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    遼寧省稻瘟病菌生理小種及無(wú)毒基因鑒定

    2020-12-10 10:48:36魏松紅朱麗珺王海寧張照茹李昕洋
    關(guān)鍵詞:小種稻瘟病生理

    劉 偉,魏松紅,朱麗珺,王海寧,張照茹,李昕洋

    (沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866)

    【研究意義】由稻梨孢(Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是目前世界分布最廣、危害最重的水稻病害之一[1],近年來(lái),我國(guó)遼寧地區(qū)稻瘟病的發(fā)生也呈現(xiàn)逐年加重的趨勢(shì),已成為限制該地區(qū)水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙之一[2]。選育和種植抗病品種是防治稻瘟病最有效的措施,水稻對(duì)稻瘟病的抗性類型大多數(shù)屬于小種?;共⌒?,由主效抗病基因控制,表現(xiàn)為質(zhì)量性狀,該類抗病類型抗病效能高,遺傳方式簡(jiǎn)單,已成為廣泛應(yīng)用的主要抗病性類型[3-4]。小種?;共⌒苑螰lor 的“基因?qū)颉睂W(xué)說(shuō),即抗病基因(R基因)識(shí)別病原物的無(wú)毒基因(Avr基因),引發(fā)不親和反應(yīng)[5]。由于稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜,變異速率快,致病力分化嚴(yán)重,導(dǎo)致能克服寄主抗病性的群體快速形成優(yōu)勢(shì),大多數(shù)抗病品種在大田推廣3~5年后即喪失抗性[6-8]。因此,鑒定稻瘟病菌的無(wú)毒基因和生理小種的動(dòng)態(tài)變化,有助于人們根據(jù)不同地區(qū)流行菌株的無(wú)毒基因型選擇具有相應(yīng)抗病基因的水稻品種進(jìn)行合理布局。【前人研究進(jìn)展】目前完成初步定位的稻瘟病菌無(wú)毒基因至少有40個(gè),成功克隆的稻瘟病菌無(wú)毒基因有12個(gè),分別為PWL1、PWL2、AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik/km/kp、PWL2D、Avr-Pi9和Avr-Pib。劉翔等[9]對(duì)2014年分離自湖南桃江病圃麗江新團(tuán)黑谷的稻瘟病菌進(jìn)行無(wú)毒基因鑒定,結(jié)果表明:無(wú)毒基因Avr-Pita、Avr-Pish、Avr-Piz、Avr-Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9出現(xiàn)頻率較高。王世維等[10]對(duì)2011年分離自遼寧地區(qū)的稻瘟病菌進(jìn)行無(wú)毒基因鑒定,結(jié)果表明:遼寧省稻瘟病菌主要無(wú)毒基因類型為Avr-pita、Avr-pik和AvrPiz-t,AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia在遼寧省的稻瘟病菌中均未檢測(cè)到。朱名海等[11]對(duì)2014-2015年分離自南繁核心區(qū)和非核心區(qū)的稻瘟病菌無(wú)毒基因攜帶情況進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明:無(wú)毒基因ACE1、Avr-Pik、Avr-Pita、Avr-Piz-t和PWL2在2個(gè)區(qū)域的稻瘟病菌中分布率較高,無(wú)毒基因Avr-Pia在南繁非核心區(qū)的稻瘟病菌中未檢測(cè)到?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)于2017-2018年采集遼寧省7個(gè)主產(chǎn)稻區(qū)穗頸瘟病標(biāo)樣740余份,通過(guò)單孢分離共獲得151株供試菌株,采用全國(guó)統(tǒng)一的1套7個(gè)鑒別品種,對(duì)供試菌株進(jìn)行生理小種鑒定,并對(duì)供試菌株進(jìn)行了10個(gè)稻瘟病菌無(wú)毒基因攜帶情況的PCR檢測(cè)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究結(jié)果可為指導(dǎo)遼寧地區(qū)水稻品種的選育、布局和輪用以及稻瘟病的綜合防控提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試菌株:2017-2018年從遼寧省7個(gè)主產(chǎn)稻區(qū)(沈陽(yáng)市、大連市、丹東市、營(yíng)口市、盤錦市、鐵嶺市、撫順市)采集穗頸瘟標(biāo)樣740余份,通過(guò)病原菌常規(guī)分離和單孢純化共獲得151株供試菌株,其中沈陽(yáng)25株、大連9株、丹東31株、營(yíng)口2株、盤錦28株、鐵嶺34株、撫順22株。

    供試水稻鑒別品種:特特普、珍龍13、四豐43、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18、麗江新團(tuán)黑谷。

    供試培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g,瓊脂20 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL;PD培養(yǎng)液為馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL;TOA培養(yǎng)基為燕麥片30 g,番茄汁200 mL,瓊脂30 g,蒸餾水1000 mL。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 供試菌株生理小種鑒定 將活化的供試菌株轉(zhuǎn)接至TOA培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng),培養(yǎng)5 d后,配成孢子懸浮液(每毫升1×106個(gè)孢子)備用。將7個(gè)供試鑒別水稻品種培養(yǎng)至3葉1心期,參照張海旺等[12](2014)的方法進(jìn)行離體葉段劃傷接種,放置于人工氣候培養(yǎng)箱中,模擬7-8月水稻田間的氣候條件,培養(yǎng)8 d后,采用全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組(1980 年)制訂的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查,記載鑒別品種的抗(R)感(S)反應(yīng)類型[13]。

    1.2.2 供試菌株無(wú)毒基因鑒定 將活化的供試菌株轉(zhuǎn)接至PD培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 d,收集菌絲并干燥,利用OMEGA公司真菌基因組DNA提取試劑盒(D3390-01)進(jìn)行供試菌株DNA提取。根據(jù)10個(gè)稻瘟病菌無(wú)毒基因序列,利用Primer 6和DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物并檢驗(yàn),設(shè)計(jì)出10對(duì)不同無(wú)毒基因引物,引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系(30 μl):E-taq酶0.15 μl,10×E-TaqBuffer(MgCl2)3 μl,正向引物和反向引物各0.12 μl(100 μg·mL-1),dNTP 2 μl,DNA模板2 μl,ddH2O補(bǔ)足至30 μl。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55~61 ℃退火30 s,具體依據(jù)引物的G/C含量來(lái)定,72 ℃延伸30~60 s,具體依據(jù)目的片段長(zhǎng)度而定,29個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè):取5 μl PCR產(chǎn)物與1.5×Loading buffer混合液(4∶1)混合后,在1 %瓊脂糖凝膠中電泳,DuRed染色后,在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    結(jié)合2010-2016年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布和動(dòng)態(tài)變化,對(duì)2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種進(jìn)行分析,結(jié)合2014-2016年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因分布和動(dòng)態(tài)變化,對(duì)2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種鑒定

    由表2可知,供試151株稻瘟病菌經(jīng)鑒定劃分為6群41個(gè)生理小種。分別為ZA群的ZA1、ZA3、ZA5、ZA7、ZA9、ZA13、ZA17、ZA21、ZA25、ZA29、ZA31、ZA33、ZA37、ZA41、ZA49、ZA55、ZA57、ZA61,共18個(gè)小種;ZB群的ZB1、ZB3、ZB5、ZB9、ZB11、ZB13、ZB17、ZB19、ZB21、ZB23、ZB25、ZB29、ZB30、ZB31,共14個(gè)生理小種;ZC群的ZC1、ZC5、ZC11,共3個(gè)生理小種;ZD群的ZD1、ZD5、ZD7,共3個(gè)生理小種;ZE群的ZE1和ZE3,共2個(gè)生理小種;ZF群的ZF1,共1個(gè)生理小種。

    表1 用于擴(kuò)增無(wú)毒基因的引物

    表2 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種鑒定

    續(xù)表2 Continued table 2

    2.2 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因型鑒定

    通過(guò)設(shè)計(jì)10對(duì)無(wú)毒基因特異性引物對(duì)151株稻瘟病菌進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明(表3):AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia在遼寧省稻瘟病菌中未被發(fā)現(xiàn),無(wú)毒基因Avr-Pita、AvrPiz-t、Avr-pik、PWL2和ACE1攜帶頻率較高,攜帶頻率分別為:90.07 %、94.04 %、93.38 %、92.72 %和98.68 %,無(wú)毒基因Avr-pib攜帶頻率較低,僅為27.81 %。

    表3 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因鑒定

    表4 2010-2018年遼寧省稻瘟病菌出現(xiàn)頻率

    2.3 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群動(dòng)態(tài)變化

    由表4可知,2010-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種組成中,ZA種群和ZB種群為優(yōu)勢(shì)種群,除2013年外,ZA種群均為第一優(yōu)勢(shì)種群。多數(shù)年份,ZF種群占比僅次于ZA種群和ZB種群,而在2012-2014年ZF種群占比明顯減少。ZC種群自2014年起占比明顯降低。ZD種群和ZE種群雖然在一定的范圍內(nèi)進(jìn)行波動(dòng),但占比率一直較低。ZG種群僅在2012年出現(xiàn),ZH種群一直未出現(xiàn)。

    2.4 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因動(dòng)態(tài)變化

    由表5可知,2014-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因組成中,Avr-pi9、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-pik、Avr-pita、PWL2攜帶頻率較高。Avr-pi9在2015年攜帶頻率有所下降,在其余年攜帶頻率均在90 %以上。Avr-pib攜帶頻率在2017年有較大幅度上升,為49.33 %,其2014、2015、2016和2018年出現(xiàn)頻率分別為2.00 %、13.00 %、10.00 %和6.58 %。2014-2018年均未檢測(cè)到無(wú)毒基因AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia。

    2.5 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布

    2017-2018年遼寧省稻瘟病菌種群監(jiān)測(cè)結(jié)果(表6)表明:鐵嶺、沈陽(yáng)、丹東、撫順和盤錦地區(qū)稻瘟病菌生理小種種群組成復(fù)雜,分別為6群18個(gè)生理小種、6群18個(gè)生理小種、5群18個(gè)生理小種、5群11個(gè)生理小種和5群14個(gè)生理小種,大連和營(yíng)口地區(qū)相對(duì)單一,分別為4群6個(gè)生理小種和1群2個(gè)生理小種。ZA種群和ZB種群不僅為遼寧地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群,在各個(gè)稻區(qū)也是優(yōu)勢(shì)種群。

    表5 2014-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因出現(xiàn)頻率

    表6 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布

    表7 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因型地理分布

    2.6 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因分布

    2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無(wú)毒基因分布結(jié)果(表7)表明:所檢測(cè)的10個(gè)無(wú)毒基因,除AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia外,其它無(wú)毒基因在遼寧省各個(gè)稻區(qū)均檢測(cè)到。同一地區(qū)的不同無(wú)毒基因的攜帶頻率基本相同。

    3 討 論

    選育和種植抗瘟品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一,但是單一抗病品種長(zhǎng)時(shí)間大面積推廣種植易對(duì)田間病原菌造成選擇壓力,促使生理小種發(fā)生變異,進(jìn)而造成品種抗性減退甚至喪失[14-15]。鑒于稻瘟病菌及其寄主在世界范圍內(nèi)的重要影響,現(xiàn)在已經(jīng)成為研究植物與病原菌間相互作用的模式生物。根據(jù)“基因?qū)颉睂W(xué)說(shuō),水稻中含有1個(gè)抗性基因(R基因),在稻瘟病菌中就存在1個(gè)相對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因(Avr基因)。R基因通過(guò)識(shí)別Avr基因,啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng),從而激發(fā)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。所以只有在水稻中含有R基因,而同時(shí)稻瘟病菌中含有相對(duì)應(yīng)的Avr基因,水稻才表現(xiàn)抗瘟性。水稻抗瘟性研究需要從寄主的抗病基因和稻瘟病菌的無(wú)毒基因同時(shí)入手,才能系統(tǒng)地解決水稻抗稻瘟病的問(wèn)題。本研究利用7個(gè)水稻鑒別品種對(duì)2017-2018年采自遼寧省各個(gè)稻區(qū)的151株稻瘟病菌進(jìn)行生理小種鑒定,并根據(jù)已克隆的10個(gè)稻瘟病菌無(wú)毒基因序列設(shè)計(jì)引物,對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明:供試菌株被劃分為6群41個(gè)生理小種,ZA和ZB為優(yōu)勢(shì)種群,未檢測(cè)到ZG種群。供試菌株全部攜帶無(wú)毒基因Avr-Pi9,大部分菌株攜帶無(wú)毒基因Avr-Pita、AvrPiz-t、Avr-pik、PWL2和ACE1,無(wú)毒基因Avr-pib攜帶頻率較低,無(wú)毒基因Avr-Pii、Avr-CO39和Avr-Pia未檢測(cè)到。

    鐘寶玉等[16]從2006-2015年近10年間收集并分離了廣東各地稻瘟病菌3690個(gè),經(jīng)接種到中國(guó)稻瘟病菌鑒別品種上共鑒定出8群51個(gè)生理小種,其中以ZB群、ZC群和ZG群為主要優(yōu)勢(shì)種群;陳小林等[17]利用我國(guó)7個(gè)稻瘟病菌鑒別品種對(duì)廣西2012-2014年分離獲得的稻瘟病菌進(jìn)行生理小種鑒定。結(jié)果表明:2012-2014年分離獲得的142株稻瘟病菌菌株分為7群24個(gè)生理小種,其中優(yōu)勢(shì)種群為ZB,優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB9和ZB13;沈樂(lè)融等[18]針對(duì)2013-2017年從江蘇省采集標(biāo)樣并分離得到的共計(jì)621個(gè)稻瘟病菌菌株,利用10對(duì)稻瘟病菌無(wú)毒基因(PWL1、AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik、Avr-Pi9和Avr-Pib)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,分析了江蘇省稻瘟病菌無(wú)毒基因的分布及頻率,結(jié)果表明:上述10個(gè)無(wú)毒基因在江蘇省均有分布,但出現(xiàn)頻率不同,其中平均擴(kuò)增頻率最高的為Avr-Pib,最低的是Avr-Pia;李祥曉等[19]采用7個(gè)稻瘟病菌無(wú)毒基因(AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pit和Avr-Pik)特異性引物,對(duì)177個(gè)采自黑龍江省的稻瘟病菌菌株進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明:7個(gè)無(wú)毒基因在黑龍江省不同地區(qū)均有分布,但出現(xiàn)頻率不同,其中頻率最高的為ACE1,達(dá)到最低的為AVR1-CO39。由以上可知,不同地區(qū)稻瘟病菌生理小種和無(wú)毒基因組成差異較大,這種不同是由于水稻種植品種變化、品種抗性變化及氣候變化等綜合因素影響的結(jié)果。

    除了地區(qū)差異外,不同寄主的稻梨孢中無(wú)毒基因組成情況也具有較大差異,余歡等[20]對(duì)35株草類寄主的梨孢菌進(jìn)行無(wú)毒基因型分析,結(jié)果表明:所有供試菌株均沒(méi)有Avr-Pik/km/kp、PWL3和PWL4基因,以馬唐為寄主的菌株中沒(méi)有ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pita1和PWL1;以牛筋草為寄主的菌株中沒(méi)有Avr-Pia、Avr-Pita1、Avr-Pita2和PWL2;以狗尾草為寄主的菌株中沒(méi)有Avr-Pii、Avr-Pita、PWL1和PWL2。無(wú)毒基因Avr-CO39可與水稻抗性基因Pi-CO39(t)相互識(shí)別,引起水稻的過(guò)敏性壞死反應(yīng)[21]。但Avr-CO39存在于稻瘟病菌的進(jìn)化早期,并在稻屬?;偷倪M(jìn)化過(guò)程中由于發(fā)生轉(zhuǎn)座子插入,使得稻瘟病菌喪失了Avr-CO39活性。稻瘟病菌中并未發(fā)現(xiàn)具有完整Avr-CO39序列的菌株。而其他寄主的梨孢菌具有完整的Avr-CO39結(jié)構(gòu)[22-23]。

    4 結(jié) 論

    由于稻瘟病菌生理小種和無(wú)毒基因的多樣性和易變性,極易導(dǎo)致優(yōu)良抗瘟水稻品種喪失抗性,水稻品種的抗瘟持久性與其所在地區(qū)稻瘟菌生理小種和無(wú)毒基因的變化緊密相關(guān)[24]。因此,開(kāi)展不同地區(qū)稻瘟病菌生理小種和無(wú)毒基因組成和動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè),引導(dǎo)水稻品種的合理布局,是有效預(yù)防稻瘟病流行的重要手段,也是稻瘟病可持續(xù)治理的長(zhǎng)期性工作。遼寧省稻瘟病菌生理小種和無(wú)毒基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜,在遼寧省水稻品種布局中,應(yīng)推廣含有Pita、Pi9、Pizt和Pik抗性基因的水稻品種。

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