基于宏基因組測序的扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌多樣性研究

鐘 勇，馬福歡，藍翊文，何成偉，白華菊

1憑祥海關(guān)，廣西 憑祥 532600；2友誼關(guān)海關(guān)，廣西 憑祥 532600

胸喙亞目昆蟲(包括粉蚧、其他蚧蟲、蚜蟲、木虱和粉虱)以植物汁液為食，植物汁液營養(yǎng)上極不平衡，雖然富含主要以蔗糖存在的碳水化合物，但脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量非常少，因此，它們均需內(nèi)共生菌提供必需氨基酸和其他營養(yǎng)物質(zhì)來保證正常的生長發(fā)育(Baumannetal.,2000; Moran & Telang,1998；Munsonetal.,1992)。研究發(fā)現(xiàn)，粉蚧體內(nèi)含有初生內(nèi)共生菌(Fukatsu & Nikoh,2000; Moran & Telang,1998；Munsonetal.,1992)和次生內(nèi)共生菌(Kanthetietal.,1996；von Dohlenetal.,2001)。在研究昆蟲內(nèi)共生菌的功能及其與宿主間的相互關(guān)系時，傳統(tǒng)的方法是通過去除內(nèi)共生菌或者利用營養(yǎng)缺失實驗來觀察宿主生理生化的變化。然而，內(nèi)共生菌不能體外培養(yǎng)，這阻礙了進一步深入了解共生菌在宿主體內(nèi)所起的作用(楊義婷等，2014)。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展和測序技術(shù)的進步，轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、基因組學等技術(shù)的發(fā)展，為昆蟲內(nèi)共生菌研究提供了便利；最新的基因組學工具，特別是新一代高通量測序工具和分析軟件，使得內(nèi)共生菌的大規(guī)模宏基因組測序和價格低廉的單個菌基因組測序成為可能，為明確共生菌功能提供了直接證據(jù)，同時也促使從種群和群落水平研究細菌、真菌等與昆蟲宿主共生關(guān)系成為可能，而這些都將為最終發(fā)現(xiàn)共生菌與宿主共生關(guān)系的潛在機制奠定基礎。

扶桑綿粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsley隸屬半翅目Hemiptera蚧總科Coccoidea粉蚧科Pseudococcidae綿粉蚧亞科Phenacoccinae綿粉蚧屬Phenacoccus，是一種重要的入侵害蟲，為害棉花GossypiumhirsutumL.和其他重要作物，現(xiàn)已幾乎遍布全球(Fuchsetal.，1991；Wang & Yang,2010)。目前，國內(nèi)外對其研究多集中在生物學特性方面，內(nèi)共生菌的研究相對較少(黃芳等，2015)。這些報道中，如扶桑綿粉蚧入侵后寄主范圍不斷擴大(陳哲等，2012)、出現(xiàn)體色變異型種群(朱藝勇等，2011；Zhaoetal.,2014)等可能均有內(nèi)共生菌參與。同時，不同的研究對扶桑綿粉蚧繁殖方式的報道有較大差異(關(guān)鑫等，2011；唐遠等，2013; Hodgsonetal.,2008；Huangetal.,2013；Vennilaetal.,2010)，其原因可能是不同種群內(nèi)共生菌感染情況不同，尤其是與生殖有關(guān)的內(nèi)共生菌的感染情況。因此，扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌多樣性的研究，將為共生菌與粉蚧的相互作用研究提供基礎，也為研究扶桑綿粉蚧的入侵機制提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

扶桑綿粉蚧為國家熱帶和亞熱帶水果檢疫重點實驗室(憑祥)使用南瓜Cucurbitamoschata(Duch.ex Lam.)Duch.ex Poiret飼養(yǎng)的室內(nèi)種群，原寄主為木槿HibiscusrosasinensisL.(廣西憑祥)。

1.2 高通量測序

收集試蟲，分為2個重復，每重復雌成蟲30頭；委托深圳華大基因股份有限公司對整蟲樣本開展微生物宏基因組測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)處理

原始測序數(shù)據(jù)6.28×109reads。過濾掉低質(zhì)量序列、接頭序列等雜質(zhì)，從而得到6.12×109的高質(zhì)量Clean Data。組裝過濾后的reads，以得到更長的contig。然后將reads分別比對回每個組裝結(jié)果以評估組裝效果，最后綜合考慮N50和比對率情況，選擇一個最佳k-mer和其對應的組裝結(jié)果。最終組裝獲得1.60×105contigs，組裝長度2.56×108bp，最大contig長度89956 bp，最小contig長度300 bp，組裝平均長度1600 bp，reads利用率68.32%。

1.4 內(nèi)共生菌豐度分析

使用MEGAN(version 4.6)對nr比對結(jié)果進行處理。MEGAN根據(jù)LCA算法對BLAST比對結(jié)果根據(jù)NCBI物種分類樹進行重新梳理，從而得到每條序列的物種注釋信息。將同一物種注釋的基因豐度累加，得到該物種在樣品中的物種豐度。

1.5 內(nèi)共生菌基因分析

對每個樣品使用MetaGeneMark進行基因預測，構(gòu)建高質(zhì)量基因集，將reads比對到高質(zhì)量基因集計算基因豐度。對KEGG(89.1)、COG等數(shù)據(jù)庫的分析，先將基因注釋到此類數(shù)據(jù)庫?；赗eads與基因集的比對結(jié)果,獲取該類功能數(shù)據(jù)庫的定量(豐度)和定性(基因個數(shù))信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌種類及其豐度

根據(jù)注釋結(jié)果，樣本共鑒定獲得29個門，47個綱，105個目，178個科，245個屬，299個種。在界分類水平上，扶桑綿粉蚧內(nèi)共生物測序共注釋了古細菌Archaea、細菌Bacteria、真核生物Eukaryota和病毒Viruses；細菌為優(yōu)勢種群，相對豐度達85.16%。在門分類水平上，共注釋了子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、Candidatus Magasanikbacteria等29個門；其中變形菌門Proteobacteria為優(yōu)勢種群(相對豐度81.36%)。在綱分類水平上，共注釋了α-變形菌綱Alphaproteobacteria、β-變形菌綱Betaproteobacteria、衣原體綱Chlamydiia等47個綱；γ-變形菌綱和β-變形菌綱為優(yōu)勢種群，相對豐度遠超其他種群(分別為50.04%和27.68%)。在目分類水平上，共注釋了交替單孢菌目Alteromonadales、伯克氏菌目Burkholderiales、彎曲菌目Campylobacterales等105個目；腸桿菌目Enterobacterales為優(yōu)勢種群(相對豐度42.65%)。在科分類水平上，共注釋了酸桿菌科Acetobacteraceae、芽孢桿菌科Bacillaceae、彎曲菌科Campylobacteraceae、Debaryomycetaceae等178個科；腸桿菌科Enterobacteriaceae為優(yōu)勢種群(相對豐度33.48%)。在屬分類水平上，共注釋了醋酸桿菌屬Acetobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、Caballeronia等245個屬；伯克氏菌屬Burkholderia為優(yōu)勢種群(相對豐度13.12%)；CandidatusTremblaya相對豐度3.69%排名第二。在種分類水平上，共注釋了Acetobactermalorum、脆弱類桿菌屬Bacteroidesfragilis、Caballeroniagrimmiae等299個種；相對豐度為2.58%的CandidatusTremblayaphenacola為優(yōu)勢種群(表1)。

表1 扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌豐度(前10)

2.2 扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌基因分析

樣本所測序列共預測了36505個基因，其中77.27%的基因分布在200～499 nt的范圍內(nèi)(圖1)?；蚣疜EGG注釋了776個基因，其中代謝相關(guān)基因最多(384個)，占49.48%；其次為遺傳信息處理基因(207個)，占26.68%；最少的為環(huán)境信息處理基因(8個)，僅占1.03%。代謝相關(guān)基因除了綜合性代謝全譜基因(157個)外，最多的為氨基酸代謝基因(64個)，其次為碳水化合物代謝基因(36個)、輔酶和維生素代謝基因(35個)(圖2)，分別占28.19%、15.86%和15.42%?；蚣疌OG注釋了398個基因，其中翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生的基因最多(110個)，占27.64%；其次為氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝基因(49個)(圖3)，占12.31%。

圖1 扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌基因長度分布圖

圖2 扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌KEGG通道注釋圖

圖3 扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌COG通道注釋圖

3 討論

本研究采用宏基因組測序技術(shù)對扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成進行了研究。其中，變形菌門、γ和β變形菌，以及β-變形菌的CandidatusTremblaya是其優(yōu)勢種群，該結(jié)果與其他昆蟲的報道相似(毛迎新等，2018；Konoetal.,2008；McCutcheon & von Dohlen，2011；Sergioetal.,2015)。

很多變形菌門細菌與營養(yǎng)代謝相關(guān)，這些種群豐度占優(yōu)勢的內(nèi)共生菌很可能在扶桑綿粉蚧的營養(yǎng)代謝中起很大作用。CandidatusTremblaya是一種與綿粉蚧亞科和粉蚧亞科有共生關(guān)系的內(nèi)共生菌，且多數(shù)綿粉蚧亞科粉蚧具有獨特的內(nèi)共生菌嵌套體CandidatusTremblayaphenacola(Sergioetal.,2015)。實驗結(jié)果證明,在扶桑綿粉蚧體內(nèi)，CandidatusTremblayaphenacola是種的分類水平的優(yōu)勢種群。此外，同屬的CandidatusBaumanniacicadellinicola和CandidatusEntotheonellasp.相對豐度排名分別占第6和第10。

研究發(fā)現(xiàn)，在基因KEGG注釋時，扶桑綿粉蚧基因主要為代謝相關(guān)基因和遺傳信息處理基因，代謝相關(guān)功能基因中，又以氨基酸代謝基因為主，數(shù)量遠遠高于其他代謝基因。在橘臀紋粉蚧Planococcuscitri(Risso)體內(nèi)，嵌套菌CandidatusMoranellaendobia和CandidatusTremblayaprinceps共同參與了其體內(nèi)的氨基酸代謝(López-Madrigaletal.,2013；McCutcheon & von Dohlen，2011)。然而，同樣的功能在PhenacoccusavenaeBorchsenius體內(nèi)卻由CandidatusTremblayaphenacola一種共生菌完成(López-Madrigaletal.,2014)。為此，可推測扶桑綿粉蚧通過刺吸式口器取食富含糖分卻缺乏必需氨基酸的植物韌皮部汁液，內(nèi)共生菌CandidatusTremblaya為其提供了必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)。同時，研究檢測到Drosophilaananassae內(nèi)共生菌Wolbachia也是扶桑綿粉蚧體內(nèi)的優(yōu)勢種群之一(相對豐度1.04%)。Wolbachia廣泛存在于節(jié)肢動物中，對宿主生殖有重要影響。由于內(nèi)共生菌在昆蟲體內(nèi)的生存環(huán)境相對穩(wěn)定，與自由生活的親緣菌相比，基因組更小，其中環(huán)境信息處理可由其寄主提供(López-Madrigaletal.,2015)。因此,扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌基因注釋時環(huán)境信息處理基因所占比例也很小，僅占1.03%。

本研究共預測了36505個基因，而注釋的基因相對較少(KEGG，776個；COG，398個)。這可能與研究目標和選取的數(shù)據(jù)庫有關(guān)。而注釋結(jié)果出現(xiàn)B.ubonensis等種類，可能與基因和物種注釋中存在的偏好性有關(guān)。在基因和物種注釋時，本研究選取E值<0.00001的object序列作為該基因或者物種的注釋信息，因此存在一定的偏好性，注釋豐度較低的基因和物種可能與實際有一定差異。

昆蟲內(nèi)共生菌能為宿主昆蟲提供營養(yǎng)物質(zhì)、消化食物、解毒及提高免疫活性等功能，還影響宿主的生殖方式、適合度、運動行為及抗藥性(魏曉瑩等，2019)。本研究借助高通量測序和生物信息學技術(shù)，初步確定了扶桑綿粉蚧內(nèi)共生菌菌群的群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群，并初步分析了這些內(nèi)共生菌的功能基因情況。但這些內(nèi)共生菌對扶桑綿粉蚧的生物學特性有哪些影響、在其體內(nèi)的分布以及與其入侵的關(guān)系還需進一步研究。