多殺菌素對天敵昆蟲白蛾周氏嚙小蜂的毒力評估

劉飛雨，任怡靜，金 欣，郭美琪，李 敏，潘麗娜*

1天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2天津師范大學(xué)天津市動物多樣性保護與利用重點實驗室，天津 300387

美國白蛾Hyphantriacunea(Drury)屬鱗翅目燈蛾科，是入侵性、國際性檢疫害蟲，主要通過幼蟲取食葉片危害林木、果樹、花卉及園藝作物，給我國農(nóng)林生產(chǎn)帶來重大經(jīng)濟損失(盧修亮等，2020)。目前在美國白蛾集中暴發(fā)區(qū)，主要采用航空施藥防治為主，地面防治為輔的防治策略，可基本控制美國白蛾疫情，但化學(xué)農(nóng)藥會帶來一系列環(huán)境、生態(tài)、食品安全問題等。探索無公害、長效的防治技術(shù)對于美國白蛾的可持續(xù)防控有重要意義。白蛾周氏嚙小蜂Chouioiacunea(Yang)是楊忠岐(2018)發(fā)現(xiàn)的一種對美國白蛾有顯著防治效果的蛹寄生蜂，其寄生率可達92.2%。化學(xué)防治與生物防治相結(jié)合是害蟲綜合防治的重要策略，而常見殺蟲劑對白蛾周氏嚙小蜂的安全性評價甚少。

多殺菌素是具有殺蟲效應(yīng)的土壤細菌刺糖多孢菌Saccharopolysporaspinosa有氧發(fā)酵的次級代謝產(chǎn)物，相對于有機磷殺蟲劑，多殺菌素是一種低毒、對環(huán)境友好的廣譜殺蟲劑(Galm & Sparks，2015；Kirst，2010)，對于多種農(nóng)業(yè)害蟲有良好的殺蟲效應(yīng)(Morales-olaisetal.，2020)。與高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺等常用殺蟲劑類似，多殺菌素施藥后會長時間存留在植物葉片上，且對天敵昆蟲如捕食性天敵齒爪盲蝽Deraeocorisbrevis、寄生性天敵玉米螟卵赤眼蜂TrichogrammachilonisIshii有明顯的觸殺效應(yīng)，同時顯著影響寄生天敵的寄生性(Amarasekare & Shearer,2020; Khan,2019)。

多殺菌素可通過體表滲透進入昆蟲體內(nèi)，且一旦進入將無法代謝排出。多殺菌素的殺蟲效應(yīng)主要是通過變構(gòu)拮抗煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR，一種經(jīng)遞質(zhì)配體門控的離子通道蛋白)，刺激昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致非功能性肌肉收縮、震顫、麻痹而死亡(Sparksetal.，2012)。在田間及實驗室篩選獲得的抗性害蟲品系多發(fā)生nAChR alpha6蛋白失活。應(yīng)用CRISPER技術(shù)敲除2個nAChR 亞基(Haalpha6和Haalpha7)發(fā)現(xiàn)，與對照相比，敲除Haalpha6的棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHubner及小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Linnaeus)對多殺菌素的抗性均顯著提高(Wangetal.,2020a，2020b)。

評估殺蟲劑對天敵昆蟲的風(fēng)險程度，可為制定綜合害蟲防治和保護天敵昆蟲的措施提供理論基礎(chǔ)。因此，本研究采用藥膜法，通過不同濃度多殺菌素處理，檢測其對美國白蛾寄生性天敵周氏嚙小蜂的安全性，并以亞致死濃度多殺菌素脅迫刺激白蛾周氏嚙小蜂，測定其谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase, GSTs)、羧酸酯酶(carboxyesterase, CarE)2種主要解毒酶及乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AchE)的活性，旨在為全面闡明白蛾周氏嚙小蜂對多殺菌素的解毒機制、白蛾周氏嚙小蜂的抗藥性及綜合防控美國白蛾提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲 白蛾周氏嚙小蜂由漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心惠贈，在本實驗室傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：人工氣候箱(PQX-350H)溫度25 ℃，相對濕度75%，光周期13L∶11D。自接種于柞蠶(AntheraeapernyiGuerin-Meneville)蛹后，培養(yǎng)14 d獲得老熟幼蟲，培養(yǎng)20 d獲得成蟲。

1.1.2 藥劑及儀器 乙基多殺菌素懸浮劑(有效成分含量3%)，美國陶氏益農(nóng)公司(田間使用濃度24～40 mg·L-1)。AchE活性測定試劑盒(貨號：BC2025)、GSTs活性檢測試劑盒(貨號：BC0355)、CarE活性檢測試劑盒(貨號：BC0840)，北京索萊寶科技有限公司。手持式電動組織研磨器，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司。多功能酶標儀(Infinite 200)，瑞士帝肯(Tecan)。

1.2 方法

1.2.1 室內(nèi)毒力評估及安全性評價 室內(nèi)毒力評估采用藥膜法，將60 g·L-1多殺菌素用清水稀釋，配制成有效濃度為0、5、10、15、20、25 mg·L-1的藥液。在干凈的50 mL廣口錐形瓶中倒?jié)M藥液，靜置5 min，倒出管內(nèi)藥液，自然晾干，使藥液在管壁上均勻形成藥膜，接入羽化后12 h內(nèi)成蜂50頭，瓶口用120目網(wǎng)布封緊，分別于1、2、4、6和24 h后檢查統(tǒng)計瓶中白蛾周氏嚙小蜂死亡數(shù)量。初步確定多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂的毒力，并計算多殺菌素使白蛾周氏嚙小蜂死亡10%、20%、30%、50%的劑量(LC10、LC20、LC30、LC50)。

農(nóng)藥對白蛾周氏嚙小蜂的毒性評價目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的標準，白蛾周氏嚙小蜂與赤眼蜂Trichogrammatidspp.同為寄生性天敵昆蟲，可參照赤眼蜂進行安全性評價。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》(中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局等，2014)，赤眼蜂的安全性評價采用安全系數(shù)法：極高風(fēng)險(安全系數(shù)≤0.05)；高風(fēng)險(0.05<安全系數(shù)≤0.5)；中風(fēng)險(0.5<安全系數(shù)≤5)；低風(fēng)險(安全系數(shù)>5)。因此，多殺菌素的安全系數(shù)為白蛾周氏嚙小蜂的半致死濃度LC50與該藥的田間推薦施用濃度的比值，即：安全系數(shù)=毒性LC50/田間實際使用濃度。

1.2.2 酶活性測定 分別取不同亞致死濃度0、LC10(5.6 mg·L-1)、LC20(7.3 mg·L-1)、LC30(8.8 mg·L-1)、LC50(11.9 mg·L-1)處理后存活的幼蟲進行相關(guān)酶活性的測定。取白蛾周氏嚙小蜂150只(約0.025 g)，根據(jù)試劑盒推薦比例加入試劑，冰浴中整體研磨勻漿，勻漿液12000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液作為CarE、GSTs和AchE活性測定的酶源。CarE、GSTs和AchE活性測定參照檢測試劑盒說明書，每處理3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件計算毒力回歸方程和致死中濃度，采用Excel 2016對酶活力測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂的毒力評估及安全性評價

多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂無短期(1 h)觸殺作用，但隨施藥時間延長，其對小蜂的毒殺作用增強，25 mg·L-1多殺菌素施藥2 h后，可誘導(dǎo)18.67%小蜂個體死亡。施藥4 h后，不同濃度多殺菌素對小蜂的毒殺作用差異最明顯，低濃度(5 mg·L-1)多殺菌素可誘導(dǎo)11.33%小蜂死亡，而中、高濃度多殺菌素(≥15 mg·L-1)可誘導(dǎo)77.33%～88.00%個體死亡。施藥6 h后，高濃度多殺菌素(≥20 mg·L-1)可造成幾乎全部個體死亡。施藥24 h后，各施藥濃度均可引起超過96.00%的小蜂死亡，說明多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂有顯著毒殺作用(表1)。

表1 不同濃度多殺菌素處理后白蛾周氏嚙小蜂成蜂存活率

進一步觸殺毒力分析表明，施藥2 h，LC50值為52.70 mg·L-1，依據(jù)田間使用濃度24 mg·L-1計算，安全系數(shù)為2.20，屬中風(fēng)險性農(nóng)藥。而施藥4和6 h后，LC50值分別為12.06和7.44 mg·L-1，安全系數(shù)為0.50和0.31，屬高風(fēng)險性農(nóng)藥(表2)。說明雖然多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂觸殺作用不強，但仍具明顯毒殺作用，屬于高風(fēng)險性農(nóng)藥，在白蛾周氏嚙小蜂生防區(qū)域需慎用。

表2 多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂成蜂的觸殺毒力

2.2 多殺菌素脅迫對白蛾周氏嚙小蜂酶活性的影響

2.2.1 多殺菌素脅迫對白蛾周氏嚙小蜂AchE活性的影響 多殺菌素通過拮抗煙堿型乙酰膽堿受體，作用于昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，從而對鱗翅目、纓翅目和雙翅目害蟲具有良好的防治作用(王燕燕等，2015)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伴隨多殺菌素濃度提高，白蛾周氏嚙小蜂AchE活性無明顯變化，當多殺菌素濃度為LC50時，AchE活性為1.3 U·mg-1，白蛾周氏嚙小蜂AchE活性僅可達對照的1.3倍，即高濃度多殺菌素處理會引起AchE活性提高，但無法形成其對藥物的抗性作用(圖1)。

2.2.2 多殺菌素脅迫對白蛾周氏嚙小蜂GSTs、CarE活性的影響 本研究對白蛾周氏嚙小蜂2種解毒酶(GSTs及CarE)活性變化的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂GSTs活性誘導(dǎo)作用呈劑量效應(yīng)。隨著多殺菌素濃度的升高，GSTs活性變化由緩慢到顯著上升，在高濃度(11.9mg·L-1)時活性被顯著誘導(dǎo)，說明GSTs主要在高濃度多殺菌素的解毒代謝中發(fā)揮重要作用。各亞致死濃度的多殺菌素處理對CarE活性均有顯著的誘導(dǎo)作用，高濃度(11.9 mg·L-1)時CarE活性為4.5 U·mg-1，誘導(dǎo)作用達到最強，說明多殺菌素在試驗范圍內(nèi)均能顯著增強CarE活性，CarE在白蛾周氏嚙小蜂解毒機制中發(fā)揮重要作用(圖1)。

圖1 多殺菌素脅迫對白蛾周氏嚙小蜂AchE、GSTs和CarE活性的影響

3 討論

在化學(xué)防治中，殺蟲劑亞致死效應(yīng)對捕食性天敵的抗藥性研究具有重要意義。捕食性天敵的抗藥性機理主要有2種：靶標酶敏感性降低和解毒酶活性升高(楊慧等,2020)。研究表明，棉鈴蟲的GSTs與有機磷-毒死蜱、敵敵畏和擬除蟲菊酯-氯氰菊酯供試農(nóng)藥具有較強的親和力，其體內(nèi)的GSTs活性和基因表達的上調(diào)具有劑量效應(yīng)，且GSTs和酯酶的解毒機制參與了殺蟲劑抗性的產(chǎn)生(Wangetal.，2016)，促進了昆蟲對有害物質(zhì)的解毒代謝(Labadeetal.,2018)。水解酶類羧酸酯酶的解毒代謝能力增強是抗藥性產(chǎn)生的重要機制，研究表明棉蚜AphisgossypiiGlover的羧酸酯酶活性的變化與抗藥性程度呈正相關(guān)關(guān)系(盧芙萍等，2006)。本研究中，CarE的活性隨著供試藥劑濃度的增加而上升，推測白蛾周氏嚙小蜂中CarE與抗藥性程度相關(guān)，CarE可能是誘發(fā)白蛾周氏嚙小蜂對多殺菌素產(chǎn)生抗藥性的一個潛在因素。靶標酶AchE的敏感性變化與昆蟲的抗藥性產(chǎn)生密切相關(guān)，多殺菌素類殺蟲劑作用靶標煙堿型乙酰膽堿受體，使昆蟲體內(nèi)的AchE快速水解興奮型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，阻礙其神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間的傳遞進而影響神經(jīng)沖動的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致昆蟲出現(xiàn)異常肌肉興奮甚至中毒死亡(孟琳琳等,2010)。研究表明，草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E Smith)體內(nèi)AchE的活性隨乙基多殺菌素劑量的增加而增加，對蟲體產(chǎn)生其抗藥性起著重要作用(高祖鵬等,2020)。本研究中，AchE的活性與供試藥劑存在劑量效應(yīng)，在高濃度AchE活性較高，推測其在高濃度藥劑下發(fā)揮顯著作用，增強抗藥性的產(chǎn)生。

本研究表明，多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂存在一定的毒害作用，且施藥時間較短時多殺菌素對白蛾周氏嚙小蜂具有中風(fēng)險性，施藥時間較長時有高風(fēng)險性。推測利用多殺菌素防治美國白蛾會對白蛾周氏嚙小蜂具有顯著的觸殺作用，因此，在使用多殺菌素防治美國白蛾時，應(yīng)注意保護白蛾周氏嚙小蜂。