蛞蝓多糖的提取優(yōu)化及抗氧化活性研究

張祖湘，王亞鳳，韋用瓊，陽丙媛，李岳，何瑞杰，阮俊，黃永林*

（1. 桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林；2.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西 桂林；3. 廣西久福生物科技有限公司，廣西 南寧）

0 引言

蛞蝓（Agriolimax agrestis Linnaeus）屬腹足類腹足綱蛞蝓科動物的統(tǒng)稱，為有肺的軟體動物，因其體表布滿黏液，俗稱“黏蟲、鼻涕蟲、蜒蚰、土蝸、附蝸”。蛞蝓作為一種傳統(tǒng)中藥，具有味咸寒，入肺、肝、大腸經(jīng)，祛風(fēng)定驚、清熱解毒、破瘀通經(jīng)等功用，主治中風(fēng) 僻、筋脈拘攣、驚癇、喘息、喉痹、咽腫、癰腫、痰核、痔瘡腫痛等癥[1-3]。文獻報道蛞蝓中含有多糖、氨基酸、甾醇類及其他成分[4-7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明蛞蝓提取物能夠抑制宮頸癌HeLa 細胞裸鼠移植瘤生長，還可抑制肺癌細胞端粒酶基因hTERT 和改變突變型P53 的表達[8-9]。同時蛞蝓凍干粉能明顯延長咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，具止咳化痰平喘作用，并能明顯的降低哮喘豚鼠肺組織嗜酸性粒細胞浸潤，對支氣管哮喘及慢性支氣管炎有較好的治療作用[10-13]。目前國內(nèi)外對蛞蝓化學(xué)成分的研究較少，多糖成分抗氧化活性的研究也未涉及。本研究通過單因素及正交試驗優(yōu)化了蛞蝓多糖的提取工藝，并對其多糖成分進行了抗氧化活性研究，為蛞蝓藥材的進一步研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛞蝓樣品2019年7月購于南寧市五塘鎮(zhèn)，經(jīng)李岳執(zhí)業(yè)藥師分別鑒定為蛞蝓，憑證樣品存放于廣西久福生物科技有限公司。實驗樣品分別經(jīng)自然干燥粉碎后，過60 目篩；FA2204B 電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；800Y 多功能粉碎機（鉑歐五金廠）；TD5A-WS 臺式低速離心機；德國IKA C-MAG HS10 恒溫磁力攪拌器。實驗所用甲醇、無水乙醇、丙酮、氯仿及正丁醇均為AR，水為實驗室自制蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛞蝓多糖的提取流程

取干燥的蛞蝓粉末，過60 目篩，加10 倍5% 甲醇浸泡12h 脫脂，4000r/min 離心15min。取殘渣加8 倍體積蒸餾水置于恒溫磁力攪拌器（60℃，2000rpm）浸提4h，加壓抽濾除殘渣。得到濾液加無水乙醇至最終濃度80%，室溫下靜置24h 沉淀多糖。4000r/min 離心15min，取沉淀加蒸餾水復(fù)溶后再次沉淀多糖，取沉淀用無水乙醇和丙酮各洗滌脫脂兩次。沉淀加蒸餾水復(fù)溶，得到蛞蝓粗多糖溶液。采用sevage 法除蛋白，氯仿：正丁醇=5:1 與蛞蝓粗多糖溶液1:5 混合后，劇烈振搖20-30min，使蛋白質(zhì)與氯仿-正丁醇生成凝膠物質(zhì)而分離，4000r/min 離心15min 后置于分液漏斗中，取水層重復(fù)除蛋白4 次，即得除蛋白的多糖溶液。減壓濃縮后冷凍干燥，得粗多糖。

1.2.2 提取單因素試驗

每組單因素試驗均取5g 預(yù)處理后的蛞蝓粉末，按1.2.1下方法提取，得到蛞蝓多糖，稱重，計算提取率。單因素試驗分 別 考 察 浸 提 時 間（2h、4h、6h、8h、10h）、浸 提 比（1:2、1:4、1:6、1:8、1:10）、醇沉濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、浸提溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）對蛞蝓多糖提取率的影響。

1.2.3 提取正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以蛞蝓多糖提取率為考察指標，選取浸提時間、浸提比、醇沉濃度、浸提溫度4 項為考察因素，根據(jù)每個考察因素在單因素試驗中得到的最優(yōu)條件，均選取3個水平，設(shè)計L9（34）正交試驗，其因素水平表見表1。正交試驗均取5g 蛞蝓藥材粉末，按照正交設(shè)計的試驗條件進行提取，試驗結(jié)果見表2。

表1 因素水平表L9（34）

1.2.4 蛞蝓多糖的抗氧化活性

1.2.4.1 蛞蝓多糖對DPPH·的清除

參考文獻[14]。用95% 乙醇配置0.2mg/mL 的DPPH·溶液，避光保存。 取不同濃度的樣品溶液0.1mL，加入0.16mLDPPH·溶 液，用95% 乙 醇 定 容 到1mL，避 光 反 應(yīng)30min，在517nm 處測定吸光度為A1；將樣品溶液替換成95%乙醇，同樣方法測得的吸光度為A0；取不同濃度樣品溶液0.1mL，用95%乙醇定容到1mL，測定的吸光度為A2。同樣濃度的VC 作陽性對照。DPPH·清除率/%=[ A0-（A1-A2）/A0]×100%。

1.2.4.2 蛞蝓多糖對羥基自由基的清除

參 考 文 獻[15]。分 別 取1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL 的多糖溶液0.15mL，分別加入0.1mL 9mmol/L 的水楊酸溶液、0.1mL 9mmol/L 的FeSO4溶液、1.05mL 蒸餾水，搖勻，使之混合充分，再加入0.1mL 8.8mmol/L 的H2O2，置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15min，于510nm 波長處測定其吸光度A1，用相同體積的蒸餾水代替H2O2按上述方法反應(yīng)后測定吸光度A2，用相同體積蒸餾水代替多糖溶液反應(yīng)后測定吸光度A0。同樣濃度的VC 作陽性對照。羥自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）/A0]×100%。

1.2.4.3 總還原能力

參考文獻[16]并稍加改進。分別取1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL 的 多 糖 溶 液0.1mL，加 入0.2mL PH 值為7.4 的磷酸鹽緩沖液和0.15mL 1%鐵氰化鉀溶液，搖勻，于50℃恒溫水浴鍋中加熱30min，冷水快速冷卻至室溫，加入0.1mL 10% 三 氯 乙 酸，3000r/min 離 心10min，取 上 清 液0.125mL 再加入0.1%三氯化鐵溶液0.025mL，混合搖勻，室溫下靜置10min，使充分反應(yīng)，于700nm 處測定吸光度A1，以蒸餾水代替多糖溶液按上述處理作空白對照測得吸光度A0。用同樣濃度Vc 溶液作陽性對照?？傔€原力=A1-A0。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取單因素實驗結(jié)果

黑蛞蝓多糖的浸提時間、浸提比、醇沉濃度、浸提溫度對多糖提取率的影響的單因素試驗結(jié)果見圖1。

圖1 浸提時間（A）、浸提比（B）、醇沉濃度（C）、浸提溫度（D）對蛞蝓多糖提取率的影響

由圖1A 可知，浸提時間對蛞蝓多糖的提取率影響不大，浸提時間為2-6h 時，蛞蝓多糖的提取率隨時間增加而緩慢增加，6h 后降低。所以選擇適宜的浸提時間是6h。

由圖1B 可知，浸提比為1:2-1:4 時蛞蝓多糖的提取率明顯增大。浸提比為1:6-1:10 時趨勢平緩，提取率遠不及1:4。所以選擇適宜的浸提比是1:4。

由圖1C 可知，醇沉濃度為70%時蛞蝓多糖的提取率最高，醇沉濃度80%-90%時略有浮動，但都不及70%。所以選擇適宜的醇沉濃度是70%。

由圖1D 可知，浸提溫度在40-60℃時，蛞蝓多糖的提取率逐漸升高，60-80℃直線下降。所以選擇適宜的浸提溫度是60℃。

2.2 正交優(yōu)化實驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2，從極差R 值可以看出，4 個因素對蛞蝓多糖的提取率均有影響，影響次序為C（醇沉濃度）＞D（浸提溫度）＞A（浸提比）＞B（浸提時間）。蛞蝓多糖的最佳提取條件為：A1B3C3D3，即浸提比為1:4，浸提時間為8h，醇沉濃度為90%，浸提溫度為80℃。在此最佳工藝下進行驗證，蛞蝓多糖的提取率為（5.44±0.4）%，優(yōu)于其他組合項，表明該提取工藝可作為蛞蝓多糖的最佳提取工藝。

2.3 蛞蝓多糖的抗氧化活性

2.3.1 蛞蝓多糖對DPPH·的清除作用

蛞蝓多糖清除DPPH·的測定結(jié)果見圖2。從圖2 可以看出，Vc 對DPPH·表現(xiàn)出較為優(yōu)異的清除能力，蛞蝓多糖對DPPH·的清除能力同樣隨濃度增加而增大，但是其清除能力明顯小于Vc。蛞蝓多糖清除DPPH·的IC50=14.20mg/mL。

2.3.2 蛞蝓多糖對羥基自由基的清除作用

蛞蝓多糖對羥基自由基的清除作用結(jié)果見圖3?？梢钥闯鲵因醵嗵菍αu基自由基清除能力隨樣品濃度的增加而增大，但清除能力不及VC。蛞蝓多糖清除其羥自由基的IC50=7.86mg/mL。

表2 正交試驗結(jié)果L9（34）

表3 正交試驗方差分析

圖2 蛞蝓多糖對DPPH·的清除能力

圖3 蛞蝓多糖對羥基自由基清除能力

2.3.3 蛞蝓多糖的總還原能力

蛞蝓多糖的總還原能力測定結(jié)果見圖4。吸光度越大，表明樣品的總還原能力越強。由圖4 可以看出蛞蝓多糖的還原能力隨濃度的增加而增大，具有一定的還原能力，但其還原能力小于VC。

圖4 蛞蝓多糖的總還原能力

3 結(jié)論

通過單因素及正交試驗結(jié)果，得出蛞蝓多糖的最佳提取條件為：A1B3C3D3，即浸提比為1:4，浸提時間為8h，醇沉濃度為90%，浸提溫度為80℃。在此最佳工藝下進行驗證，蛞蝓多糖的提取率為（5.44±0.4）%，優(yōu)于其他組合項，表明該提取工藝可作為蛞蝓多糖的最佳提取工藝?？寡趸瘜嶒灡砻?，蛞蝓多糖對DPPH、羥基自由基的清除作用及對鐵離子還原能力均隨濃度增加而增大，具有一定的抗氧化能力。