney. Expression of Hs-BD1 gene can be induced by the bacterial challenge of A. sobria， indicating that Hs-BD1 may play a regulating role in counteracting the pathogenic infection of Huangsha turtle.

Key words： Huangsha turtle; β-defensin; Aeromonas sobria; Hs-BD1 gene; expression pattern

Foundation item： Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFAA138167）; Aquaculture Disease Measuring and Reporting Project of Guangxi Agricultural and Rural Department（Guicaiyuhan〔2019〕105）

0 引言

【研究意義】黃沙鱉是中華鱉（Pelodiscus sinensis）的地理種群（黃雪貞等，2012;馬沙等，2019），原產(chǎn)于我國兩廣地區(qū)的西江流域。黃沙鱉裙邊肥厚、味道鮮美（李登明等，2013），維生素和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)含量均高于中華鱉（賴春華等，2011），且生長速度快、產(chǎn)量高，其養(yǎng)殖業(yè)市場前景廣闊，經(jīng)濟(jì)效益突出。但近年來，在高密度飼養(yǎng)條件下黃沙鱉疾病尤其是細(xì)菌性疾病常暴發(fā)流行，致使亂用濫用抗生素現(xiàn)象普遍存在，進(jìn)而引發(fā)病原微生物耐藥性增強(qiáng)及食品安全隱患等一系列問題（黃艷華等，2013;羅華平等，2013;劉杰等，2015）?？咕淖鳛閯游锵忍烀庖叩牡谝坏婪谰€，在保護(hù)機(jī)體和抵抗病原微生物入侵的過程中發(fā)揮重要作用（van Hoek，2014;王婧等，2018），是近年來重點(diǎn)推廣應(yīng)用的新型飼料添加劑，易被養(yǎng)殖動物降解，且無殘留物質(zhì)，對環(huán)境無任何污染（覃志彪等，2016）。因此，研究黃沙鱉免疫機(jī)制及開發(fā)可替代抗生素的抗菌肽等無公害藥物是確保黃沙鱉養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】抗菌肽是一類由少于100個氨基酸殘基組成且具有廣譜抗微生物活性的短肽，是生物體先天防御系統(tǒng)的重要組成部分（Koehbach and Craik，2019）。防御素是一種分子量在3～4 kD的陽離子抗菌肽，其典型特征是具有6個保守的半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵以穩(wěn)定分子構(gòu)象（van Hoek，2014）。防御素的抗菌機(jī)制主要是富含正電荷和疏水片段，易聚集在帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞表面，使微生物細(xì)胞膜雙層分子結(jié)構(gòu)受損乃至細(xì)胞死亡（Donnarumma et al.，2015）。根據(jù)生物種類來源、蛋白結(jié)構(gòu)及二硫鍵連接方式的不同，可將防御素劃分為植物防御素、昆蟲防御素、α-防御素、β-防御素和θ-防御素等。其中，β-防御素是動物防御素家族的最主要成員（Suarez-Carmona et al.，2014）。相對于高等脊椎動物，龜鱉類β-防御素的研究起步較晚。自Stegemann等（2009）首次從歐洲池塘龜（Emys orbicularis）分離鑒定出β-防御素以來，迄今僅在刺鱉（Apalone spinifera）（Benato et al.，2013）、紅耳滑龜（Trachemys scripta）（Kaplinsky et al.，2013）、西部錦龜（Chrysemys picta bellii）（van Hoek，2014）及中華鱉（Yu et al.，2017）等龜鱉上開展β-防御素鑒定或抗菌作用等相關(guān)研究。Stegemann等（2009）研究表明，歐洲池塘龜β-防御素TBD-1對單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有較強(qiáng)的抑菌效果;Benato等（2013）研究證實(shí)刺鱉的幾種β-防御素（As-BDs）可能參與其皮膚免疫防御作用;Yu等（2017）研究發(fā)現(xiàn)中華鱉β-防御素重組蛋白rPs-BD2具有較強(qiáng)的抗微生物活性，但對人類紅細(xì)胞的溶血性和對鼠源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性均較弱?？梢姡旝M類β-防御素均具有一定的抗菌作用或參與機(jī)體的先天免疫反應(yīng)，將其作為抗菌藥物在新型飼料添加劑的開發(fā)上具有極高應(yīng)用價值?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】β-防御素在哺乳動物、爬行動物、禽類及魚類等物種中均有分布，具有抗微生物活性和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能（Khurshid et al.，2018）。至今，雖有關(guān)于中華鱉β-防御素基因（Yu et al.，2017）的研究報道，但針對黃沙鱉β-防御素基因（Hs-BD1）克隆及其功能的研究尚無相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過克隆Hs-BD1基因并檢測其在黃沙鱉不同組織中的表達(dá)特征及細(xì)菌感染前后的表達(dá)變化，探究β-防御素在黃沙鱉先天免疫中的潛在作用，為開展黃沙鱉綠色病害防治及促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

健康黃沙鱉購自廣西來賓市武宣縣某養(yǎng)鱉合作社，體質(zhì)量45～60 g/只。經(jīng)1個月檢疫飼養(yǎng)觀察及隨機(jī)抽樣檢測，確定黃沙鱉無異常后用于人工感染試驗(yàn)。溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）WMG2株為廣西水生動物病害診斷實(shí)驗(yàn)室于2015年從廣西南寧市患病黃沙鱉中分離獲得，人工感染試驗(yàn)前再次對其進(jìn)行鑒定驗(yàn)證。TRIzol試劑和2×RealStar Green Fast Mixture試劑購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司;DL1000 DNA Marker、2×Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體克隆試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒及SMARTer RACE 5'/3' Kit試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;LB瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。所有擴(kuò)增引物均委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

1. 2 RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol法提取總RNA，以微量分光光度計OD-1000（One Drop公司）測量總RNA的純度和濃度，若總RNA符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)則置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，或使用SMARTer RACE 5'/3' Kit試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；蚪M織分布檢測則使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 3 引物設(shè)計及基因克隆

參考NCBI上已公布的相近物種及中華鱉β-防御素基因序列（Yu et al.，2017），設(shè)計3'末端序列的擴(kuò)增引物BD-F1和BD-F2（表1）。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用SMARTer RACE 5'/3' Kit試劑盒對Hs-BD1基因3'末端序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照Taq DNA聚合酶（TaKaRa）說明進(jìn)行操作，獲得的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)切膠回收后與pMD18-T連接，再以重組載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)驗(yàn)證后將陽性菌液送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

根據(jù)擴(kuò)增獲得的Hs-BD1基因3'末端序列，設(shè)計特異性引物BD-R1和BD-R2（表1），采用SMARTer RACE 5'/3' Kit試劑盒擴(kuò)增Hs-BD1基因5'末端序列。獲得的PCR擴(kuò)增片段經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后測序，將測序得到的各片段拼接成完整cDNA序列。利用DNASTAR查找開放閱讀框（ORF），并以BD-ORF-F和BD-ORF-R（表1）為引物對Hs-BD1基因ORF進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1. 4 Hs-BD1基因在黃沙鱉不同組織中的表達(dá)分析

隨機(jī)剖檢3只健康黃沙鱉，取其心臟、肝臟、腎臟、脾臟及腦組織等9種組織樣品放入TRIzol試劑中進(jìn)行勻漿。提取各組織樣品的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以Hs-BD1基因序列為依據(jù)設(shè)計實(shí)時熒光定量PCR引物BD-qPCR-F和BD-qPCR-R，同時參照馬沙等（2019）的方法設(shè)計18S rRNA內(nèi)參基因引物18S-F和18S-R（表1）。將各組織cDNA模板進(jìn)行5倍稀釋，每個cDNA模板設(shè)3個重復(fù)，按照相關(guān)試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，并繪制Hs-BD1基因和18S rRNA內(nèi)參基因的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，以證實(shí)2對引物的擴(kuò)增效率基本一致（E>93%，R2>0.991）。通過實(shí)時熒光定量PCR分析Hs-BD1基因在黃沙鱉各組織中的表達(dá)特征，并采用2-△△Ct法計算Hs-BD1基因相對表達(dá)量。設(shè)表皮組織中的Hs-BD1基因相對表達(dá)量為1，采用SPSS 18.0中的Duncan?s新復(fù)極差法對Hs-BD1基因的組織表達(dá)特征進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1. 5 Hs-BD1基因在黃沙鱉感染細(xì)菌前后的表達(dá)變化

參照馬沙等（2019）的方法，將溫和氣單胞菌WMG2株劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)30 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，采用接種環(huán)挑取適量菌落，以無菌生理鹽水配制成106 CFU/mL的菌懸液。設(shè)攻毒組和對照組，攻毒組黃沙鱉經(jīng)腹腔注射配制好的菌懸液（0.2 mL/只），對照組注射等量生理鹽水。攻毒后將2組黃沙鱉置于不同養(yǎng)殖箱中進(jìn)行正常養(yǎng)殖和觀察，分別在攻毒前（0 h）和攻毒后不同時間點(diǎn)（3、6、12、24、36、48和72 h），從2組黃沙鱉中各隨機(jī)挑取3只進(jìn)行解剖，取其脾臟組織提取總RNA。參照1.4的方法，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測攻毒前后Hs-BD1基因的相對表達(dá)量，并采用 t 檢驗(yàn)對攻毒前后Hs-BD1基因表達(dá)變化進(jìn)行顯著性分析。

1. 6 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用DTU Health Tech網(wǎng)站的SignalP-5.0服務(wù)器進(jìn)行Hs-BD1蛋白信號肽預(yù)測，以PredictProtein分析其二硫鍵組成方式;分別采用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和Robetta（http：//robetta.baker-lab.org/）預(yù)測Hs-BD1蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)，并使用Pymol對預(yù)測獲得的三級結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行顯示;采用Clustal X和MEGA 5.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，同時以DNAMAN 6.0進(jìn)行氨基酸序列比對分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 Hs-BD1基因克隆及序列分析結(jié)果

Hs-BD1基因cDNA序列全長493 bp，包括72 bp的5'非編碼區(qū)（5'-UTR）、201 bp的ORF（圖1）及220 bp的3'非編碼區(qū)（3'-UTR）。Hs-BD1基因cDNA序列信息完整（圖2），具有起始密碼子ATG、終止密碼子TGA、1個多聚腺苷酸化信號AATAAA和1個包含19個腺苷酸的poly（A）尾。

Hs-BD1基因編碼66個氨基酸殘基，包括22個氨基酸殘基組成的信號肽區(qū)、3個氨基酸殘基組成的前肽區(qū)和41個氨基酸殘基組成的成熟肽區(qū)（圖2）。成熟肽區(qū)具有11個帶正電荷的氨基酸殘基[10個精氨酸（R）和1個賴氨酸（K）]及2個帶負(fù)電荷的氨基酸殘基[1個天冬氨酸（D）和1個谷氨酸（E）]，預(yù)測其分子量為4895.75 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為10.099。

2. 2 Hs-BD1氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

由圖3可看出，Hs-BD1氨基酸序列（序列8）與其他物種的β-防御素序列相似，均具有6個保守的半胱氨酸殘基（C）及位于C1和C2間的甘氨酸殘基（G），即Hs-BD1基因?qū)儆讦?防御素家族。其中，Hs-BD1氨基酸序列與中華鱉β-防御素16（序列7）最接近，均形成特有保守結(jié)構(gòu)C-X6-C-X3-C-X9-C-X4-CC-X5。氨基酸序列相似性分析結(jié)果表明，Hs-BD1氨基酸序列與中華鱉β-防御素16的相似性最高，達(dá)93.9%;與西部錦龜β-防御素5、原雞β-防御素8、日本鵪鶉β-防御素8、綿羊β-防御素、人類β-防御素1、普洱樹蛙β-防御素、大猩猩β-防御素1、斑馬魚β-防御素3、福鼎蠑螈β-防御素1和鯉魚β-防御素3的相似性依次為57.8%、40.9%、40.9%、29.7%、22.7%、22.7%、21.2%、21.2%、17.6%和15.2%。從基于β-防御素氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）也可看出，黃沙鱉與中華鱉和西部錦龜聚為一支，其親緣關(guān)系相對較近，而與魚類和兩棲類的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2. 3 Hs-BD1蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

PSIPRED預(yù)測結(jié)果（圖5）表明，Hs-BD1前體蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)組成，其所占比例分別為33.33%、24.24%和42.42%。其中，α-螺旋主要分布于多肽鏈的氨基端（N端），β-折疊則主要位于多肽鏈的羧基端（C端）。去除信號肽和前肽后，進(jìn)行Hs-BD1成熟蛋白三級結(jié)構(gòu)建模，也發(fā)現(xiàn)Hs-BD1成熟蛋白三級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲（圖6）。其中，α-螺旋由第27～34位氨基酸殘基組成，而3個β-折疊分別由第37～39位、第47～52位和55～60位氨基酸殘基組成。與Hs-BD1前體蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相比，除第37～39位氨基酸殘基在二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中無規(guī)則卷曲外，其他結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果基本一致。在6個保守的半胱氨酸殘基（Cys）中，31Cys和58Cys、38Cys和52Cys、42Cys和59Cys間分別形成3對二硫鍵，其連接方式為C1-C5、C2-C4和C3-C6，進(jìn)一步證實(shí)克隆獲得的Hs-BD1基因?qū)儆讦?防御素家族。

2. 4 Hs-BD1基因在黃沙鱉不同組織中的表達(dá)特征

實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，Hs-BD1基因在健康黃沙鱉不同組織中存在表達(dá)差異性（圖7）。其中，Hs-BD1基因在肝臟中的相對表達(dá)量最高（20.7倍），顯著高于在其他組織中的相對表達(dá)量（P<0.05，下同）;其次是在脾臟（14.7倍）、肺臟（14.0倍）和腎臟（4.9倍）中的相對表達(dá)量，在這3個組織中的相對表達(dá)量顯著高于在表皮、心臟、腦組織、腸道和肌肉中的相對表達(dá)量;Hs-BD1基因在表皮、心臟、腦組織、腸道和肌肉中的相對表達(dá)量均較低。

2. 5 攻毒前后Hs-BD1基因在黃沙鱉脾臟中的表達(dá)變化

通過實(shí)時熒光定量PCR檢測溫和氣單胞菌WMG2株攻毒前后Hs-BD1基因在黃沙鱉脾臟中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對照組Hs-BD1基因在不同時間點(diǎn)的相對表達(dá)量與攻毒前（0 h）相比均無顯著差異（P>0.05，下同）;在攻毒后不同時間點(diǎn)Hs-BD1基因相對表達(dá)量呈上升—下降—上升—下降的波動變化趨勢（圖8）。在攻毒后第3 h達(dá)峰值，其相對表達(dá)量為攻毒前的20.8倍，差異極顯著（P<0.01，下同）;至攻毒后第36 h出現(xiàn)第2個峰值，其相對表達(dá)量為攻毒前的10.6倍，差異也達(dá)極顯著水平;但Hs-BD1基因在其余時間點(diǎn)的相對表達(dá)量與攻毒前的相對表達(dá)量均無顯著差異。

3 討論

β-防御素不易產(chǎn)生耐藥性，且對動物細(xì)胞攻擊性比較小（Ganz，2002;劉海燕等，2005）。本研究成功克隆獲得Hs-BD1基因，經(jīng)氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)Hs-BD1氨基酸序列與中華鱉β-防御素16的相似性最高（93.9%），而與哺乳動物、禽類、兩棲動物和魚類等物種的相似性均較低。已有研究表明，為了抵抗病原微生物侵染，β-防御素基因可能發(fā)生有利于自身的突變，導(dǎo)致其在各物種間的相似性較低（符梅，2013）。因此，黃沙鱉與其他物種間的β-防御素氨基酸序列相似性可能與不同物種在長期進(jìn)化過程中所感染的病原不同有關(guān)。此外，β-防御素多肽鏈中凈正電荷數(shù)量越多，其抗菌活性越強(qiáng)（Landon et al.，2008;Taylor et al.，2008），對鹽離子耐受能力也越強(qiáng)（王少然等，2011）。本研究結(jié)果表明，Hs-BD1成熟肽具有11個帶正電荷的氨基酸殘基，富含正電荷的Hs-BD1成熟肽可吸附在帶負(fù)電荷的病原菌磷脂膜表面，而引起細(xì)胞膜破損（Lee et al.，2016）。Hs-BD1成熟肽C端包含6個半胱氨酸殘基并形成3對二硫鍵，與已報道的其他物種β-防御素結(jié)構(gòu)（van Hoek，2014;Yu et al.，2017）一致，可能與穩(wěn)定空間構(gòu)象及防止被蛋白酶水解有關(guān)（Yang et al.，2016）。Hs-BD1成熟蛋白結(jié)構(gòu)包含α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲，其中，α-螺旋可幫助β-防御素分子錨定于病原菌細(xì)胞膜上（Chandrababu et al.，2009）;β-折疊能促使β-防御素小分子緊密聚集并形成較牢固的化學(xué)結(jié)構(gòu)，同時使其生物學(xué)活性更穩(wěn)定（Lehrer，2004;田巧珍等，2017）。綜上所述，Hs-BD1成熟肽可能是一種抗菌活性較強(qiáng)、結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定的抗菌肽。

不同物種β-防御素基因在其組織中的表達(dá)分布具有差異性。鴨Av-BD9基因在消化、呼吸、免疫及循環(huán)系統(tǒng)中均有表達(dá)，以在肝臟和腎臟中的表達(dá)量較高，而在皮膚、腺胃和肌胃中無表達(dá)（廖文艷等，2009）;團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）Ma-BD1基因在肝臟、脾臟和頭腎中的表達(dá)量相對較高，而在體腎、腸道和鰓組織中的表達(dá)量相對較低，在血液中無表達(dá)量（張涓等，2015）;馬鹿（Cervus elaphus）redBD-1基因在被檢組織中均有表達(dá)，以在消化、呼吸和生殖系統(tǒng)大部分組織中的表達(dá)量較高，而在肝臟、脾臟和腎臟等實(shí)質(zhì)器官中的表達(dá)量較低（田巧珍等，2017）;中華鱉Ps-BDs基因在與環(huán)境直接接觸的組織（皮膚、肺臟和胃）或與免疫系統(tǒng)相關(guān)的組織（肝臟、腎臟和腸道）中高表達(dá)（Yu et al.，2017）?？梢?，β-防御素基因表達(dá)模式存在物種特異性和組織特異性。β-防御素基因在不同組織中的表達(dá)差異預(yù)示著其可能具有不同生物學(xué)功能（張涓等，2015）。本研究結(jié)果表明，Hs-BD1基因在黃沙鱉免疫器官肝臟、脾臟和腎臟及呼吸器官肺臟中的表達(dá)量相對較高，說明Hs-BD1可能在保護(hù)機(jī)體和抵抗病原微生物入侵的過程中發(fā)揮重要作用。

高密度養(yǎng)殖環(huán)境極易誘發(fā)黃沙鱉的各種傳染性疾病暴發(fā)流行，且黃沙鱉具有相互撕咬的習(xí)性，更易導(dǎo)致病原菌從傷口入侵、經(jīng)血液和淋巴循環(huán)感染全身而發(fā)病。為了解黃沙鱉在感染狀態(tài)下Hs-BD1基因的表達(dá)情況，本研究采用實(shí)時熒光定量PCR檢測溫和氣單胞菌感染前后Hs-BD1基因在黃沙鱉脾臟中的表達(dá)變化，結(jié)果表明，在溫和氣單胞菌感染后第3和36 h，Hs-BD1基因的相對表達(dá)量顯著上升，說明黃沙鱉在受到病原侵染時可誘導(dǎo)HsBD-1基因上調(diào)表達(dá)，而參與機(jī)體的抗感染應(yīng)激。在哺乳動物中，當(dāng)機(jī)體受到病原侵染時，Toll樣受體可識別病原并活化，而后通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)β-防御素基因表達(dá)（Omagari et al.，2011）。至今，有關(guān)龜鱉類β-防御素的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚無文獻(xiàn)報道，Hs-BD1基因是否通過Toll樣受體依賴型的信號通路誘導(dǎo)分泌仍需進(jìn)一步探究。此外，在溫和氣單胞菌感染后Hs-BD1基因相對表達(dá)量呈上升—下降—上升—下降的波動變化趨勢，與華貴櫛孔扇貝（Chlamys nobilis）和三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）的防御素基因在細(xì)菌感染后的表達(dá)變化趨勢（Wang et al.，2014;Yang et al.，2016）相似。究其原因可能是：（1）Hs-BD1基因在攻毒后出現(xiàn)2個表達(dá)峰值是由不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)而形成;（2）機(jī)體細(xì)胞存在某種負(fù)反饋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制以保護(hù)其免受高濃度β-防御素的損害（馬沙等，2019）。溫和氣單胞菌感染可誘導(dǎo)Hs-BD1基因表達(dá)，即Hs-BD1基因可能在黃沙鱉抗病原感染的過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)Hs-BD1基因在攻毒前后的表達(dá)變化特點(diǎn)，當(dāng)β-防御素應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)時，其使用劑量應(yīng)控制在安全范圍內(nèi)，以避免濃度過高而對機(jī)體產(chǎn)生毒性作用（姜珊等，2011）。

4 結(jié)論

Hs-BD1基因在黃沙鱉的多個組織中均有表達(dá)，尤其在肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的相對表達(dá)量較高，且可被溫和氣單胞菌感染誘導(dǎo)表達(dá)，說明Hs-BD1基因在黃沙鱉抵抗病原感染的過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）