中國北方漢族人群TRIB1基因rs2235110多態(tài)性與2型糖尿病合并冠心病的相關(guān)性研究

石生河 李琳 鄢盛愷 楊輝 賈莉婷 夏良裕 程歆琦

中國北方漢族人群TRIB1基因rs2235110多態(tài)性與2型糖尿病合并冠心病的相關(guān)性研究

石生河 李琳 鄢盛愷 楊輝 賈莉婷 夏良裕 程歆琦

目的探討中國北方漢族人群TRIB1基因rs2235110多態(tài)性與2型糖尿病和2型糖尿病合并冠心病的關(guān)系。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR－RFLP)技術(shù)檢測了147例對照組、97例2型糖尿病組(DM組)和75例2型糖尿病合并冠心病組(DM+CHD組)TRIB1基因rs2235110多態(tài)性基因型，分析了不同組間基因型和等位基因頻率分布特點，并探討了基因多態(tài)性對糖化血紅蛋白(HbA1c)、血糖、血脂水平的影響。結(jié)果我國北方漢族人群rs2235110多態(tài)性AA、AG、GG基因型頻率分別為0．351、0．483、0．116，A、G等位基因頻率分別為0．592、0．408，與其他不同國家地區(qū)不同種族人群分布有顯著差異(P＜0．001)。3組研究對象間的TRIB1基因rs2235110多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。對照組和DM+CHD組中AG+GG型患者HDL－C水平明顯低于AA型，DM組AG+GG型患者LDL－C水平明顯低于AA型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。Logistic回歸分析顯示，G等位基因不是2型糖尿病合并冠心病的危險因素(95%CI: 0.579～2．552，OR=1．216，P=0．605)。結(jié)論TRIB1基因rs2235110多態(tài)性與2型糖尿病和2型糖尿病合并冠心病無明顯關(guān)聯(lián)，不是我國北方地區(qū)漢族人群2型糖尿病合并冠心病發(fā)病的危險因素。

TRIB1基因多態(tài)性糖尿病冠心病聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性

Tribbles(TRIBs)屬假性蛋白激酶家族，是Grosshans等［1］于2000年在果蠅體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的抑制有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核基因，其特有的生物學(xué)特性及其在癌癥和糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中對細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路和生化過程的調(diào)控作用，引起了研究人員的廣泛關(guān)注。人類TRIB1基因定位于8號染色體24．13區(qū)，可在多種細(xì)胞中表達(dá)。研究表明，TRIB1基因與血脂水平有關(guān)，可能參與動脈粥樣硬化的形成，增加冠脈疾病發(fā)生的危險［2～5］。最近有研究發(fā)現(xiàn)，TRIB1可調(diào)節(jié)小鼠肝脂質(zhì)形成和極低密度脂蛋白(very lowdensity lipoprotein，VLDL)的生成，tribbles－1蛋白定位于肝細(xì)胞核，可能具有與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子交互作用的能力并能促進(jìn)它們的降解，然而，TRIB1作用的確切機(jī)制尚不十分清楚［6］。目前尚沒有我國北方地區(qū)漢族人群TRIB1基因多態(tài)性分布特點及其與2型糖尿病合并冠心病的相關(guān)性研究報道。我們在建立聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP)分析TRIB1基因rs2235110多態(tài)性基礎(chǔ)上，對我國北方地區(qū)漢族人群TRIB1基因rs2235110多態(tài)性及其分布特點、與2型糖尿病和2型糖尿病合并冠心病的關(guān)聯(lián)性及其與脂類代謝、糖代謝的影響進(jìn)行了初步研究。

對象與方法

1．研究對象:(1)2型糖尿病組(DM組):選取2006年11月～2007年11月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科診斷為2型糖尿病的患者97例，其中男性57例，女性40例，平均年齡57．33±12．18歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合WHO 1998年公布的診斷標(biāo)準(zhǔn)，無冠心病病史、心電圖無ST段改變［7］。(2)2型糖尿病合并冠心病組(DM+CHD組):選取同期在筆者醫(yī)院心內(nèi)科因冠心病住院的糖尿病患者75例，其中男性50例，女性25例，平均年齡68．95±8．68歲。冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合冠狀動脈造影檢查冠脈狹窄≥50%，糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)同上。(3)對照組:選取同期筆者醫(yī)院體檢中心經(jīng)相關(guān)檢查除外糖尿病、冠心病及其他代謝性相關(guān)疾病的表觀健康人147例，其中男性65例，女性82例，平均年齡39．34±11．72歲。上述所有研究對象均為無血緣關(guān)系的中國北方漢族人，除外肝臟疾病、糖尿病腎衰竭、腎病綜合征、甲狀腺疾病和腎上腺疾病等影響血脂代謝和糖代謝的疾病。身高、體重、血壓由專門人員測量并計算體重指數(shù)(BMI)［體重/身高2(kg/m2)］，病史等臨床資料從患者病歷中獲得。

2．方法:(1)標(biāo)本采集:所有研究對象均禁食12～14h，于次日清晨經(jīng)肘靜脈采血。留EDTA－K3抗凝血3ml，其中1ml用于糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)測定，另2ml分離白細(xì)胞層提取基因組DNA，－20℃保存用于基因型分析;另留3ml不抗凝血，分離血清用于生化分析。(2)生化指標(biāo)測定:血糖采用中生北控公司檢測試劑盒，葡萄糖氧化酶法;血清總膽固醇(total cholesterol，TC)，TG，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL－C)，LDL－C采用日本第一化學(xué)公司試劑盒，前兩項為酶法，后兩項為勻相測定法。以上項目均在OLYMPUS AU5400生化分析儀上檢測。HbA1c采用Tosoh G8 HbA1c分析儀及配套試劑，高效液相層析法。以上測定均嚴(yán)格按照儀器、項目標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，用高、低2個水平質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制。(3)基因多態(tài)性檢測:改良的碘化鈉(NaI)法提取基因組DNA，PCR－RFLP技術(shù)分析TRIB1 rs2235110多態(tài)性。根據(jù)引物設(shè)計軟件primer premier 5．0設(shè)計下列引物:正義引物:5'－CGACGGCGGAGACAATC－3'(17bp)，反義引物:5'－CCTGCGTGTAGCGAACTGCGCCT TTGCTTTTCTAGCCACCTAA－3'(43bp)［8］。PCR反應(yīng)體系總體積50μl，含10×Buffer(Mg2+plus)5μl，2．5mmol/ L dNTPs 4μl，20μmol/L正義引物、反義引物各2μl，模板DNA 2μl(0．2～0．5μg)，2U(0．4μl)Taq酶以及超純水34．6μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35次;最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1.5g/dl瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果，以100bp DNA梯度分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物作為參照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶BstXI(10U/μl)37℃水浴箱溫育8h，酶切產(chǎn)物經(jīng)3g/dl瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外燈下判斷結(jié)果并拍照記錄。Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA分子參照物均為原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，引物為中生華美(北京)科技有限公司產(chǎn)品。BstXI限制性內(nèi)切酶為New England Biolabs產(chǎn)品，成像系統(tǒng)為Bio Rad公司產(chǎn)品，PCR分析儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:所有資料均以SPSS 13．0軟件分析，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義?；蛐秃突蝾l率采用基因計數(shù)法計算。研究對象與Hardy－Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的組間比較采用χ2檢驗。計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示;不符合正態(tài)分布的指標(biāo)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換達(dá)到近似正態(tài)分布后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(為使結(jié)果簡明仍以變換前數(shù)據(jù)表示)，組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析(ANOVA)或協(xié)方差分析(ANCOVA)檢驗。等位基因與血脂水平的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析和多元線性回歸分析。采用Logistic多元回歸分析糖尿病及其并發(fā)冠心病的危險因素。

結(jié)果

1．一般資料比較:與對照組相比，DM組和DM+ CHD組研究對象的平均年齡高于對照組，BMI、HbA1c、Glu、TG的平均水平均高于對照組，HDL－C低于對照組，結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。DM組TC平均水平高于對照組，結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。與DM組相比，DM+CHD組的平均年齡高于DM組，BMI、HbA1c、 Glu、TC、HDL－C、LDL－C低于DM組(表1)。

表1 3組研究對象一般資料比較

2．TRIB1 rs2235110基因型分析:在286bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列中，AA純合子個體只含有1個BstXI內(nèi)切酶的酶切位點，可被切割為247bp和39bp兩個片段;若rs2235110位點A堿基被G取代，GG純合子將失去限制性位點，不被內(nèi)切酶消化，電泳結(jié)果只含有286bp 1個片段;而雜合子AG型被酶切為286bp，247bp，39bp 3個片段。由于普通瓊脂糖凝膠電泳的分辨率較低，39bp的片段不易分辨，但并不影響基因型的判斷(圖1)。根據(jù)電泳結(jié)果挑選PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因序列分析，進(jìn)一步證實酶切結(jié)果(圖2)。

3．TRIB1 rs2235110基因型和等位基因分布頻率的組間比較:各組rs2235110基因型和等位基因分布頻率見表2。與對照組相比，DM組和DM+CHD組基因型頻率和等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

4．組內(nèi)不同基因型間生化指標(biāo)比較:在統(tǒng)計中我們將AG和GG基因型合并，作為G等位基因的攜帶者與AA基因型比較。對照組和DM+CHD組AG+ GG型人群HDL－C水平均低于AA型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。DM組AG+GG型LDL－C水平低于AA型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)(表3)。

5．TRIB1 rs2235110基因多態(tài)性與2型糖尿病合并冠心病的相關(guān)性:將全部研究對象作為整體進(jìn)行二分類Logistic回歸分析。二分類劃分標(biāo)準(zhǔn)如下:性別(女性為0，男性為1)、年齡(＜60歲為0，≥60歲為1)、高血壓病史(無為0，有為1)、BMI(＜25kg/m2為0，≥25kg/m為1)、rs2235110的G等位基因(AA為0，AG+GG為1)作為自變量(X)，將血脂按《中國成人血脂異常防治指南》［9］中的血脂分層切點分為不同等級:TC(＜5．18mmol/L為0，5.18～6.19mmol/L為1，≥6．22mmol/L為2)，TG(＜1．70mmol/L為0，1．70～2．25mmol/L為1，≥2．26mmol/L為2)，HDL－C(≥1．55mmol/L為0，1．04～1．55mmol/L為1，＜1.04mmol/L為2)，LDL－C(＜3．37mmol/L為0，3.37～4．12mmol/L為1，≥4．14mmol/L為2)，Glu (＜6．11mmol/L為0，≥6．11mmol/L為1)，HbA1c% (＜6．3%為0，≥6．3%為1)作為自變量(X)，分別將是否患有糖尿病(否為0，是為1)和是否患有糖尿病合并冠心病(否為0，是為1)作為因變量(Y)。

單因素分析顯示G等位基因不是2型糖尿病的危險因素(OR=1．017，P=0．941)。經(jīng)過Logistic回歸分析依次校正年齡、性別等因素后仍無相關(guān)性(OR=0．513，P=0．655)(表4)。單因素分析顯示G等位基因不是2型糖尿病合并冠心病的危險因素(OR=0．718，P=0．247)。經(jīng)過Logistic回歸分析依次校正年齡、性別等因素后發(fā)現(xiàn)，G等位基因與2型糖尿病合并冠心病無關(guān)，不是2型糖尿病合并冠心病的危險因素(OR=1．216，P=0．605)(表5)。

表4 2型糖尿病危險因素Logistic回歸分析

表5 2型糖尿病合并冠心病危險因素Logistic回歸分析結(jié)果

討論

本研究在國內(nèi)首次對TRIB1 rs2235110多態(tài)性與2型糖尿病及其與2型糖尿病合并冠心病的關(guān)系進(jìn)行了評價。rs2235110位點基因型和等位基因分布符合Hardy－Weinberg平衡(χ2=0，P=1．000)，具有群體代表性。不同國家地區(qū)人群間TRIB1 rs2235110多態(tài)性分布有顯著差異(χ2=181．842，P＜0.001)，提示TRIB1基因rs2235110位點多態(tài)性分布可能與人群種族、生存環(huán)境等因素有一定相關(guān)性。

統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，DM組和對照組、DM+ CHD組和對照組比較，血脂水平、血糖和HbA1c均存在一定差異，rs2235110基因型和等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此前，國內(nèi)有學(xué)者研究湖北漢族人群rs2235110多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)性時發(fā)現(xiàn)，冠心病組患者TG水平在各基因型間有顯著差異，與其他血脂水平未見明顯關(guān)聯(lián)［10］。本研究中，對照組和DM+ CHD組攜帶G等位基因人群HDL－C水平均低于AA型，DM組攜帶G等位基因者LDL－C水平低于AA型，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，未見TG在各組不同基因型間有顯著差異。單因素分析顯示rs2235110多態(tài)性不是2型糖尿病和2型糖尿病合并冠心病的危險因素，經(jīng)Logistic回歸分析依次校正年齡、性別等因素后發(fā)現(xiàn)仍無明顯相關(guān)，G等位基因不是2型糖尿病合并冠心病發(fā)病的危險因素。

但因本研究樣本例數(shù)較少，不能排除抽樣誤差的影響，各組年齡和性別比例差異較大及臨床干預(yù)措施等都可能是影響研究結(jié)果的因素。由于2型糖尿病本身是一種多因素、與多種基因相關(guān)的疾病，而TRIB1作用的確切機(jī)制尚不十分清楚，且不同國家地區(qū)不同人群種族間rs2235110多態(tài)性分布有顯著差異，因此有關(guān)TRIB1 rs2235110多態(tài)性在中國北方漢族人2型糖尿病及2型糖尿病合并冠心病中所起的作用尚需從遺傳因素和環(huán)境因素等方面綜合考慮做出更加完善的設(shè)計和更大樣本量的深入研究，以待得出更可靠的結(jié)論。

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3Willer CJ，Sanna S，Jackson AU，et al．Newly identified loci that influence lipid concentrations and risk of coronary artery disease［J］．Nat Genet，2008，40(2):161－169

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6Burkhardt R，Toh SA，Lagor WR，et al．Trib1 is a lipid－and myocardial infarction－associated gene that regulates hepatic lipogenesis and VLDL production in mice［J］．J Clin Invest，2010，120(12): 4410－4441

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(收稿:2012－02－24)

(修回:2012－06－19)

Relationship between TRIB1 Gene rs2235110 Polymorphisms and Type 2 Diabetes Mellitus with Coronary Heart Disease in Han Nationality from Northern China．

Shi Shenghe，Li Lin，Yan Shengkai，Yang Hui，Jia Liting，Xia Liangyu，Cheng Xinqi．Department of Laboratory Medicine，Beijing Capital International Airport Hospital，Beijing 100621，China;Department of Laboratory Medicine，The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Henan 450052，China

ObjectiveTo explore the interaction between TRIB1 gene rs2235110 polymorphisms and some classic risk factors in patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM)and T2DM combined with coronary heart disease(CHD)in Han nationality from northern China．MethodsGenotypes of TRIB1 gene rs2235110 polymorphisms were analyzed by using polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism(PCR－RFLP)in 147 unrelated healthy individuals，97 patients of T2DM，and 75 patients of T2DM with CHD(DM+CHD)．The association of TRIB1 gene rs2235110 polymorphisms SNP with levels of hemoglobin A1c(HbA1c)，serum lipids，and glucose(Glu)was also assessed．ResultsThe genotype frequencies of AA，AG，GG were 0．351，0．483，0．116，respectively．The allele frequencies of A and G were 0．592，0．408，respectively．There was significant difference in the frequencies of genotypes or alleles of TRIB1 rs2235110 polymorphisms between Han Chinese and other people from different countries and areas(P＜0.001)．Neither the frequencies of genotypes nor frequencies of alleles of TRIB1 gene rs2235110 polymorphisms was statistically different among DM patients，DM+CHD patients and controls(P＞0．05)．In the control and DM+CHD group，levels of high density lipoprotein cholesterol(HDL－C)of G allele gene carriers were statistically lower than those of AA genotype(P＜0．05)．In the DM group，low density lipoprotein cholesterol(LDL－C)levels of G allele gene carriers were statistically lower than those of AA genotype(P＜0．05)．Logistic regression analysis showed that G allele was not the risk factor for T2DM with CHD(95%CI:0．579－2．552，OR=1．216，P=0．605)．ConclusionThe rs2235110 polymorphisms of TRIB1 gene showed no significant correlation with T2DM，and T2DM combined CHD．The rs2235110 polymorphisms of TRIB1 gene may not be the genetic risk factor of T2DM with CHD in Han nationality from Northern China．

TRIB1;Polymorphisms;Diabetes mellitus;Coronary heart disease;PCR－RFLP

人力資源和社會保障部2008年度留學(xué)人員科技活動項目擇優(yōu)資助經(jīng)費(fèi)(啟動類項目)及衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院科研基金資助項目(20080616)

100621北京首都國際機(jī)場醫(yī)院檢驗科(石生河);450052鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科(李琳、賈莉婷);100029北京，衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院檢驗科(鄢盛愷、楊輝);100730中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科(夏良裕、程歆琦)(注:石生河和李琳為共同第一作者)

鄢盛愷，電子信箱:yanshengkai@sina．com